麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑制初步研究

陳靜，冷鵑，楊喜愛，廖麗萍，肖愛平，劉亮亮

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性球菌［1－3］，廣泛分布于自然界。金黃色葡萄球菌是引起臨床感染的常見致病菌，既可引起局部化膿性感染，如：甲溝炎、癰、傷口等，也可引起全身性感染，如：壞死性肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等。同時，其也是引起食品污染和細菌性食物中毒的一種重要細菌。受金黃色葡萄球菌污染后的食品，會發(fā)生腐敗變質(zhì)，且部分菌株會產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）而引起食物中毒，由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病是引起人類死亡的第二大主要原因，且金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的首位。金黃色葡萄球菌生存能力較強，廣泛分布在自然界中，如：空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中，嚴重危害著人類健康。隨著抗生素廣泛應(yīng)用于臨床，金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并且呈現(xiàn)多重耐藥性，這給臨床治療帶來了困難。目前，從天然產(chǎn)物活性成分中尋找對金黃色葡萄球菌具有抑制作用的化合物，是解決臨床治療金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病的關(guān)鍵問題。

麻類作物藥用價值研究始于華夏民族［4］，至今已有幾千年的歷史。隨著各種提取、分離、檢測技術(shù)基本成熟，麻類作物中活性成分分析更加明確。如：大麻作為一類重要的麻類作物，具有鎮(zhèn)痛、通經(jīng)活血、緩解疲勞等作用，且可治療風(fēng)濕病、痛風(fēng)、破傷風(fēng)等疾病。大麻植物中約有400種化合物，酚類化合物是大麻植物中已發(fā)現(xiàn)的一類主要活性成分，其中最主要的是四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚［5－7］；黃麻是一年生草本韌皮纖維植物，黃麻葉含有花青素，圓果黃麻葉含有固醇，具有強心作用，長果種黃麻葉可用于治療氣喘和痰癥［8］。麻類作物活性成分豐富，具有潛在的藥用價值，然而目前其在活性成分開發(fā)利用方面研究較少，需進一步加強麻類作物活性成分藥理作用研究，提高麻類作物的利用率。目前，已發(fā)現(xiàn)黃檗、黃連等中草藥對耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌作用。經(jīng)查閱文獻，尚未發(fā)現(xiàn)麻類作物關(guān)于金黃色葡萄球菌抑菌作用方面的研究。本試驗擬以大麻葉、黃麻葉、紅麻葉、苧麻葉提取物為研究對象，采用紙片法和對倍稀釋法，測試金黃色葡萄球菌對大麻葉、黃麻葉等提取物的敏感性，并測定其抑菌圈大小和最小抑菌濃度（MIC），旨在篩選分離出新的治療金黃色葡萄球菌菌株的母體化合物，并進一步探討麻類作物中活性成分的藥理作用，拓展麻類作物的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中黃麻1號（黃麻）、中雜紅368（紅麻）、中飼苧1號（苧麻）、中大麻2號（大麻）、金黃色葡萄球菌凍干粉ATCC25923。

蛋白胨、牛肉浸膏、NaCl、瓊脂、0.1 mol/L無水磷酸氫二鈉、75%乙醇、生理鹽水、無菌水。

LDZX－50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器、SWCJ－1F型超凈工作臺、HZQ－X100A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、BSP－250型生化培養(yǎng)箱、分析天平、游標(biāo)卡尺。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 樣品的制備

取麻葉粉碎樣30.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇溶液200 mL，將圓底燒瓶置于（90＋2）℃的恒溫水浴鍋中回餾提取2 h，重復(fù)提取2次，趁熱過濾，合并濾液，冷卻至室溫。分別對大麻葉、黃麻葉、紅麻葉、苧麻葉提取物進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干樣，取95%乙醇分別將其復(fù)溶，浸膏質(zhì)量濃度1.0 g/mL。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～20 g，用蒸餾水定容至1000 mL，PH調(diào)至7.0～7.2，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌30 min，待用。

1.2.3 菌種的活化

無菌條件下，將菌株凍干粉接種到復(fù)溶液滴瓶中，30℃恒溫培養(yǎng)24 h。將得到的菌株的新鮮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到適宜的固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基中，適宜溫度下培養(yǎng)，用以菌種的保藏、傳代及制備工作菌株。

1.2.4 菌懸液的制備

將活化好的菌種挑取1～3個菌落于盛有10 mL無菌生理鹽水的試管中，搖勻，制成菌懸液。取1 mL菌懸液進行等梯度（10－1）稀釋，共取8個濃度梯度，采用平板菌落計數(shù)法確定菌懸液濃度約為1.5×107個/毫升。置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 濾紙片法檢測大麻提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

無菌條件下，吸取金黃色葡萄球菌菌懸液200 uL，加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面，用無菌三角玻璃涂布棒涂抹均勻，將滅菌后的0.5 cm的濾紙片浸于麻葉提取液（1.0 g/mL）中，將其風(fēng)干并平貼在含菌培養(yǎng)基表面，在每個含菌平板上等距離放置4片，其中，一片浸無菌水濾紙片做空白對照，放入培養(yǎng)箱35～37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈兩個垂直方向的直徑，每個試驗重復(fù)3次，取其平均值作為測定結(jié)果［9，10］。

1.2.6 麻葉提取物最小抑菌濃度的測定

采用對倍稀釋法獲得濃度分別為 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.016、0.008、0.000 g/mL的麻葉提取物。各管加入100μL新鮮菌液，于35℃培養(yǎng)12 h，取200μL培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基觀察菌落生長情況，每個試驗重復(fù)3次，無金黃色葡萄球菌生長的最低麻葉提取物濃度為麻葉提取物最低抑菌濃度［11，12］。同時，取100μL培養(yǎng)物梯度稀釋至10－6，取各濃度梯度培養(yǎng)液200μL接種于固體培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)12 h，菌落計數(shù)，估算各濃度麻葉提取物培養(yǎng)中金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)（個/毫升）。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用

濾紙片法測定麻葉提取物抑菌活性結(jié)果表明：大麻葉和紅麻葉提取物金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為15.92、12.99 cm，其抑菌作用顯著。未檢出黃麻葉和苧麻葉提取物金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑，不敏感，對金黃色葡萄球菌生長基本無抑制作用?？赏茰y大麻葉和紅麻葉中存在可破壞金黃色葡萄球菌正常生殖代謝的活性成分，為尋找臨床治療金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病藥物先導(dǎo)化合物提供了新的依據(jù)，根據(jù)抑菌圈直徑大小指標(biāo)，大麻葉提取物抑菌效果優(yōu)于紅麻葉提取物，結(jié)果見表1及圖1。

表1 麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Tab.1 The diameter of inhibitory ringlikes of extracts of bast fiber crop leaves

圖1 麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Fig.1 The diameter of inhibitory ringlikes of extracts of bast fiber crop leaves

2.2 麻葉提取物最小抑菌濃度

對倍稀釋法和平板培養(yǎng)測定大麻和紅麻提取物最小抑菌濃度結(jié)果表明：大麻葉和紅麻葉具有相同的最小抑菌濃度，MIC均為0.0625 g/mL，即大麻葉和紅麻葉提取物在0.0625 g/mL濃度下可抑制所有試驗菌株的生長；同一樣品不同提取物濃度之間，平板金黃色葡萄球菌生長密度隨樣品濃度逐漸降低（0.03、0.016、0.008 g/mL）而增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系；相同質(zhì)量濃度的不同樣品提取物比較，紅麻葉提取物處理菌生長較大麻葉提取物處理生長良好，菌落數(shù)密度較大；與空白處理相比，0.008 g/mL紅麻葉提取物基本無抑菌作用，而0.008 g/mL大麻葉提取物仍有一定的抑菌效果，這說明大麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于紅麻葉提取物。結(jié)果見表2、3及圖 2、3。

表2 麻葉提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Tab.2 Theminimal inhibitory concentration of extracts of hemp and kenaf leaves

表3 麻葉提取物液體培養(yǎng)中金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)Tab.3 The number of living S.aureus cultivated in hemp and kenaf leaves extract

圖2 大麻樣品最小抑菌濃度Fig.2 Theminimal inhibitory concentration of extracts of hemp

圖3 紅麻樣品最小抑菌濃度Fig.3 Theminimal inhibitory concentration of extracts of kenaf

3 討論

麻葉提取物對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的初步研究結(jié)果表明，大麻和紅麻提取物在體外對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，可進一步篩選分離其抑菌有效成分，尋找臨床治療金黃色葡萄球菌相關(guān)疾病藥物母體化合物，這為耐藥金黃色葡萄球菌感染疾病的治療提供了新的探索，同時對藥物仿生化學(xué)具有重要的理論價值。目前，關(guān)于金黃色葡萄球菌抑菌化合物的篩選在抑菌機制方面研究較少，同時，需結(jié)合金黃色葡萄球菌抗生素耐藥機制的研究，從而有效的開發(fā)治療金黃色葡萄球菌臨床疾病的藥物。本文以麻葉為研究對象，開闊了麻類作物在天然活性成分篩選方面的開發(fā)利用，以期為我國麻類作物資源的開發(fā)研究提供參考。

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