生物炭不同施用量對煙草根際土壤微生物多樣性的影響

陳澤斌，高 熹，王定斌，郭麗紅，王定康，徐勝光

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.宣威市阿都鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 宣威 655425；4.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 昆明 650214；5.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214)

生物炭(Biochar)是農(nóng)作物秸稈、木質(zhì)物質(zhì)、禽畜糞便或其他有機(jī)物料在低氧環(huán)境下，經(jīng)過高溫(300～700 ℃)熱解的一種具有較高表面積、孔隙度、吸附性和穩(wěn)定性高的富含碳材料[1]。生物炭作為一種新型的碳材料引起了廣泛的關(guān)注，主要是由于其在改良土壤、降低溫室氣體排放、環(huán)境生態(tài)修復(fù)等方面都有潛在的應(yīng)用，為解決全球氣候變化、環(huán)境污染等對農(nóng)田的影響，提供了新的思路[2]。根際微生物指生活在植物根系土壤中的細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物，它們的數(shù)量是根際外微生物數(shù)量的幾倍或幾十倍，它們與植物根系相互作用，相互促進(jìn)[3]。微生物聚集在根系周圍，將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無機(jī)物質(zhì)，為植物提供有效的營養(yǎng)，同時，微生物也能分泌維生素、生長促進(jìn)劑等，促進(jìn)植物生長。在植物生長中，死亡和掉落的根系，以及從根部分泌的無機(jī)和有機(jī)化合物是微生物的營養(yǎng)和能量的重要來源[4]。近年來，生物炭在不同作物上的應(yīng)用研究已有很多報道，李航等[5]采用盆栽培養(yǎng)香蕉小苗，以生物炭與土壤的不同比例混合作為培養(yǎng)基質(zhì)，采用稀釋平板菌落計數(shù)法測定微生物數(shù)量，采用Biolog-ECO技術(shù)分析香蕉苗根際土壤微生物群落，發(fā)現(xiàn)生物炭的施加能夠明顯增加土壤中微生物數(shù)量。Biolog-ECO分析得出，生物炭的施加提高了微生物群落平均顏色變化率、多樣性指數(shù)和炭源利用豐度。韓光明等[6]建立了3個生物炭濃度梯度，以此探討生物炭對根際土壤微生物和土壤物理化學(xué)性質(zhì)的影響，研究設(shè)施菠菜土壤添加生物炭處理后根際微生物的變化，研究發(fā)現(xiàn)生物炭可以作為改善設(shè)施土壤理化性質(zhì)及板結(jié)程度的改良劑。孫大荃等[7]設(shè)置5個生物炭梯度，分別在大豆的不同生長期測定土壤微生物數(shù)量、pH值和田間持水量的動態(tài)變化，并觀察微生物在炭粒與土粒中的分布情況。結(jié)果表明，生物炭能提高大豆根際土壤中細(xì)菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)生物炭可成為緩解大豆連作障礙的土壤改良劑。毛家偉等[8]為探討豫東煙區(qū)生物炭的合理利用方法，通過大田小區(qū)試驗，研究生物炭對烤煙生長發(fā)育及經(jīng)濟(jì)性狀的影響。結(jié)果表明，施用生物炭能促進(jìn)煙株生長，提高煙株各項農(nóng)藝性狀指標(biāo)，降低病毒病和赤星病發(fā)病率及病情指數(shù)。葉協(xié)鋒等[9]以云煙97為對象，通過大田試驗，研究花生殼生物炭不同用量對植煙土壤碳庫及烤后煙葉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，適量添加生物炭可以改善烤后煙葉單料煙評吸質(zhì)量。湛方棟等[10]選擇貴州省3種典型的植煙土壤為對象，研究烤煙根際微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化。得出烤煙根際微生物的種群多樣性及其變化在不同土壤中表現(xiàn)也不一樣，相對于黃壤和黃色石灰土，在中性紫色土壤中，根際微生物中占主導(dǎo)的種群數(shù)量較多，根際細(xì)菌和放線菌的數(shù)量則更為多樣化和穩(wěn)定。趙秋芳等[11]采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗，研究施用生物炭對香草蘭生長和根際土壤微生物的影響。試驗共設(shè)5個處理，發(fā)現(xiàn)施用生物炭促進(jìn)了香草蘭植株地上部和根系的生長。通過在香草蘭的土壤中加入生物炭，增加了香草蘭土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，用生物炭處理的根瘤菌數(shù)量顯著減少。而目前關(guān)于生物炭不同施用量對煙草根際土壤微生物多樣性影響的研究尚未見報道。為此本研究應(yīng)用新一代高通量測序技術(shù)直接測序土壤DNA中16S rDNA-V4區(qū)和ITS2區(qū)基因的PCR產(chǎn)物，每次分析獲得的基因序列數(shù)以萬計，相較于第一代Sanger測序，它可以直接對混合物進(jìn)行測序，因此，不需要建立一個克隆群體；與傳統(tǒng)的方法相比，它的通量很高，可以節(jié)約98%以上的時間[12]。能更準(zhǔn)確的剖析施用生物炭后煙草根際土壤中細(xì)菌、真菌菌落結(jié)構(gòu)的變化，以期找出生物炭對煙草根際微環(huán)境的影響方式以及作用規(guī)律，為深入研究生物炭在煙田的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

2016年4月于云南省宣威市落水鎮(zhèn)健康煙田進(jìn)行大田試驗，土壤類型為紅壤，土壤養(yǎng)分情況為pH值6.1，速效氮106.6 mg/kg，速效磷12.8 mg/kg，速效鉀90.0 mg/kg，烤煙品種為云煙87，試驗所用生物炭由云南威鑫農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn)，由花生殼炭化而來。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)4個處理，每處理50棵烤煙，每處理3次重復(fù)，t1.1處理(CK)為煙草專用復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=10∶12∶24)；t4.1處理為煙草專用復(fù)合肥+生物炭50 g/棵；t5.1處理為煙草專用復(fù)合肥+生物炭100 g/棵；t6.1處理煙草專用復(fù)合肥+生物炭150 g/棵，生物炭施用量根據(jù)遼寧生物炭工程技術(shù)研究中心韓光明等[6]的研究設(shè)計而來，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)30 m2?？緹熞圃郧皩⑸锾颗c基肥在塘內(nèi)混勻，一次性施用。常規(guī)施肥及其他田間管理參照當(dāng)?shù)卦耘嘁?guī)范進(jìn)行。每處理隨機(jī)選取30株成熟期健康烤煙，挖出根系，用抖根法采集附著在根際表面的土壤，混勻后為該處理的根際土壤樣品。

1.3 總DNA提取

參照Omega公司的D5625-01 Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒的步驟提取各根際土壤樣品DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查后，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

1.4 ITS2區(qū)及16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增

使用帶標(biāo)簽序列(Barcode)的ITS2區(qū)及16S rDNA-V4區(qū)特異引物3F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC

AAGG-3′)和4R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)

及515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用KOD-Plus-Neo高保真PCR酶進(jìn)行PCR，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，進(jìn)行MiSeq測序。

1.5 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控及分析

剔除標(biāo)簽序列(Barcode)和引物序列，用FLASH軟件[13]進(jìn)行序列拼接，經(jīng)Qiime軟件[14]過濾后得到的序列與Golddatabase數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，在用UCHIME軟件[15]去除嵌合體序列，得到有效序列。用Uparse軟件[16]在97%的相似性水平上劃分操作分類單元，代表序列用RDP classifier軟件[17]和GreenGene數(shù)據(jù)庫[18]進(jìn)行物種注釋，利用Mothur軟件作稀釋度曲線，計算文庫覆蓋率(Coverage)，Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)計算方法見參考文獻(xiàn)[13]。采用R語言分析繪制樣品OTUs的韋恩圖，通過Canoco軟件作PCA主成分分析顯示樣品間的差異，利用Fastunifrac軟件分析得到樣品間距離矩陣，繪制基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌的OTU豐度和α多樣性

各處理根際土壤樣品測得ITS2區(qū)及16S rDNA-V4區(qū)原始序列數(shù)、質(zhì)控序列數(shù)、有效序列數(shù)、OTU數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、覆蓋率見表1，2，覆蓋率為98.8%～99.8%，說明制備的MiSeq文庫覆蓋了土壤樣品中98.8%以上的細(xì)菌和真菌類群，庫容足夠大，能夠反映樣品中細(xì)菌和真菌的真實組成。OTUs豐度稀釋度曲線顯示(圖1，2)，隨著測序數(shù)量的上升，稀釋度曲線斜率逐漸下降，趨向平坦但未達(dá)到平臺期，說明測序數(shù)量足夠，能夠反映出樣品中的物種組成特征，但仍有小部分低豐度類群未被覆蓋。

4個根際土壤樣品中細(xì)菌的OTU豐度為2 398～2 757(表1)，大小依次為：t1.1t4.1>t5.1>t6.1，香農(nóng)指數(shù)為5.079～5.752，大小依次為：t1.1>t4.1>t5.1>t6.1。說明在生物炭50～150 g/棵施用范圍內(nèi)，隨著生物炭施用量的增加，根際土壤中真菌OTU豐度、物種豐度及均勻度隨之減少；說明在一定施用范圍內(nèi)，增加生物炭的施用量會降低根際土壤真菌種類的多樣性和分布的均勻程度。

表1 細(xì)菌OTU豐度和α多樣性Tab.1 Bacteria OTU abundance and alpha diversity index

表2 真菌OTU豐度和α多樣性Tab.2 Fungus OTU abundance and alpha diversity index

圖1 細(xì)菌OTUs豐度稀釋度曲線Fig.1 Dilution curve of bacteria OTUs abundance

圖2 真菌OTUs豐度稀釋度曲線Fig.2 Dilution curve of fungus OTUs abundance

2.2 細(xì)菌和真菌OTUs分布

各處理根際土壤樣品一共有10 437個細(xì)菌OTUs(圖3)，共有的OTUs為1 583個，只占OTUs總數(shù)的15.17%，說明施用生物炭處理對細(xì)菌OTU豐度的影響明顯。t1.1和t4.1樣品共有1 876個細(xì)菌OTUs，t1.1和t5.1樣品共有1 988個細(xì)菌OTUs，t1.1和t6.1樣品共有2 015個細(xì)菌OTUs，t4.1和t5.1處理共有2 020個細(xì)菌OTUs，t4.1和t6.1樣品共有2 057個細(xì)菌OTUs，t5.1和t6.1處理共有2 175個細(xì)菌OTUs，說明不同生物炭施用量處理間的細(xì)菌種類組成相似性>不施用生物炭對照處理與施用生物炭處理間的細(xì)菌種類組成相似性，且在生物炭50～150 g/棵施用范圍內(nèi)，隨著施用量的增加，不施用生物炭對照處理與施用生物炭處理間的細(xì)菌種類組成相似性逐漸增加，不同生物炭施用量處理間的細(xì)菌種類組成相似性也逐漸增加。

4個處理根際土壤樣品一共有2 326個真菌OTUs(圖4)，共有的OTUs為267個，只占OTUs總數(shù)的11.48%，說明施用生物炭處理以及不同施用量處理對真菌OTU豐度的影響明顯。t1.1和t4.1樣品共有460個真菌OTUs，t1.1和t5.1樣品共有372個真菌OTUs，t1.1和t6.1樣品共有367個真菌OTUs，t4.1和t5.1處理共有384個真菌OTUs，t4.1和t6.1樣品共有372個真菌OTUs，t5.1和t6.1處理共有359個真菌OTUs，說明不同生物炭施用量處理間的真菌種類組成相似性<不施用生物炭對照處理與施用生物炭處理間的真菌種類組成相似性，且在生物炭50～150 g/棵施用范圍內(nèi)，隨著施用量的增加，不施用生物炭對照處理與施用生物炭處理間的真菌種類組成相似性逐漸降低，不同生物炭施用量處理間的真菌種類組成相似性也逐漸降低。

圖3 細(xì)菌OTUs分布韋恩圖Fig.3 Venn graph of bacteria OTUs distribution

圖4 真菌OTUs分布韋恩圖Fig.4 Venn graph of fungus OTUs distribution

2.3 細(xì)菌群落種類組成及豐度

根據(jù)各OTU中代表序列的物種注釋結(jié)果，選取各處理根際土壤樣品中細(xì)菌和真菌在門(Phylum)和屬(Genus)分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度堆積柱形圖(圖5-8)。由圖5可知，4個處理根際土壤中細(xì)菌在門的分類水平上，最大豐度排名前10的種類為：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和奇古菌門(Thaumarchaeota)。進(jìn)一步分析處理間差異表明，施用生物炭的處理t4.1、t5.1、t6.1中的變形菌門細(xì)菌相比對照不施用生物炭的處理t1.1豐度稍有降低，分別降低了4.1%，2.7%，0.7%，在生物炭50～150 g/棵施用范圍內(nèi)，隨著施用量的增加，變形菌門細(xì)菌的豐度有略微上升的趨勢；施用生物炭的處理t4.1、t5.1、t6.1中的酸桿菌門細(xì)菌的豐度明顯高于對照處理t1.1，相比對照t1.1分別增加了10.4%，8.1%，7.7%，在生物炭50～150 g/棵施用范圍內(nèi)，隨著施用量的增加，酸桿菌門細(xì)菌的豐度有略微下降的趨勢；施用生物炭的處理t1.1、t5.1、t6.1中的放線菌門細(xì)菌的豐度均低于對照處理t1.1，4個處理間豐度差異甚微；施用生物炭的處理t1.1、t5.1、t6.1中的藍(lán)菌門細(xì)菌的豐度明顯低于對照處理t1.1，相比對照處理t1.1分別降低了11.4%，11.4%，11.2%；4個處理間的芽單胞菌門細(xì)菌豐度差異甚微。

從屬的分類水平來看(圖6)，變形菌門細(xì)菌序列主要分布于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，29.5%)、Pseudoduganella(4.38%)和Haliangium(6.56%)，此外還有部分序列分布于植物線粒體(Unidentified_Mitochondria，4.26%)；酸桿菌門細(xì)菌序列主要分布于Gaiella(9.67%)、Solirubrobacter(5.25%)和芽球菌屬(Blastococcus，7.94%)；藍(lán)菌門細(xì)菌序列主要分布于植物葉綠體(Unidentified_Chloroplast，20.34%)；芽單胞菌門細(xì)菌序列主要分布于芽單胞菌屬細(xì)菌(Gemmatimonas，6.79%)。

圖5 門水平上的細(xì)菌相對豐度柱形圖Fig.5 The relative abundance of bacteria in phylum level

圖6 屬水平上的細(xì)菌相對豐度柱形圖Fig.6 The relative abundance of bacteria in genus level

2.4 真菌群落種類組成及豐度

由圖7可知，4個處理根際土壤中真菌在門的分類水平上，最大豐度排名前5的為：接合菌門(Zygomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)。進(jìn)一步分析處理間差異表明，施用生物炭50 g/棵處理后(t4.1)，接合菌門真菌豐度比對照處理t1.1(50.92%)下降了12.38%，之后隨著t5.1、t6.1處理中生物炭施用量的提高，接合菌門真菌豐度逐漸上升至53.68%；與之相反，施用生物炭50 g/棵處理后(t4.1)，子囊菌門真菌豐度比對照處理t1.1(30.63%)升高了10.15%，之后隨著t5.1、t6.1處理中生物炭施用量的提高，子囊菌門真菌豐度逐漸下降至29.11%；施用生物炭50 g/棵處理后(t4.1)，擔(dān)子菌門和壺菌門真菌豐度基本不變，之后隨著t5.1、t6.1處理中生物炭施用量的提高，擔(dān)子菌門真菌豐度呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢；各處理對球囊菌門真菌豐度影響不大。從屬的分類水平來看(圖8)，接合菌門真菌主要分布于被孢霉屬(Mortierella，53.68%)；子囊菌門真菌主要分布于青霉菌屬(Penicillium，3.03%)、嗜熱霉屬(Thermomyces，2.89%)、金孢子菌屬(Chrysosporium，2.48%)、棘殼孢屬(Pyrenochaeta，2.02%)等10個豐度為0.17%～3.03%的屬；擔(dān)子菌門真菌主要分布于隱球菌屬(Cryptococcus，27.27%)。

圖7 門水平上的真菌相對豐度柱形圖Fig.7 The relative abundance of fungus in phylum level

2.5 細(xì)菌群落組成的PCA聚類分析及豐度UPGMA聚類分析

PCA主成分分析表明(圖9)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對樣品差異性的解釋度分別為36.86%和33.09%，合計為69.95%?？傮w看來，t1.1在PC2的正半軸，t4.1、t5.1、t6.1在PC2的負(fù)半軸，說明不施用生物炭的對照處理(t1.1)與施用生物炭的處理(t4.1、t5.1、t6.1)的細(xì)菌物種組成有明顯差異；t4.1和t6.1樣品均在PC1的正半軸和PC2的負(fù)半軸，且距離很近，而t5.1樣品位于PC1的負(fù)值區(qū)，說明在施用生物炭處理的3個樣品中，t4.1和t6.1樣品的細(xì)菌物種組成更為相似。UPGMA聚類分析表明(圖10)，施用生物炭處理(t4.1、t5.1、t6.1)的各菌群豐度與不施用生物炭對照處理(t1.1)的各菌群豐度被聚類為2個分支，說明施用生物炭后各菌群豐度發(fā)生了明顯變化；t4.1和t6.1處理被聚為1個分支，說明施用生物炭50 g/棵處理與150 g/棵處理的菌群豐度相似性較100 g/棵處理更高。

圖8 屬水平上的真菌相對豐度柱形圖Fig.8 The relative abundance of fungus in genus level

圖9 細(xì)菌群落的PCA聚類分析Fig.9 PCA cluster analysis of bacterial community

圖10 門水平上的細(xì)菌相對豐度聚類樹Fig.10 Cluster analysis of bacteria relative abundance in phylum level

2.6 真菌群落組成的PCA聚類分析及豐度UPGMA聚類分析

PCA主成分分析表明(圖11)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對樣品差異性的解釋度分別為39.48%和31.85%，合計為71.33%。總體看來，t1.1和t6.1都在PC2的正半軸，t1.1和t4.1都在PC1的正半軸，而t1.1和t5.1分別在PC1和PC2的正負(fù)半軸，說明不施用生物炭的對照處理(t1.1)的真菌物種組成相比100 g/棵處理與施用生物炭150，50 g/棵處理更為相似；t4.1、t5.1和t6.1間距離較遠(yuǎn)，說明不同生物炭施用量處理間真菌物種組成差異大。UPGMA聚類分析表明(圖12)，施用生物炭的處理t6.1與不施用生物炭的對照處理t1.1聚為1個分支，說明施用生物炭150 g/棵處理的各菌群豐度與不施用生物炭的處理t1.1相似；t4.1和t5.1各自被聚為1個分支，且t4.1距離t1.1和t6.1的分支更近，說明施用生物炭50 g/棵處理相比100 g/棵處理來說，與150 g/棵處理及對照處理中各菌群豐度更為相似。

圖11 真菌群落組成的PCA聚類分析Fig.11 PCA cluster analysis of fungal community

圖12 門水平上的真菌相對豐度聚類樹Fig.12 Cluster analysis of fungus relative abundance in phylum level

3 討論

已有研究表明[19]，當(dāng)草食動物胃腸道微生物的高通量測序量達(dá)到1 700～20 000條，就足夠覆蓋樣本中所有的微生物菌群，本研究中，土壤樣品中細(xì)菌和真菌的OTUs豐度稀釋度曲線仍未達(dá)到平臺期，說明仍有小部分低豐度類群未被覆蓋。由此表明，土壤菌群多樣性比草食動物胃腸道菌群多樣性高。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，增加生物炭的施用量提高了根際土壤細(xì)菌種類的多樣性和分布的均勻程度，這和Graber等[20]的研究結(jié)果一致，這可能是由于生物炭的多孔性，為細(xì)菌在土壤中生長及繁殖提供了更多的空間，從而增加了細(xì)菌的數(shù)量，同時還調(diào)節(jié)了土壤環(huán)境的物理和化學(xué)性質(zhì)，影響和調(diào)節(jié)土壤微生物生長、發(fā)育和代謝，提高土壤肥力。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著生物炭施用量的增加，根際土壤中真菌OTU豐度、物種豐度及均勻度隨之減少；說明在一定范圍內(nèi)，增加生物炭的施用量會降低根際土壤真菌種類的多樣性和分布的均勻程度。這與Van Zwieten等[21]的研究結(jié)果相一致，生物炭對細(xì)菌的增殖有促進(jìn)作用，使得細(xì)菌與真菌的比值增加，向“細(xì)菌型”土壤轉(zhuǎn)變，細(xì)菌型土壤普遍被認(rèn)為是土壤肥力提高的標(biāo)志[22]。土壤真菌種類多樣性的降低可能是由于細(xì)菌和真菌對pH值有不同的要求，細(xì)菌傾向于中性土壤，而真菌則偏愛酸性土壤，已有研究表明，生物炭能提高土壤pH值[23]。有研究表明，生物炭不僅可以提高土壤肥力和pH值，還可以通過影響土壤pH值來提高作物抗病性[24]，因為真菌被認(rèn)為是引起植物土傳病害的主要病原物[25]，從增加土壤pH值、降低真菌數(shù)量和提高細(xì)菌真菌數(shù)量的特性來看，生物炭也許能成為防治烤煙土傳病害的土壤添加劑[26]。PCA主成分分析表明，不施用生物炭的對照處理(t1.1)與施用生物炭的處理(t4.1、t5.1、t6.1)的細(xì)菌物種組成有明顯差異，這與Grossman等[27]的研究結(jié)果相一致，說明生物炭對微生物的群落分布具有一定的控制作用。

研究中發(fā)現(xiàn)樣品中變形菌門細(xì)菌中的一部分序列歸屬于與線粒體序列具有高度同源性的、未能確定細(xì)菌類群(Unidentified_Mitochondria，4.26%)，藍(lán)菌門細(xì)菌主要分布于與葉綠體序列具有高度同源性的、未能確定細(xì)菌類群(Unidentified_Chloroplast，20.34%)，這可能是由于采集根際土壤時，混入了部分根系凋落物，或是其他植物殘體所致。這與陳澤斌等[28]的研究相一致，出現(xiàn)了“宿主污染”現(xiàn)象，因為植物的葉綠體和線粒體與細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性。這也說明選取16S rDNA-V4區(qū)作為高通量測序區(qū)域的局限性，今后應(yīng)嘗試其他測序區(qū)域以避開葉綠體和線粒體的干擾。趙帥等[29]選取16S rDNA的V5～V7區(qū)作為高通量測序區(qū)，成功解析了鹽角草根部內(nèi)生菌多樣性，并沒有出現(xiàn)“宿主污染”現(xiàn)象。

研究中發(fā)現(xiàn)在屬的分類水平，其他(Other)類群相對豐度最高，說明根際土壤樣品中微生物種類十分豐富，但絕大多數(shù)微生物豐度低；其次還說明采用高通量測序手段對根際土壤微生物的檢測靈敏度很高，發(fā)現(xiàn)了很多低豐度的類群；也不排除是因為MiSeq測序讀長較短(500 bp左右)，從而無法將其注釋到屬的可能性，相信隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，能夠測定更長序列，從而在屬的水平上鑒定更多種類。

鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌對芳香化合物具有高代謝能力，是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型微生物資源[30]。研究表明，施用生物炭處理后，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的豐度稍有降低，可能是由于土壤中芳香化合物被生物炭吸附導(dǎo)致鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌缺乏自身代謝所需降解物引起的，這也進(jìn)一步證實了生物炭具有土壤修復(fù)作用。青霉菌屬真菌普遍被報道具有殺菌作用，研究發(fā)現(xiàn)施用生物炭處理后，青霉菌屬真菌豐度比對照處理t1.1明顯升高，該屬真菌豐度的提高，有助于殺滅根際土壤中的有害病原物，從而提高植物抗土傳病害的能力。研究中發(fā)現(xiàn)的其他屬：Pseudoduganella、Haliangium、金孢子菌屬、棘殼孢屬等微生物種類，目前有關(guān)其功能的研究尚未見報道，仍需要借助傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，獲取菌株實體，進(jìn)一步試驗驗證。

不施用生物炭的對照處理與施用生物炭的處理的細(xì)菌物種組成有明顯差異，在一定范圍內(nèi)，增加生物炭的施用量可提高根際土壤細(xì)菌種類的多樣性和分布的均勻程度，但會降低根際土壤真菌種類的多樣性和分布的均勻程度。施用生物炭處理后，變形菌門細(xì)菌豐度降低，酸桿菌門細(xì)菌的豐度上升，放線菌門細(xì)菌、藍(lán)菌門豐度下降，芽單胞菌門細(xì)菌豐度基本不變；接合菌門真菌呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，子囊菌門真菌豐度則呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，擔(dān)子菌門和壺菌門真菌豐度基本不變，但隨著生物炭施用量的提高，擔(dān)子菌門真菌豐度呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，各處理對球囊菌門真菌豐度影響不大。

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