苧麻微生物脫膠技術(shù)的研究進(jìn)展

楊琦，段盛文，彭源德

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙410205）

苧麻（Boehmeria nivea）是蕁麻科苧麻屬作物，其韌皮的單纖維長(zhǎng)、強(qiáng)度大、吸濕和散濕迅速、熱傳導(dǎo)性能優(yōu)良，是紡織行業(yè)的重要原料。我國(guó)是苧麻的主要產(chǎn)地，產(chǎn)量約占全世界的90%以上，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和國(guó)際影響力。然而，苧麻原麻中含有30%左右由果膠和半纖維素組成的鍵合型非纖維素物質(zhì)（俗稱“膠質(zhì)”），這些膠質(zhì)的存在會(huì)影響苧麻纖維的質(zhì)量，不能直接用于紡織［1］。脫膠是苧麻纖維用于紡織前的關(guān)鍵步驟，目前苧麻脫膠的方法有傳統(tǒng)漚麻法、化學(xué)脫膠法和生物脫膠法。傳統(tǒng)漚麻法污染大、耗時(shí)長(zhǎng)，已不適應(yīng)于工業(yè)化的生產(chǎn)。工業(yè)上常用的化學(xué)脫膠法高耗能、高污染，廢水中COD含量高，且該方法中的酸和堿對(duì)苧麻纖維的損壞較大［2］，嚴(yán)重制約了苧麻纖維加工行業(yè)的發(fā)展，高效環(huán)保節(jié)能的生物脫膠方式則改變了這一現(xiàn)狀。

苧麻生物脫膠有微生物脫膠和酶法脫膠兩種。酶法脫膠中的生物酶大多來源于好氧微生物，酶制劑的生產(chǎn)環(huán)境苛刻，成本較高，限制了生物酶的應(yīng)用和推廣［3］；且由于苧麻膠質(zhì)成分復(fù)雜，一種或幾種生物酶的脫膠能力有限，其脫膠效果也不易控制。微生物脫膠則是以苧麻的膠質(zhì)為主要培養(yǎng)基，在脫膠微生物的生長(zhǎng)繁殖過程中實(shí)現(xiàn)苧麻纖維的分離，具有節(jié)約成本、提高精干麻質(zhì)量、不損傷纖維和降低污染等優(yōu)點(diǎn)［1］。因此，微生物脫膠法可作為實(shí)現(xiàn)苧麻韌皮中非纖維素物質(zhì)剝離的優(yōu)選方法來使用。本文對(duì)微生物脫膠的機(jī)制，以及近年來的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了分析闡述，并展望了該領(lǐng)域未來的研究重點(diǎn)，以期為微生物脫膠技術(shù)在苧麻等草本纖維加工方面的應(yīng)用發(fā)展提供參考。

1 微生物脫膠機(jī)制

微生物對(duì)苧麻韌皮的脫膠作用（見圖1），其實(shí)質(zhì)為脫膠菌種在以膠質(zhì)為主要碳源的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，這一過程中所產(chǎn)生的胞外酶使得膠質(zhì)被酶解成可溶于水的小分子糖［4－5］，從而實(shí)現(xiàn)苧麻的脫膠。所產(chǎn)生的小分子糖則進(jìn)入微生物的菌體細(xì)胞內(nèi)，參與新陳代謝過程，并提供菌體生長(zhǎng)所需的能量，達(dá)到“膠養(yǎng)菌，菌產(chǎn)酶，酶脫膠”的目的［6］。脫膠菌株分泌降解膠質(zhì)的胞外酶主要是果膠酶與半纖維素酶，其中木聚糖酶在半纖維素酶中所占比例最大，生物脫膠中酶法脫膠便建立在對(duì)脫膠菌株胞外酶研究的基礎(chǔ)上。苧麻微生物脫膠的研究領(lǐng)域主要涉及3個(gè)方面：優(yōu)良脫膠菌種（群）的分離選育、脫膠菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化、以及脫膠工藝的優(yōu)化。

圖1 苧麻微生物脫膠的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism and research fields ofmicrobial degumming in ramie

2 脫膠菌株（群）的分離選育

性能優(yōu)良的脫膠菌種是微生物脫膠技術(shù)的基石，具有較強(qiáng)脫膠能力的微生物菌株來源大致有兩種途徑，分別為從自然環(huán)境中篩選野生型菌株以及在已有脫膠菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建工程菌。

2.1 脫膠菌株（群）的篩選

脫膠菌種的傳統(tǒng)分離策略是以單一碳源苧麻粉作為篩選條件［7］，從苧麻種植地［8］、腐爛苧麻韌皮［9］、天然漚麻池［10］和苧麻脫膠工廠附近土壤［11］等環(huán)境中獲得目標(biāo)菌種。利用傳統(tǒng)分離方法可獲得微生物菌株的純種，包括細(xì)菌和真菌等［9］。目前已報(bào)道的脫膠菌種中，細(xì)菌所占比例較大，其中大部分是芽孢桿菌屬（Bacillus），有短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）［12］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［10，13］和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）［14］等。具有脫膠能力的真菌主要是曲霉菌屬（Aspergillus），如黃曲霉（Aspergillus flavus）［15］和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）［16］等。生長(zhǎng)繁殖迅速的細(xì)菌能有效縮短苧麻微生物脫膠的周期，是挖掘優(yōu)良脫膠菌種的重要來源（見表1）。

表1 苧麻脫膠的常見微生物菌株Tab.1 Microbial strains for ramie degumming

研究［30］發(fā)現(xiàn)天然漚麻過程往往是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果，這引起了研究者對(duì)復(fù)合菌群在苧麻微生物脫膠過程中作用的重視。通過對(duì)溫水漚麻過程、苧麻種植園以及腐爛苧麻樣本中的微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)苧麻脫膠由多種微生物協(xié)同作用，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、豆科根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans），假單胞菌（Pseudomonas brassicacearum）、地衣芽孢桿菌（B．licheniformis）和短小芽孢桿菌（B．pumilus）等［30］。因此，構(gòu)建具有高效脫膠能力的復(fù)合菌群，可以豐富苧麻微生物脫膠的方法［31］。研究苧麻脫膠共生菌群中的優(yōu)勢(shì)菌株［32］，分析其群落結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)漚麻菌群中的8株可培養(yǎng)微生物中有4株蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），其余為枯草芽孢桿菌（B．subtilis）、厚壁菌門（Phylum Firmicutes）、假單胞菌（Pseudomonas）以及蘇云金桿菌（B．thuringiensis）［33］，故可進(jìn)一步改進(jìn)菌群結(jié)構(gòu)，以便提高脫膠效率，優(yōu)化微生物復(fù)合菌群的脫膠工藝。

2.2 高效脫膠工程菌株的構(gòu)建

由于野生型菌種的脫膠能力通常較低，不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，因此，構(gòu)建高效的脫膠工程菌株可促進(jìn)苧麻微生物脫膠的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。微生物菌種選育在生物脫膠中占有重要地位，是決定苧麻微生物脫膠是否具有工業(yè)化價(jià)值的關(guān)鍵［34］。目前，構(gòu)建高效脫膠工程菌的途徑主要有不定向誘變和基因定向改造兩種。不定向誘變大多是通過紫外線、亞硝酸或硫酸二乙酯對(duì)菌株或原生質(zhì)體進(jìn)行選育［24，35］，誘變的方式有單因素誘變和復(fù)合誘變［25，36］。經(jīng)過上述方法誘變選育的工程菌脫膠能力都有較大幅度的提高，對(duì)黑曲霉（A．niger）、地衣芽孢桿菌（B．licheniformis）等脫膠菌株進(jìn)行誘變選育后（部分菌株信息見表1），所獲得的工程菌其脫膠液中的果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶的酶活力均有一定程度的提高，纖維素酶活力有所降低，脫膠效果較出發(fā)菌株更優(yōu)［35－37］。

利用遺傳改造的方法定向構(gòu)建高效脫膠工程菌株（部分可用于脫膠的工程菌株信息見表1），可以解決原始菌株中胞外酶系不全或脫膠關(guān)鍵酶活力不高的問題。如通過構(gòu)建多順反子質(zhì)?？蓪?shí)現(xiàn)多種生物脫膠酶（果膠酶、木聚糖酶等）的共表達(dá)，利用所獲得的工程菌株pETpxm（91x）/DCE－01進(jìn)行苧麻脫膠，與原始菌株DCE－01相比，失重率、還原糖和COD值的指標(biāo)分別增加到22.5%、460 mg/mL和4.9，明顯提高了苧麻的脫膠效率［26］。從枯草芽孢桿菌（B．subtilis）中克隆木聚糖酶基因，將木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化果膠酶產(chǎn)生菌黑曲霉菌株An1（A．nigerAn1）后獲得的脫膠工程菌株，與原出發(fā)菌株相比，工程菌株的木聚糖酶活性提高2倍多，處理后苧麻的殘膠率下降55.18%［27］。

2.3 脫膠生物酶（酶系）高產(chǎn)菌株及酶穩(wěn)定性的研究

2.3.1 脫膠生物酶（酶系）的異源表達(dá)

采用基因工程的手段獲得高產(chǎn)脫膠酶（酶系）的工程菌株，可實(shí)現(xiàn)脫膠酶基因的異源表達(dá)，以提高目標(biāo)酶（酶系）的酶活力。將所獲得的工程菌株發(fā)酵后，富含高活力脫膠酶的發(fā)酵液用于酶法脫膠。參與苧麻生物脫膠的酶有果膠酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等，其中果膠酶被認(rèn)為是在脫膠過程中起主要作用的生物酶。目前，異源表達(dá)不同來源的果膠酶基因是提高果膠酶產(chǎn)量和活力的重要手段之一。為提高果膠酶產(chǎn)量，Liu等［19］將枯草芽孢桿菌TCCC11286（B．subtilis TCCC11286）中的果膠裂解酶在枯草芽孢桿菌 WB600（B．subtilisWB600）中進(jìn)行表達(dá)，果膠酶活力達(dá)445 U/mg。Zhang等［38］在畢赤酵母（Pichia pastoris）中異源表達(dá)來自枯草芽孢桿菌168菌株（B．subtilis strain 168）的果膠酶基因，外泌的果膠酶活性達(dá)1320 U/mg。此外，中科院微生物所馬延和課題組在提高果膠酶的酶活力方面做了大量工作，Zhou等［39］將嗜堿性地衣芽孢桿菌（B．licheniformis）中的果膠酶基因在大腸桿菌（Escherichia coli）內(nèi)實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，在高密度培養(yǎng)的條件下，酶活力達(dá)1450.1 U/mL。Li等［40］將來源于類芽孢桿菌（Paenibacillussp.0602）的果膠酶基因在大腸桿菌（E．coli）中進(jìn)行異源表達(dá)，酶活力達(dá)2467.4 U/mL。Zhou等［17］將克勞氏芽孢桿菌（B．clausii）中的堿性果膠酶基因在大腸桿菌（E．coli）中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，重組BacPelA基因的工程菌，果膠酶活力最高達(dá)8378.2 U/mL。異源表達(dá)在提高木聚糖酶和甘露聚糖酶等脫膠酶酶活力的研究方面也發(fā)揮了較大的作用。Huang等［10］在大腸桿菌（E．coli）中異源表達(dá)了枯草芽孢桿菌B10（B．subtilisstrain B10）中的木聚糖酶基因，該酶的外泌率提高到22.4%。Jalal等［41］將枯草芽孢桿菌R5（B．subtilisstrain R5）中的木聚糖酶基因在大腸桿菌（E．coli）中異源表達(dá)，木聚糖酶的穩(wěn)定性和酶活性均增強(qiáng)。Wang等［42］采用密碼子優(yōu)化的方式在畢赤酵母（P．pastoris）中表達(dá)耐堿耐熱的甘露聚糖酶，酶活達(dá)493.8 IU/mg。

2.3.2 脫膠酶（酶系）穩(wěn)定性的提高

此外，因?yàn)槊撃z酶的穩(wěn)定性是影響苧麻脫膠效果的重要因素，研究者也著立于通過基因工程手段提高酶的穩(wěn)定性。Zhou等［43］分析了來源于類芽孢桿菌（Paenibacillussp.0602）的果膠裂解酶晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)該酶進(jìn)行改造，使得其最適溫度從67.5℃降為60℃，更加適用于苧麻脫膠。Zhou等［18］優(yōu)化了來源于枯草芽孢桿菌（Bacillussp.strain N16－5）的果膠裂解酶，提高了該酶在苧麻脫膠過程中的熱穩(wěn)定性。Liang等［44］將來源于短小芽孢桿菌（B．pumilus）的熱穩(wěn)定性高的果膠裂解酶，在大腸桿菌（E．coli）中異源表達(dá)，利用進(jìn)化策略提高該脫膠酶的活性，采用定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變獲得果膠裂解酶M3，該酶的耐熱性和熱穩(wěn)定性較野生型酶顯著提高。

3 菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化

理論上，脫膠菌株經(jīng)適宜的發(fā)酵工藝進(jìn)行培養(yǎng)后，將以更優(yōu)的生理特性應(yīng)用于苧麻脫膠，目前對(duì)脫膠菌株發(fā)酵工藝的研究較少。在發(fā)酵技術(shù)方面，Zou等［45］通過分批補(bǔ)料發(fā)酵的方式顯著增加了枯草芽孢桿菌7－3－3（B．subtilis7－3－3）中的堿性果膠酶產(chǎn)量，果膠酶活力從最初的202.5 U/mL提高到743.5 U/mL。Basu等［46］研究了一種利用藻酸鈣固定化培養(yǎng)脫膠菌株短小芽孢桿菌DKS1（B．pumilusDKS1）的方法，采用固定化培養(yǎng)的脫膠菌株果膠酶的產(chǎn)量和酶活力分別提高到18 g/L和38.5 U/mL，比液體培養(yǎng)條件下高出1.5倍，應(yīng)用固定化培養(yǎng)模式下的B．pumilusDKS1進(jìn)行苧麻微生物脫膠，失重率達(dá)23%，效果與化學(xué)脫膠幾乎一致，且所獲得的纖維韌性增加了8%～11%。在培養(yǎng)基配方優(yōu)化方面，呂繼良等［8］優(yōu)化了脫膠優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及接種量等條件，脫膠菌株在接種量為5%、pH值為7.5、溫度為35℃、培養(yǎng)時(shí)間為36 h的條件下果膠酶活性達(dá)到305.62 U/mL，較優(yōu)化前提高了1倍，但未檢測(cè)該發(fā)酵條件下所獲得的脫膠菌株在苧麻微生物脫膠時(shí)的能力。黃芙蓉等［47］利用正交試驗(yàn)對(duì)脫膠菌株曲霉MCZ2（Aspergillus sp.MCZ2）發(fā)酵產(chǎn)果膠酶和半纖維素酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下果膠酶活最高可達(dá)到135.5 U/mL，半纖維素酶活為318.8 U/mL，比在未優(yōu)化條件下菌株產(chǎn)生的兩種酶活性分別提高了35.1%和68%。

4 微生物脫膠工藝優(yōu)化

苧麻微生物脫膠主要包括微生物脫膠工藝及微生物法與其他方法聯(lián)合脫膠工藝。其中微生物脫膠有單一微生物菌種脫膠工藝和復(fù)合微生物脫膠工藝兩類。聯(lián)合脫膠工藝的研究側(cè)重于微生物法與酶法聯(lián)合脫膠以及微生物法與化學(xué)法聯(lián)合脫膠等。

利用性能優(yōu)良的單一微生物菌種進(jìn)行苧麻脫膠的工藝研究相對(duì)較成熟，這可能與該工藝的可控性和可重復(fù)性較高有關(guān)。Liu等［28］分離到一株苧麻高效脫膠細(xì)菌果膠桿菌屬CXJZU－120，并基于該菌株研發(fā)了一套適用于工業(yè)化生產(chǎn)的脫膠工藝，將活化的細(xì)菌發(fā)酵液噴灑在苧麻韌皮上，6 h內(nèi)可完成脫膠，該工藝條件與工業(yè)上傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠方法相比，生產(chǎn)成本降低到20.5%，污染減少了80%以上，資源利用率提高了50%以上，顯示出微生物脫膠的顯著優(yōu)越性。此外，微生物脫膠工藝對(duì)苧麻單纖維具有一定的積極影響，如脫膠菌株8－1在39℃、菌液量體積比1∶40、靜置培養(yǎng)4 d后，苧麻膠質(zhì)去除率達(dá)到25.94%，且苧麻單纖維強(qiáng)力比化學(xué)脫膠提高43.45%，更有利于紡織［48］。

然而，由于單一菌株中參與膠質(zhì)降解的胞外酶種類不全或某一脫膠酶酶活力不高，會(huì)引起苧麻脫膠效果不佳。采用兩種及以上不同的菌株（群）進(jìn)行聯(lián)合脫膠，可實(shí)現(xiàn)協(xié)同互補(bǔ)，提高苧麻脫膠的效率和質(zhì)量［49－50］。不同類型脫膠菌株的接種比例是影響復(fù)合微生物脫膠效果的因素之一，研究者［1］將芽孢桿菌 B2（Bacillussp.B2）和曲霉 M2（Aspergillussp.M2）混合發(fā)酵，Bacillussp.B2和Aspergillussp.M2的種子液接種量分別為6%和11%，水料比為15∶1（mL/g），脫膠初始pH值為6，溫度為35℃，脫膠時(shí)間為50 h，此條件下處理后的苧麻纖維脫膠率可達(dá)到31.9%。在進(jìn)行混菌發(fā)酵的過程中，影響苧麻微生物脫膠效果的另一因素是不同脫膠菌種的接種順序和接種時(shí)間。將3株脫膠菌B3、B5和M1按此順序間隔12 h接種于含苧麻原麻的培養(yǎng)基中，35℃條件下脫膠60 h可使苧麻脫膠率達(dá)到29.9%［51］。因此，可將多種脫膠菌株制成脫膠菌液用于苧麻脫膠［52］，并以苧麻為唯一碳源和能源對(duì)復(fù)合菌群進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，馴化后的微生物復(fù)合菌群脫膠周期明顯縮短，纖維強(qiáng)度也逐漸提高［31］。

微生物脫膠可與其他方法聯(lián)合應(yīng)用于苧麻纖維的精制，如與酶法脫膠或化學(xué)脫膠等開展聯(lián)合脫膠工藝研究。Wang等［42］研究了酶法脫膠與單一微生物菌種脫膠的聯(lián)合工藝，在畢赤酵母（P．pastoris）中表達(dá)來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶，采用發(fā)酵后的酶液與可分泌果膠酶和木聚糖酶的芽孢桿菌屬細(xì)菌HG－28（Bacillussp.HG－28）對(duì)苧麻韌皮進(jìn)行聯(lián)合脫膠，發(fā)現(xiàn)脫膠效率明顯優(yōu)于僅由HG－28菌株（Bacillussp.HG－28）脫膠的方法。Zheng等［29］開發(fā)了一套復(fù)合微生物脫膠與酶法脫膠的聯(lián)合脫膠工藝，先將由3株嗜堿性脫膠菌株枯草芽孢桿菌NT－39、NT－53和NT－76（Bacillussp.NT－39，NT－53 and NT－76）組成的復(fù)合微生物用于苧麻脫膠，發(fā)酵48 h后再采用酶法脫膠，5 h后可使苧麻纖維中的殘膠率下降至9.4%，體現(xiàn)了微生物與酶聯(lián)合脫膠的優(yōu)越性。此外，也可采用微生物—化學(xué)聯(lián)合脫膠降低苧麻纖維的殘膠率。微生物—化學(xué)聯(lián)合脫膠法比僅采用微生物脫膠法或化學(xué)脫膠法效率更高，殘膠率可達(dá)2.04%以下，且微生物脫膠時(shí)采用混合菌種，可減少化學(xué)脫膠方法中的堿用量［53］。脫膠真菌黑曲霉An.6（A．nigerAn.6）以未經(jīng)刮制的苧麻韌皮為主要碳源，以0.4%麩皮為附加碳源，0.5% （NH4）2SO4為氮源，0.05%MgSO4、0.05%KCl、0.1%K2HPO4、0.001%FeSO4為礦物源，36～40 h內(nèi)可使殘膠率下降至14.42%左右，后續(xù)需要用0.5%NaOH處理30 min使殘膠率下降至1.33%，所獲精干麻達(dá)到紡織工業(yè)生產(chǎn)要求［54］。

5 結(jié)語與展望

脫膠是苧麻纖維加工過程中最為基礎(chǔ)、關(guān)鍵的粗加工工序，脫膠效果的優(yōu)劣直接影響到苧麻纖維的質(zhì)量。然而，目前苧麻纖維工業(yè)化脫膠中的化學(xué)脫膠方法耗水量大，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染［55］，尋求環(huán)保高效優(yōu)質(zhì)的苧麻脫膠方法已成為苧麻紡織產(chǎn)業(yè)的迫切需求。生物脫膠法可以克服化學(xué)脫膠法的缺陷［56］，其中，苧麻微生物脫膠法以膠質(zhì)為主要碳源，在微生物生長(zhǎng)繁殖的過程中實(shí)現(xiàn)苧麻纖維的剝離，可實(shí)現(xiàn)苧麻韌皮纖維的清潔化生產(chǎn)，為快速節(jié)能苧麻脫膠方法的發(fā)展提供新思路。

現(xiàn)有研究成果對(duì)于促進(jìn)苧麻微生物脫膠方法的發(fā)展具有重大意義，目前可從以下4個(gè)方面進(jìn)一步推動(dòng)該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展：一是篩選可應(yīng)用于苧麻脫膠工業(yè)化生產(chǎn)的微生物菌株（群）；二是利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效脫膠的工程菌株；三是通過優(yōu)化脫膠菌株（群）的發(fā)酵工藝促進(jìn)苧麻快速脫膠；四是形成適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的苧麻微生物脫膠工藝流程。

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