玉米中絨氈層發(fā)育調(diào)控基因ZmUdt1克隆的生物信息學(xué)分析

高 嵩，呂慶雪，何 歡，張建新，張志軍，宋廣樹，劉 偉

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林省吉東種業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 遼源 136299)

ZmUdt1基因編碼的核蛋白具有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，調(diào)控著花藥絨氈層早期的細(xì)胞減數(shù)分裂，在減數(shù)分裂前期，突變體的花藥壁和小孢子母細(xì)胞是正常的；減數(shù)分裂期，絨氈層向著藥室內(nèi)擠壓，同時(shí)絨氈層肥大液泡化并且不能分化；突變體的小孢子母細(xì)胞，由于四分體時(shí)期胼胝質(zhì)形成不完善，使得小孢子母細(xì)胞向小孢子的發(fā)育不正常，因而不能完成減數(shù)分裂而降解，以至于中間層細(xì)胞退化，花粉囊內(nèi)花粉無法正常形成，最終導(dǎo)致完全雄性不育[1-2]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的主要作用在于對(duì)某些重要基因參與絨氈層和小孢子母細(xì)胞的分化，以及在中間層細(xì)胞的退化中起著調(diào)控作用，這意味著ZmUdt1蛋白可能屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子[3]。

具有分泌功能的絨氈層為花粉囊周圍的特殊細(xì)胞層，對(duì)植物的花粉發(fā)育過程有著非常重要的影響。絨氈層與配子體是直接相連的，位于四層孢子體細(xì)胞的最內(nèi)層，主要來自于前期細(xì)胞層的孢原細(xì)胞層的連接組織[4]。絨氈層細(xì)胞在花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂前期進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂，形成雙核或多核結(jié)構(gòu)，RNA和蛋白質(zhì)含量較多，花粉粒發(fā)育所需養(yǎng)料由細(xì)胞內(nèi)油脂和類胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供[5-6]。絨氈層發(fā)育的正常與否對(duì)雄性不育或敗育的發(fā)生影響十分明顯。1993年，Goldberg 等[7-8]通過使用細(xì)胞霉素基因在絨氈層中的特異表達(dá)，導(dǎo)致絨氈層消失，使得小孢子在早期就已經(jīng)凋亡，這一試驗(yàn)證明了絨氈層在花粉發(fā)育過程中不可被替代的作用。

由于環(huán)境驟變或基因突變而導(dǎo)致雄性不育，雖然是植物本身發(fā)育的不良進(jìn)化現(xiàn)象，但是對(duì)于植物新品種的選育，尤其在雜交育種上卻有十分重要的意義[3]。在實(shí)際的糧食生產(chǎn)中，雄性不育現(xiàn)象在玉米、水稻、小麥等高等作物中普遍存在，但大部分玉米不育系并不完全，雜交種中混有大量的自交系種子，使種子質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。而雄性不育系則是保證雜交種純度、降低種子生產(chǎn)成本的良好材料[3]。ZmUdt1蛋白廣泛存在于植物體中，ZmUdt1 的變異影響植物的雄性不育，該基因在水稻中有著深入的研究，在玉米中尚未見報(bào)道。

筆者以水稻ZmUdt1 蛋白質(zhì)氨基酸序列同源克隆玉米中類似的基因BT068494.1(GenBank)，并利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件及知識(shí)分析預(yù)測(cè)該蛋白的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)等，旨在為后期克隆該基因和功能鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以水稻OsUdt1(NCBI GenBank：AY953870.1)核苷酸以及蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，利用NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)Blast玉米的相關(guān)序列，得到與其高度相似的蛋白序列。

1.2 試驗(yàn)方法

使用在線軟件ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/protaparam/) 預(yù)測(cè)分析目的基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(包括蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨酸組成、原子組成、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等)；使用在線軟件ExPASy-ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)目的基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析；使用在線軟件 NPS@：SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)目的基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用在線軟件PHYRE2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對(duì)目的基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析；通過在線軟件WoLF PSORT：(https：//wolfpsort.hgc.jp/)、TargetP 1.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、iPSORT (http://ipsort.hgc.jp/)對(duì)目的基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用在線軟件SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)目的基因進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；使用在線軟件 TMHMM Server，v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；使 用 在 線 軟 件 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析目的基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)目的基因進(jìn)行磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)；ProtFun 2.2 Server(http://cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)對(duì)目的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用MEGA 7.0程序計(jì)算物種間的遺傳距離，并通過鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmUdt1序列的獲得

以水稻OsUdt1(AY953870.1)為參考序列，在NCBI BlastN中使用同源克隆的方法，在玉米基因組中得到蛋白同源性最高的基因BT068494.1(GenBank)位于玉米第2號(hào)染色體中，命名為ZmUdt1基因。

2.2 蛋白理化性質(zhì)的分析及一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線工具ExPASy提供的ProtParam工具預(yù)測(cè)玉米ZmUdt1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)[9]，結(jié)果如表1所示，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為 74.23，大于 40，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為-0.497，初步判斷該基因?yàn)橛H水性蛋白。由圖1可知，該氨基酸序列第71位峰值最高，為2.000，第32位和第33位峰值最低，為-3.200，且峰值分布在0以下比分布在0以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。由圖2可知，玉米ZmUdt1氨基酸組成中，含量最高的為Glu(11.4%)，含量最低的為Pyl和Sec(0.0%)。

表1 ZmUdt1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.1 Predicting primary structure of ZmUdt1 protein

圖1 ZmUdt1蛋白疏水性預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of the ZmUdt1 protein hydrophobicity

2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過NPS@：SOPMA在線軟件分析玉米ZmUdt1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米ZmUdt1蛋白主要由4種構(gòu)象組成，其中，α-螺旋(Hh)比例最高，有99個(gè)氨基酸，占整體的45.21%；其次是無規(guī)則卷曲(Cc)，由69個(gè)氨基酸構(gòu)成，占整體的31.51%；延伸鏈(Ee)和β-轉(zhuǎn)角(Tt)比例較少，分別含有38，13個(gè)氨基酸，占整體的17.35%和5.94%(圖3)。

通過在線軟件Phyre 2，依據(jù)同源建模理論預(yù)測(cè)玉米ZmUdt1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[11]，如圖4所示。以在PDB晶體庫中與玉米ZmUdt1蛋白可信度達(dá)到99.5%的c5gnjI(PDB id)作為模板，預(yù)測(cè)玉米ZmUdt1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。玉米ZmUdt1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是由2個(gè)α-螺旋通過β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等連接形成的條形結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，且與水稻OsUdt1蛋白結(jié)構(gòu)基本相同。

圖2 ZmUdt1的氨基酸組成及含量預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted the amino acid composition and content in ZmUdt1

藍(lán)色.α-螺旋；玫紅色.無規(guī)則卷曲；紅色.延伸鏈；綠色.β-轉(zhuǎn)角。Blue.Alpha helix;Rose red.Random coil;Red.Extended strand;Green.Beta turn.

A.玉米；B.水稻。玫紅色.α-螺旋；藍(lán)色.β-轉(zhuǎn)角；白色.其他殘基。A.Zea mays; B.Oryza sativa.Rose red.Alpha helix;Blue.Beta turn;White.Other residues.

2.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

該基因的蛋白質(zhì)需要在細(xì)胞中處在特定的位置才能充分發(fā)揮其特定功能，因此，確定該蛋白基因在細(xì)胞中的位置，在一定程度上可以確定該蛋白基因的功能。通過在線軟件TargetP 1.1Server預(yù)測(cè)玉米ZmUdt1蛋白的分布位置，位于其他細(xì)胞器的可能性較大，不是分泌蛋白(表2)。

利用WoLF PSORT Prediction 預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位情況可知，細(xì)胞核定位系數(shù)為6(nucl：6)，葉綠體定位系數(shù)為5(chlo：5)，質(zhì)粒定位系數(shù)為2(plas：2)，線粒體定位系數(shù)為1(mito：1)。使用iPSORT在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示，該蛋白不在葉綠體或線粒體中。綜上推測(cè)，玉米ZmUdt1蛋白位于細(xì)胞核的可能性較大。

2.5 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

使用SignalP 4.1對(duì)玉米ZmUdt1編碼產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)肽分析，得到C、Y、S的值分別為0.109，0.114，0.158。一個(gè)典型的信號(hào)肽，C值和Y值應(yīng)趨向于+1，S值在剪切位點(diǎn)前后應(yīng)該先上升后下降，如圖6所示，可以判斷，ZmUdt1蛋白沒有信號(hào)肽。

利用iPSORT在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，沒有任何信號(hào)，也沒有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和線粒體靶向肽，與SignalP 4.1分析結(jié)果一致。

2.6 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

分析跨膜蛋白的功能不僅可以了解特定生物膜的功能，而且有助于分離與這些功能相關(guān)的分子組分，同時(shí)能夠進(jìn)一步確定蛋白的定位與功能[12-13]，通過TMHMM Server v 2.0進(jìn)行該蛋白跨膜性預(yù)測(cè)分析，玉米ZmUdt1蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，全部在膜外，與水稻OsUdt1蛋白相同(圖7)。

表2 ZmUdt1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Tab.2 Subcellular location of ZmUdt1 protein

圖5 ZmUdt1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)分布Fig.5 Distribution map of subcellular localization of ZmUdt1 protein

圖6 ZmUdt1編碼產(chǎn)物信號(hào)肽的曲線Fig.6 Figure of signal peptide of maize ZmUdt1 coding product

2.7 蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用SMART分析玉米ZmUdt1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，分布在26-43位的氨基酸為低成分復(fù)雜區(qū)域，分布在53-102位的氨基酸是螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)結(jié)構(gòu)域，且不具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)，與TMHMM分析結(jié)果一致。

同時(shí)使用NCBI在線預(yù)測(cè)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域(圖9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)超級(jí)家族，位于54-100位氨基酸之間，分析結(jié)果與SMART結(jié)果基本一致。玉米ZmUdt1蛋白與水稻OsUdt1蛋白同屬于HLH超級(jí)家族。

2.8 磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

磷酸化修飾具有重要作用，它能夠改變、調(diào)控酶活性，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作，蛋白質(zhì)與DNA/RNA 互作以及穩(wěn)定蛋白質(zhì)，例如，細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、分化、分裂等都與蛋白質(zhì)的磷酸化有關(guān)[14-15]。

A.玉米；B.水稻。圖8-9同。A.Zea mays; B.Oryza sativa.The same as Fig.8-9.

粉色.低成分復(fù)雜區(qū)域；紫色.功能結(jié)構(gòu)域。Rose red.Low complexity domains;Purple.Functional domains.

圖9 NCBI對(duì)玉米ZmUdt1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.9 The conservative domain prediction of ZmUdt1 protein by NCBI

預(yù)測(cè)結(jié)果如圖10所示，玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位點(diǎn)共有17個(gè)，其中，Ser 12個(gè)(Ser 9、Ser 10、Ser 50、Ser 81、Ser 84、Ser 87、Ser 120、Ser 122、Ser 124、Ser 126 、Ser 170和Ser 211)，Thr 3個(gè)(Thr 7、Thr 85和Thr 128)，Tyr 2個(gè)(Tyr 135和Tyr 184)。磷酸化過程是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)過程，由相應(yīng)的激酶和磷酸酶分別催化磷酸化過程和去磷酸化過程[16]。可逆磷酸化修飾在花藥發(fā)育過程中起著十分重要的作用[17]。

2.9 蛋白功能預(yù)測(cè)

通過對(duì)該蛋白功能的預(yù)測(cè)，進(jìn)一步確定該基因的功能作用，使用ProtFun 2.2蛋白功能結(jié)構(gòu)分類軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)[18]，從表3可以看出，其轉(zhuǎn)錄功能概率較大，推測(cè)其可能是轉(zhuǎn)錄因子。

圖10 玉米ZmUdt1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig．10 The phosphorylation sites prediction of ZmUdt1 protein

功能分類Functionalcategory概率Probability功能分類Functionalcategory概率Probability翻譯0.235信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)0.071TranslationSignaltransducer復(fù)制和轉(zhuǎn)錄0.320轉(zhuǎn)錄0.329ReplicationandtranscriptionTranscription調(diào)控功能0.228轉(zhuǎn)錄調(diào)控0.137RegulatoryfunctionsTranscriptionregulation

2.10系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以玉米ZmUdt1序列為探針，在NCBI上查詢各物種相關(guān)序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmUdt1和DYT1蛋白相似度較高[19-21]，使用MEGA 7.0軟件，構(gòu)建了12個(gè)物種的ZmUdt1和DYT1系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖11可知，玉米與水稻、高粱等物種遺傳距離最近，它們首先聚為一支后再與海藻、芭蕉等聚在一起，與擬南芥的DYT1蛋白也有一定的遺傳相關(guān)性。

3 討論

玉米ZmUdt1蛋白是HLH超級(jí)家族，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[22]，對(duì)不育基因起到一定的調(diào)控作用，研究該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能在培育花粉不育的玉米新品種中有著重要的理論意義[23]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ZmUdt1蛋白表現(xiàn)為親水性，是可溶性蛋白質(zhì)；通過亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，該基因編碼產(chǎn)物位于細(xì)胞核的可能性較大，沒有信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)，其編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成，在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)作用；通過預(yù)測(cè)，該蛋白具有翻譯、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，具有17個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，可逆磷酸化修飾在花藥發(fā)育過程中起著十分重要的作用，為進(jìn)一步證明該蛋白是控制絨氈層形成的轉(zhuǎn)錄因子提供了依據(jù)，而對(duì)于其他幾種功能尚未確定。

圖11 ZmUdt1蛋白與其他生物ZmUdt1和DYT1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree of ZmUdt1 protein and other biological ZmUdt1 and DYT1 proteins

由于Udt1基因相關(guān)的研究報(bào)道較少，通過比較以及相關(guān)數(shù)據(jù)分析，Udt1與DYT1蛋白的相似性極高且有一定的遺傳相關(guān)性。DYT1蛋白是絨氈層發(fā)育中期表達(dá)的bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DYT1在花藥發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平上的表達(dá)上可能存在差異，可能與RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾有關(guān)[2]；轉(zhuǎn)錄因子DYT1對(duì)中層細(xì)胞的退化可能不是關(guān)鍵影響因子，但對(duì)完成中層細(xì)胞的退化可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]；DYT1和TDF1以及位于其下游的AMS、MS188、MS1和TEK 這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠形成2條遺傳通路來控制絨氈層的發(fā)育：“DYT1→TDF1→AMS→MS188→MS1”控制花粉外壁外層的形成[25]， “DYT1→TDF1→AMS→TEK”控制花粉外壁內(nèi)層的形成[26]。DYT1與水稻中的OsUdt1基因高度同源[27-28]，因此，通過了解DYT1基因及水稻OsUdt1基因功能推測(cè)玉米中ZmUdt1基因的相關(guān)功能，二者同屬bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼產(chǎn)物在花藥發(fā)育早期表達(dá)，調(diào)節(jié)花粉發(fā)育相關(guān)的基因，突變體在減數(shù)分裂時(shí)期，絨氈層發(fā)生不正常的空泡化，花粉母細(xì)胞不分裂為小孢子，逐漸解體，造成雄性不育[29-30]。絨氈層發(fā)育過程并非獨(dú)立的過程，受到各個(gè)基因共同調(diào)控的作用與結(jié)果，其中任何一個(gè)基因的影響都可能引起花粉不育，ZmUdt1只是其中的一個(gè)，隨著不斷地深入研究，會(huì)發(fā)現(xiàn)更多影響不育的基因，從而創(chuàng)造人工玉米不育系新品種，提高品種純度，縮短育種周期。

玉米ZmUdt1蛋白在植株中實(shí)際的功能表達(dá)，還需要具體的分子生物學(xué)試驗(yàn)及田間表現(xiàn)來驗(yàn)證。為了保證預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，盡量減少誤差，各類數(shù)據(jù)均采用了多種不同軟件進(jìn)行分析，所使用的原理和算法各有不同，但結(jié)果基本一致。因此，本研究預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高可信度。但由于生物信息學(xué)是根據(jù)已知的信息預(yù)測(cè)未知的結(jié)果，所以還有很大的局限性和不確定性。進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能，還需通過具體生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)為玉米ZmUdt1的性質(zhì)與功能提供了一定的理論依據(jù)，為后續(xù)研究ZmUdt1基因在玉米中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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