酶/蛋白質(zhì)與土壤組分界面作用的研究進展

李 艷，譚文峰，陳 義，吳春艷，唐 旭，計小江

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430070）

土壤酶大多數(shù)屬于蛋白質(zhì)，主要來自于微生物和植物根系的分泌物以及動植物殘體，作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，其是生態(tài)系統(tǒng)的生物催化劑和土壤有機體的代謝動力。這些酶參與碳、氮、磷、硫等元素的土壤生物化學(xué)循環(huán)，是土壤有機質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者和植物營養(yǎng)元素的活性庫，其活性與土壤理化性質(zhì)、土壤類型、施肥、耕作及其他農(nóng)業(yè)措施等密切相關(guān)[1-2]。土壤酶可反映各種生物化學(xué)過程的方向和強度，常作為土壤肥力和自凈能力的重要指標[3]，由于其對環(huán)境因素改變的敏感性，也作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警指標[4]。人類的活動也會直接或間接向土壤排放各種蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)基因作物可通過根系分泌物及秸稈還田向土壤中釋放Bt蛋白，一些致病蛋白（朊病毒、禽流感病毒等）也可通過動物進入土壤環(huán)境，威脅人類健康。土壤溶液中游離態(tài)酶/蛋白質(zhì)含量較少，多以復(fù)合物的形式存在于土壤各組分界面上，包括礦物、有機質(zhì)、礦物－有機質(zhì)復(fù)合物等[5]。礦物、有機質(zhì)、礦物－有機質(zhì)復(fù)合物等組成了土壤中重要的化學(xué)界面，直接影響氮、磷等營養(yǎng)元素、有機物、生物大分子等的分布、形態(tài)、遷移轉(zhuǎn)化以及生物可給性。酶/蛋白質(zhì)在土壤界面上的吸附可能伴隨其構(gòu)象的變化，對于具有生物活性的酶/蛋白質(zhì)分子，其活性和穩(wěn)定性也可能在參與界面化學(xué)反應(yīng)的過程中發(fā)生改變。酶/蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變可能是影響其活性和穩(wěn)定性的重要原因之一[6－7]，但構(gòu)象的改變對生物活性的影響機理仍不清楚，有待于進一步研究。

1 酶/蛋白質(zhì)在土壤界面上的作用過程與機制

1.1 朊病毒、Bt毒素在土壤中的界面作用

朊病毒是傳染性海綿狀腦病的病原，可通過感染動物的尿液、糞便、唾液或腐爛的尸體等進入土壤，與土壤組分間的作用可影響該致病蛋白的傳播、生物可給性及在土壤中的持久性。朊病毒與模式氧化物（Al2O3、SiO2）的界面作用以靜電力為主，兩者的作用很大程度上取決于pH值和離子強度，土壤中朊病毒更傾向與帶正電荷的鐵鋁氧化物發(fā)生作用[8]。腐植酸作為一種天然的聚陰離子，廣泛存在于土壤與水體中，不僅與朊病毒存在較強的親和力，且能夠增加礦物對朊病毒的吸附能力[9]。與腐植酸作用后的朊病毒仍具有感染性，但可延緩疾病的感染速度[10]。為評估受感染動物尸體掩埋后在土壤中的傳播水平及對生物的可及性，Jacobson等[11]采用蛋白酶處理受感染的腦組織勻漿，用合成的雨水作為淋洗劑，模擬其在5種不同土壤中的遷移能力，結(jié)果在洗出液中并未發(fā)現(xiàn)朊病毒，該致病蛋白基本保留在原始位置，可能成為感染其他生物的傳染源。目前仍缺少有效滅活土壤中朊病毒的方法[12]，Chesney等[13]最近研究發(fā)現(xiàn)，過硫酸鹽對蛋氨酸和色氨酸殘基具有氧化作用，可作為一種原位修復(fù)朊病毒污染土壤的新方法。

Bt毒素可由轉(zhuǎn)基因作物通過根系分泌物、秸稈還田等方式釋放進入土壤，與土壤各組分發(fā)生交互作用。Sander等[14]和Madliger等[15]研究了pH值和離子強度對Bt毒素在SiO2和多聚賴氨酸（PLL）上吸附的影響，結(jié)果表明靜電作用力是主導(dǎo)Bt毒素吸附的驅(qū)動力，其在SiO2上的初始吸附速率和吸附量隨pH值的升高而下降，與在PLL上的吸附結(jié)果相反；當Bt毒素與吸附界面帶相同電荷時，吸附量隨離子強度的降低而增加；吸附于SiO2上的Bt毒素仍具有較高的殺蟲活性，在吸附解吸的過程中仍保持著較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。土壤中的腐植酸作為天然有機物，與Bt毒素通過靜電力、疏水作用而結(jié)合，兩者間的作用受溶液條件（pH值、離子強度）、腐植酸極性和表面電荷等因素影響，即使當pH＞6（大于Bt毒素等電點）且離子強度降低時，Bt毒素帶正電荷的區(qū)域與帶負電荷腐植酸間的靜電作用仍促使Bt毒素的吸附量增加，腐植酸表面極性具有不均一性，疏水作用力使得Bt毒素對腐植酸非極性較高的區(qū)域具有較強親和力[16]。

1.2 酶/蛋白質(zhì)在土壤界面上的作用機制

靜電力、疏水作用在酶/蛋白質(zhì)的吸附中起著重要的作用。酶/蛋白質(zhì)是帶有兩性電荷的生物聚電解質(zhì)分子，與荷電界面產(chǎn)生的靜電作用是其吸附于親水界面上的重要驅(qū)動力，且隨環(huán)境pH值的變化而變化。帶正電荷的溶菌酶能在靜電引力的牽引下進入帶相反電荷的蒙脫石層間并呈延展狀態(tài)，且Al（OH）x的空間阻隔效應(yīng)使得進入層間的溶菌酶隨蒙脫石表面覆蓋的Al（OH）x量的增加而減少[17]。在靜電引力的驅(qū)動下，溶菌酶被腐植酸包被在三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，阻礙了底物分子與活性位點的結(jié)合[18－22]。當酶/蛋白質(zhì)與固體表面帶相同電荷時，兩者間的疏水作用也會促進酶/蛋白質(zhì)的吸附，成為其吸附的另一種重要驅(qū)動力。層狀硅酸鹽礦物、有機質(zhì)的憎水性基團可通過疏水力與酶/蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域相結(jié)合。pH值為6時，胰島素、核糖核酸酶與腐植酸表面均帶負電荷，疏水力可通過克服分子間的靜電排斥力促進腐植酸對酶的包被作用[23]。Bt毒素的吸附量隨腐植酸極性的增加而降低[16]，免疫球蛋白等的吸附量隨界面疏水性的增強而增加[24]，這均證明了疏水作用在蛋白質(zhì)吸附過程中的重要性。

酶/蛋白質(zhì)與土壤組分間的作用還包括配位交換、氫鍵、范德華力、陽離子交換等。Huang等[25]研究了酸性磷酸酶在不同粒徑土壤顆粒及礦物上的吸附、解吸和酶活性，結(jié)果表明近三分之一吸附于針鐵礦上的酸性磷酸酶主要通過配位交換作用結(jié)合，與高嶺石間的作用以范德華力、氫鍵、疏水作用力為主，因而不易發(fā)生解吸。膨潤土和高嶺石對過氧化物酶、絡(luò)氨酸酶的吸附量與陽離子交換量呈正相關(guān)[26]，表明陽離子交換可能是兩者相互作用的重要機制之一。

1.3 土壤酶/蛋白質(zhì)界面反應(yīng)的研究手段

目前，研究酶/蛋白質(zhì)與界面相互作用的方法主要包括表1中的幾種。酶/蛋白質(zhì)的吸附量除采用差減法測定外，同位素示蹤法、橢偏光度法、微晶天平、光波導(dǎo)模式譜也被用于吸附量的測定。同位素示蹤法的優(yōu)點在于其可用于多組分分析；橢偏光度法通過測定表面物質(zhì)對偏振光反射時的狀態(tài)變化而實現(xiàn)對表面吸附態(tài)物質(zhì)質(zhì)量和厚度的測定，根據(jù)表面吸附蛋白的濃度和吸附層厚度可以預(yù)測吸附態(tài)蛋白的狀態(tài)，已用于各種表面對酶/蛋白質(zhì)吸附和解吸過程的原位檢測；微晶天平和光波導(dǎo)模式譜不僅可以測定蛋白質(zhì)吸附量，還可提供蛋白質(zhì)吸附、解吸的過程信息，近年來被廣泛應(yīng)用于酶/蛋白質(zhì)與腐植酸相互作用的研究中。此外，吸附態(tài)酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可采用傅里葉紅外光譜、熒光光譜、核磁共振、圓二色譜等方法測定（詳見4.2），酶/蛋白質(zhì)吸附、解吸過程中熱量的變化可采用微熱量法和差示掃描量熱法測定。

表1 研究酶/蛋白質(zhì)在界面上作用的技術(shù)手段Table1 Methods for studying enzymes/proteins adsorption on interfaces

2 酶/蛋白質(zhì)在土壤界面上吸附的影響因素

2.1 界面的理化性質(zhì)

界面的理化性質(zhì)主要包括表面結(jié)構(gòu)、疏水性、荷電性等。界面的物理結(jié)構(gòu)能夠?qū)γ?蛋白質(zhì)的吸附產(chǎn)生影響，Lundqvist等[37]研究了脫水酶在具有不同曲率SiO2表面上的吸附，結(jié)果表明酶與較大直徑的顆粒存在較強的交互作用，導(dǎo)致酶分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變。受界面疏水性的影響，纖維蛋白原等在疏水的甲基表面比親水的羥基表面吸附速率快[50]。McClellan等[51]研究發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白在疏水性界面形成的吸附層的厚度和密度大約為在親水界面吸附條件下的一半，表明蛋白質(zhì)分子與疏水界面間的作用更加強烈，蛋白質(zhì)分子的變性程度更大。蛋白質(zhì)在不同疏水性界面上的吸附結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的吸附量隨界面疏水性的增加而增加（即－CH3＞－OPh＞－OCH3＞－CONHCH3），且蛋白質(zhì)與界面間的作用也隨之增強[52－53]。

2.2 酶/蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

酶/蛋白質(zhì)在界面上的吸附還與本身分子量、形狀、表面官能團、電荷、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等有關(guān)。其中，酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也是影響酶/蛋白質(zhì)吸附的一個重要因素。溶菌酶、核糖核酸酶等硬蛋白內(nèi)部穩(wěn)定性高，在親水表面的吸附量較小，與疏水表面相遇時產(chǎn)生的靜電引力能使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致吸附量增加[28，54]；血清白蛋白等軟蛋白內(nèi)部穩(wěn)定性較低，吸附時構(gòu)象熵增加，幾乎可以結(jié)合到所有物質(zhì)表面[55]，即使這類蛋白質(zhì)與界面間存在靜電排斥力時，也會產(chǎn)生一定的吸附量。

2.3 環(huán)境條件

pH值、離子強度、酶/蛋白質(zhì)濃度等溶液條件會影響酶/蛋白質(zhì)的吸附量，以及在吸附界面上的排布和結(jié)構(gòu)的變化程度。圖1為某種兩性蛋白質(zhì)在硅石/水界面上的吸附隨pH值和蛋白質(zhì)濃度變化的示意圖。pH值對酶/蛋白質(zhì)吸附的影響較大，Mori等[56]研究指出當溶液pH值為3時（低于BSA等電點），帶正電荷的牛血清白蛋白快速吸附到云母表面，但分子之間的靜電排斥力使得蛋白質(zhì)在固體表面呈單分子吸附層，而當溶液pH值為6時（高于BSA等電點），蛋白質(zhì)與云母表面之間的靜電引力促使蛋白質(zhì)在固體表面形成多層吸附。蛋白質(zhì)濃度是影響其在界面上分布排列的另一個重要原因，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時，其在界面上的吸附速度較慢，能充分在界面上鋪展，與界面間的作用力增強[53]。當牛血清白蛋白的濃度低于0.5 g·L－1且pH值為3～7時，該蛋白質(zhì)在界面上形成均勻的單層吸附，當其濃度高于0.5 g·L－1且溶液pH值達到蛋白質(zhì)等電點附近時（pH 5.1），牛血清白蛋白在親水的硅石上的吸附量達到最大[57－58]。

離子強度對酶/蛋白質(zhì)吸附量的影響主要取決于酶/蛋白質(zhì)與界面所帶電荷性質(zhì)，當?shù)鞍踪|(zhì)與吸附界面帶相同電荷時，兩者之間存在靜電排斥力，當增加溶液的離子強度時，靜電排斥力減弱，促使酶/蛋白質(zhì)在界面上的吸附量增加；相反，當酶/蛋白質(zhì)與界面所帶電荷不同時，離子強度的增加對兩者的靜電引力產(chǎn)生“屏蔽效應(yīng)”，導(dǎo)致酶/蛋白質(zhì)的吸附量降低[59－60]。

圖1 兩性蛋白質(zhì)在硅石/水表面吸附示意圖Figure1 A schematic graph to show adsorption of an amphoteric protein on silica/water interface

表2 土壤組分對酶活性和穩(wěn)定性的影響Table2 The effect of enzymes interaction with soil components on their activities and stabilities

3 界面作用對酶/蛋白質(zhì)生物特性的影響

3.1 界面作用對酶/蛋白質(zhì)活性的影響

酶/蛋白質(zhì)進入土壤后，與有機質(zhì)、礦物、礦物－有機質(zhì)復(fù)合物、土壤膠體等結(jié)合，活性和穩(wěn)定性變化的程度與酶/蛋白質(zhì)種類、界面類型、環(huán)境條件等因素密切相關(guān)。吸附態(tài)酶的活性因其種類不同而不同，漆酶和過氧化酶吸附在高嶺石、蒙脫石上可維持較高的活性，而吸附后的磷酸酶活性降低[61]，葡萄糖氧化酶吸附于高嶺石、十六烷基三甲胺－蒙脫石后，其活性較游離態(tài)酶沒有明顯的變化[62－64]。不同吸附界面對土壤酶/蛋白質(zhì)活性的影響不同（表2），如Bt蛋白吸附于高嶺石后的殺蟲活性顯著高于蒙脫石，且殺蟲活性還與土壤介質(zhì)和蛋白質(zhì)的比例有關(guān)[65]。各礦物抑制酸性磷酸酶和脲酶活性的順序為蒙脫石＞高嶺石＞伊利石[66]，脲酶吸附于蒙脫石、氫氧化鋁、蒙脫石－氫氧化鋁復(fù)合物上的活性為蒙脫石＞蒙脫石－氫氧化鋁＞氫氧化鋁，蒙脫石表面由于氫氧化鋁的覆蓋，脲酶吸附量和活性均下降[67]。腐植酸對轉(zhuǎn)化酶、酸性磷酸酶的活性表現(xiàn)為促進作用，對脲酶、酸性磷酸酶活性的影響與腐植酸本身的分子量、溶液pH值等因素有關(guān)。Marzadori等[68]研究了兩種不同分子量的胡敏酸HA1（100～300 kDa）和HA2（10～20 kDa）對脲酶活性和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明pH為6.0時HA1顯著抑制了脲酶的活性，在pH為7.0和8.0時不影響脲酶活性，而HA2在以上pH條件下對脲酶的活性均表現(xiàn)為抑制作用。Li等[20－21]研究結(jié)果表明腐植酸對溶菌酶的活性表現(xiàn)為抑制作用，且抑制的程度與腐植酸分子量、腐植酸/溶菌酶復(fù)合質(zhì)量比、溶液pH值、離子強度有關(guān)。此外，氨基酸、葡萄糖、脂類等生物小分子能對酶與礦物間的相互作用產(chǎn)生影響，如賴氨酸、鼠李糖脂可以增強酸性磷酸酶在蒙脫石上的催化能力，使酶促反應(yīng)能更加自發(fā)地進行，而葡萄糖分子則對酸性磷酸酶在蒙脫石上的活性產(chǎn)生了抑制作用[69]。

界面反應(yīng)過程中，酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）也可能發(fā)生變化。當土壤膠體對酶/蛋白質(zhì)活性產(chǎn)生抑制作用時，通常表現(xiàn)為Vmax的降低和Km的增加，但研究結(jié)果不盡相同，如Marzadori等[70]研究發(fā)現(xiàn)，pH值為6～7范圍內(nèi)，腐植酸抑制了脲酶的活性，Vmax降低，Km降低，腐植酸增加了脲酶與底物之間的親和力。土壤各組分通常會引起酶/蛋白質(zhì)最適pH值的改變，當酶/蛋白質(zhì)吸附于表面帶負電荷的礦物上時，酶/蛋白質(zhì)最適pH值通常向堿性方向移動[71]。

3.2 界面作用對酶/蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

由于土壤膠體、礦物表面的保護作用，固定化酶能在一定程度上對抗蛋白酶的水解作用，并具有一定的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠抵御高溫、極端pH值的破壞，免遭光照、蛋白酶及微生物等的分解作用[72－73]，這是土壤酶普遍具有較高穩(wěn)定性的原因。被高嶺石吸附的Bt蛋白經(jīng)長期存放后仍保持較高的殺蟲活性，表明高嶺石對該蛋白具有穩(wěn)定作用[65]。大分子量的胡敏酸與脲酶的結(jié)合有利于酶穩(wěn)定性的提高，且穩(wěn)定性隨pH值的升高而增強[74]。Marzadori等[68]指出高分子量的胡敏酸可以提高脲酶抵抗蛋白酶的水解作用及金屬離子Cu2+、Hg2+的抑制作用。酶被粘土礦物吸附后，尤其是在羥基鋁存在的條件下，固定態(tài)酶的抗水解能力會更顯著[75]。酸性磷酸酶與單寧酸作用后置于60℃下的活性顯著低于游離態(tài)酶，但經(jīng)水解酶處理后的吸附態(tài)酶活性較游離態(tài)酶高，且當Fe3+或MnO2與單寧酸共存時，酸性磷酸酶抗水解的能力顯著增加[76]。與氫氧化鋁－單寧酸、氫氧化鋁－單寧酸－蒙脫石作用后，酸性磷酸酶抗水解酶的能力增強，且隨時間的延長效果更加顯著，這是因為酶/蛋白質(zhì)通過吸附或包被在有機物－礦物膠體的內(nèi)部或表面，致使酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化受到束縛，同時阻礙了水解酶與酶/蛋白質(zhì)活性中心的接觸[72]。Huang等[25]研究了不同溫度（15～85℃）下，幾種去有機質(zhì)和未去有機質(zhì)處理的土壤膠體對酸性磷酸酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度下吸附態(tài)酸性磷酸酶的活性均低于游離態(tài)酶，且由于有機質(zhì)的保護作用，未去有機質(zhì)處理的土壤膠體對酸性磷酸酶在不同溫度下活性的抑制作用低于去有機質(zhì)處理的土壤膠體。

4 界面作用對酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響

4.1 酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響因素

酶/蛋白質(zhì)在界面上的吸附通常伴隨構(gòu)象的改變，主要表現(xiàn)為二、三級結(jié)構(gòu)的微擾導(dǎo)致α－螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，螺旋結(jié)構(gòu)的缺失可能增加多肽鏈間的柔性，導(dǎo)致酶/蛋白質(zhì)分子構(gòu)象熵的增加[78－79]。酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化受其種類及濃度、吸附界面表面特性、溶液條件等因素的影響[80]。首先，不同酶/蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性存在一定差異，因而吸附后其結(jié)構(gòu)的改變程度也可能不同。Haynes等[81]研究發(fā)現(xiàn)，牛奶乳清白蛋白和雞蛋白溶解酵素吸附于憎水性聚苯乙烯表面后，兩種蛋白質(zhì)均發(fā)生顯著的變性；當兩者分別吸附于親水的α－Fe2O3表面后，前者幾乎完全變性，而后者由于良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性僅失去一小部分二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)濃度較低時，與界面間的作用力較強，導(dǎo)致構(gòu)象變化大于高濃度下的蛋白質(zhì)溶液。其次，吸附界面的化學(xué)組成、物理結(jié)構(gòu)（如形狀、尺寸、比表面積）、疏水性也會影響酶/蛋白質(zhì)的構(gòu)象。纖維蛋白原、血清白蛋白與含不同類型基團載體間的作用力隨載體表面疏水性的增加而增強，同時蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化也相應(yīng)增大[53]。不同直徑的SiO2載體對酶構(gòu)象的影響不同，脫水酶和纖維蛋白原的二級結(jié)構(gòu)變化均隨顆粒直徑的增加而增大，脫水酶的三級結(jié)構(gòu)則與顆粒大小無關(guān)，牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)的無序性也隨顆粒直徑的增加而增加[37]。蛋白質(zhì)構(gòu)型的改變程度可通過吸附于膨脹性粘粒礦物后層間距的擴張程度來判斷，如直徑為8.6 nm的葡萄糖氧化酶分子進入蒙脫石層間，僅使礦物層間距增加到2.3 nm[82]，層間距0.96 nm的脫水鈉蒙脫石吸附直徑為5.0 nm的芳基硫酸酯酶后，層間距只有1.90 nm[83]，表明蛋白質(zhì)分子“變扁”或結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。此外，當pH值、離子強度有利于蛋白質(zhì)在礦物表面上的吸附時，蛋白質(zhì)呈延展狀態(tài)分布于整個表面[84]。幾種表面具有不同電荷量及疏水特性的礦物對葡萄糖苷酶構(gòu)象影響的結(jié)果表明，除靜電作用力外，疏水作用也是引起酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的一個主要原因[82]。

4.2 酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的主要研究手段

目前，測定酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法可以分為兩類：一可以測定酶/蛋白質(zhì)高分辨率的結(jié)構(gòu)特征，如X－射線衍射、小角中子衍射法、核磁共振；二能夠測定酶/蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)及微環(huán)境的變化，如圓二色譜、紅外光譜、熒光光譜等（部分方法見表1）。Long等[36]采用固態(tài)核磁研究了唾液蛋白（分子量約為5 kDa）在羥磷灰石上的吸附，揭示了水分子在穩(wěn)定吸附態(tài)肽鏈α結(jié)構(gòu)上的作用。圓二色譜能提供酶/蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（α－螺旋、β－折疊、自由卷曲）的信息，但其局限性不僅在于不能測定特定區(qū)域結(jié)構(gòu)的變化，且在特定波長下較大的吸附劑分子存在一定的散射。Billsten等[85]發(fā)現(xiàn)，硅納米顆粒的直徑不超過20 nm才能進行圓二色譜測定。學(xué)者采用圓二色譜研究了幾種具有不同結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的球狀蛋白質(zhì)在帶電硅石納米顆粒上的吸附[85－88]，研究表明“軟”蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白、肌球素、血紅素）結(jié)構(gòu)變化的程度最大，而“硬”蛋白（細胞色素C、免疫球蛋白G、核糖核酸酶）與親水表面接觸，伸展的程度較小。圓二色譜與核磁共振相結(jié)合可為酶/蛋白質(zhì)在界面反應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)變化提供更多信息[37]。紅外光譜適用于研究固液界面上酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，唯一局限性在于顆粒直徑不能超過10 μm。采用衰減全反射紅外光譜可研究酶/蛋白質(zhì)在固液界面上的吸附動力學(xué)和酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，其中吸附動力學(xué)可通過流動或靜置狀態(tài)測定蛋白質(zhì)酰胺鍵隨時間的變化。熒光光譜和圓二色譜都是較成熟的溶液酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的測定方法，由于大多數(shù)酶/蛋白質(zhì)都含有能發(fā)射熒光的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸，其中色氨酸熒光強度最大，且對微環(huán)境的變化較敏感，因而常作為內(nèi)源熒光探針研究酶/蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

原子力顯微鏡可以分析酶/蛋白質(zhì)分子在固相表面上的取向，獲得酶/蛋白質(zhì)的空間分布情況。此外，和頻振動光譜是近年來發(fā)展起來的一項界面監(jiān)測手段，被廣泛應(yīng)用于酶/蛋白質(zhì)在固體材料上構(gòu)象變化的測定，該方法具有界面單分子層的敏感性，可有效地對固體材料界面上酶/蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象進行表征。

5 酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化與活性的關(guān)聯(lián)性

在土壤礦物、腐植酸等組分上的吸附可能引起酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，尤其對于一些軟蛋白，吸附于疏水性界面后會導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生較大的變化。酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變可能會引起其活性和穩(wěn)定性的變化，且酶/蛋白質(zhì)活性的變化可能隨構(gòu)象變化的增加而增加，如溶菌酶、脫水酶與較大粒徑SiO2作用后，α－螺旋結(jié)構(gòu)減少、酶活性損失嚴重，而吸附于具有大曲率的小粒徑SiO2上時，能最大限度地維持原有結(jié)構(gòu)，從而保持較高的活性[37－38]。酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象及活性的變化與吸附界面的表面特性密切相關(guān)，Noinville等[6]采用衰減全反射紅外光譜發(fā)現(xiàn)表面帶正電荷的α－胰凝乳蛋白酶吸附于帶負電荷的親水性界面時，僅5%的β－折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生損失，對酶活性的影響較低，而α－胰凝乳蛋白酶吸附于疏水性載體時，其二、三級結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大的變化，酶活性受到抑制，脂肪酶通常以較為緊實的構(gòu)象存在于溶液中，吸附于疏水性載體后則形成一種“敞開”式的構(gòu)象異構(gòu)體，允許底物分子接近酶的活性位點，使得酶活性增加。酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象對其活性的影響可能還與本身的性質(zhì)有關(guān)，木瓜蛋白酶和α－胰凝乳蛋白酶分別吸附于Teflon界面后，前者的α－螺旋結(jié)構(gòu)比例降低，而后者的α－螺旋結(jié)構(gòu)含量升高，且后者活性下降的程度更大[89]。

也有研究表明吸附態(tài)酶/蛋白質(zhì)活性的變化不是由酶/蛋白質(zhì)構(gòu)象變化所導(dǎo)致的，空間位阻也是造成活性變化的一個重要原因。如α－胰凝乳蛋白酶在蒙脫石表面吸附后（pH為5～7）活性顯著下降，該酶活性的降低可能是由催化活性位點氨基酸中的氨基和亞氨基面向帶負電荷的硅氧基表面造成空間位阻所引起的[28]。

6 展望

6.1 固定化酶/蛋白質(zhì)在土壤中的應(yīng)用

游離態(tài)酶/蛋白質(zhì)在環(huán)境中的穩(wěn)定性差，易發(fā)生化學(xué)、生物降解，酶/蛋白質(zhì)的固定化通常使其穩(wěn)定性得以增強，防止酶的損失且可反復(fù)使用。酶/蛋白質(zhì)固定的機制主要包括吸附、捕獲、微囊化、離子交換、交聯(lián)作用、共聚作用[90]。將固定化酶/蛋白質(zhì)應(yīng)用于環(huán)境污染物的降解是研究熱點之一，如氧化還原酶類（如過氧化物酶、漆酶等）能夠降解多環(huán)芳烴類、酚類化合物、有機磷農(nóng)藥、偶氮類染料等環(huán)境有機污染物。固定化酶/蛋白質(zhì)在水處理（尤其含酚廢水）方面已有較多報道[91－92]。在土壤污染修復(fù)中，固定化酶在處理土壤持久性有機污染物、除草劑等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。代云容等[93]采用可生物降解高分子外消旋聚乳酸為原料，利用乳液電紡技術(shù)將漆酶包埋固定于納米纖維中，用于土壤多環(huán)芳烴有機污染物的修復(fù)。研究者以海藻酸鈉或聚陰離子纖維素為載體，對阿特拉津降解酶和莠去津降解酶進行固定并優(yōu)化了固定條件，結(jié)果表明固定化酶在土壤除草劑污染修復(fù)中能發(fā)揮較好的作用[94－96]，葛世杰[97]還對固定化酶修復(fù)阿特拉津污染土壤的生態(tài)安全性進行了評價，發(fā)現(xiàn)固定化酶對土壤微生物活性和土壤多樣性無不良影響。

固定化酶的催化能力因載體種類與特性、固定化條件不同而存在差異，可固定酶的載體材料包括多孔玻璃球、粘土礦物、海藻酸鹽、有機凝膠等，但在實際土壤修復(fù)過程中，相對廉價的蒙脫石、高嶺石、二氧化硅、羥磷灰石等天然載體可能成為首選。研究不同固定化載體對酶/蛋白質(zhì)吸附和生物特性的影響，以節(jié)約經(jīng)濟成本為原則，篩選能保持酶/蛋白質(zhì)較高活性和穩(wěn)定性的載體，實現(xiàn)該技術(shù)在土壤污染修復(fù)中的應(yīng)用和推廣。

6.2 分子動力學(xué)模擬技術(shù)在土壤中的應(yīng)用

酶/蛋白質(zhì)在土壤界面上的吸附是一個極其復(fù)雜的過程，不僅關(guān)系到它們在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化，也影響其生物活性的發(fā)揮。酶/蛋白質(zhì)吸附于界面后的構(gòu)象變化一直是人們關(guān)注的焦點，現(xiàn)有的技術(shù)雖能夠提供一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的信息，但多局限于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，對于三級結(jié)構(gòu)及更復(fù)雜結(jié)構(gòu)信息的獲取較難。計算機分子模擬技術(shù)（如分子動力學(xué)模擬）在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化方面有著不可替代的優(yōu)勢，它可借助合理的分子結(jié)構(gòu)模型和物理原理，從微觀水平上揭示蛋白質(zhì)吸附的動態(tài)過程和機理。分子動力學(xué)模擬在藥物小分子與蛋白質(zhì)互作方面具有較多的應(yīng)用，何文英等[98]采用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了胡椒堿與牛血清白蛋白的鍵合模式主要是疏水作用，該結(jié)論也通過熱力學(xué)參數(shù)的結(jié)果得到了進一步驗證。唐志華[99]和張晟瑞等[100]采用分子模擬技術(shù)與光譜學(xué)相結(jié)合的手段研究了硫酸沙丁胺醇、抑菌劑磺胺二甲嘧啶與人血清白蛋白的作用，可為酶/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化提供更豐富的信息。目前，有研究者采用該技術(shù)模擬蛋白質(zhì)在土壤各組分上的界面作用，如Chapron等[101]采用分子動力學(xué)模型揭示了致病性朊病毒（PrPsc92-138）與模式礦物葉臘石間的深層作用機制，即通過蛋白質(zhì)肽鏈上質(zhì)子化的賴氨酸或組氨酸與粘土礦物表面的硅氧烷空穴中的氧原子形成的多個氫鍵而結(jié)合。借助于該模型，研究者發(fā)現(xiàn)與高嶺石、蒙脫石、針鐵礦發(fā)生界面作用時，免疫球蛋白Gb1結(jié)構(gòu)幾乎沒有變化，而與水鈉錳礦發(fā)生作用時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[102]。雖然該技術(shù)在模擬蛋白質(zhì)與土壤組分互作方面已取得了一定進展，但多應(yīng)用于一些模式蛋白和模式礦物間的作用，對于土壤中多元復(fù)雜界面的吸附仍具有一定的局限性，還有待于進一步挖掘。

[1]向澤宇,王長庭,宋文彪.草地生態(tài)系統(tǒng)土壤酶活性研究進展[J].草業(yè)科學(xué),2011,28（10）：1801-1806.

XIANG Ze-yu,WANG Chang-ting,SONG Wen-biao,et al.Advances on soil enzymatic activities in grassland ecosystem[J].Pratacultural Science,2011,28（10）：1801-1806.

[2]王理德,王方琳,郭春秀,等.土壤酶學(xué)研究進展[J].土壤,2016,48（1）：12-21.

WANG Li-de,WANG Fang-lin,GUO Chun-xiu,et al.Review：Progress of soil enzymology[J].Soils,2016,48（1）：12-21.

[3]關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1986.

GUAN Song-yin.Soil enzyme and research methods[M].Beijing：China Agriculture Press,1986.

[4]孟立君,吳鳳芝.土壤酶研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,35（5）：622-626.

MENG Li-jun,WU Feng-zhi.Advances on soil enzymes[J].Journal of Northeast Agricultural University,2004,35（5）：622-626.

[5]Busto M D,Perez-Mateos M.Characterization of β-D-glucosidase extracted from soil fractions[J].European Journal of Soil Science,2000,51（2）：193-200.

[6]Noinville S,Revault M,Baron M H,et al.Conformational changes and orientation of Humicola lanuginosa lipase on a solid hydrophobic surface：An in situ interface fourier transform infrared-attenuated total reflection study[J].Biophysical Journal,2002,82（5）：2709-2719.

[7]Gomes D E B,Lins R D,Pascutti P G,et al.The role of nonbonded interactions in the conformational dynamics of organophosphorous hydrolase adsorbed onto functionalized mesoporous silica surfaces[J].The Journal of Physical Chemistry B,2009,114（1）：531-540.

[8]Jacobson K H,Kuech T R,Pedersen J A.Attachment of pathogenic prion protein to model oxide surfaces[J].Environmental Science&Technology,2013,47（13）：6925-6934.

[9]Polano M,Anselmi C,Leita L,et al.Organic polyanions act as complexants of prion protein in soil[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2008,367（2）：323-329.

[10]Smith C B,Booth C J,Wadzinski T J,et al.Humic substances interfere with detection of pathogenic prion protein[J].Soil Biology and Biochemistry,2014,68（1）：309-316.

[11]Jacobson K H,Lee S,Somerville R A,et al.Transport of the pathogenic prion protein through soils[J].Journal of Environmental Quality,2010,39（4）：1145-1152.

[12]Booth C J,Johnson C J,Pedersen J A.Microbial and enzymatic inactivation of prions in soil environments[J].Soil Biology and Biochemistry,2013,59（2）：1-15.

[13]Chesney A R,Booth C J,Lietz C B,et al.Peroxymonosulfate rapidly inactivates the disease-associated prion protein[J].Environmental Science&Technology,2016,50（13）：7095-7105.

[14]Sander M,Madliger M,Schwarzenbach R P.Adsorption of transgenic insecticidal Cry1Ab protein to SiO2.1.Forces driving adsorption[J].Environmental Science&Technology,2010,44（23）：8870-8876.

[15]Madliger M,Sander M,Schwarzenbach R P.Adsorption of transgenic insecticidal Cry1Ab protein to SiO2.2.Patch-controlled electrostatic attraction[J].Environmental Science&Technology,2010,44（23）：8877-8883.

[16]Sander M,Tomaszewski J E,Madliger M,et al.Adsorption of insecticidal Cry1Ab protein to humic substances.1.Experimental approach and mechanistic aspects[J].Environmental Science&Technology,2012,46（18）：9923-9931.

[17]Violante A,De Cristofaro A,Rao M A,et al.Physicochemical properties of protein-smectite and protein-A（lOH）x-smectite complexes[J].Clay Minerals,1995,30（4）：325-336.

[18]Tan W F,Koopal L K,Norde W.Interaction between humic acid and lysozyme,studied by dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry[J].Environmental Science&Technology,2009,43（3）：591-596.

[19]Tan W F,Norde W,Koopal L K.Interaction between lysozyme and humic acid in layer-by-layer assemblies：Effects of pH and ionic strength[J].Journal of Colloid and Interface Science,2014,430：40-46.

[20]Li Y,Tan W F,Wang M X,et al.Influence of lysozyme complexation with purified Aldrich humic acid on lysozyme activity[J].European Journal of Soil Science,2012,63（5）：550-557.

[21]Li Y,Tan W F,Koopal L K,et al.The influence of soil humic acids on the activities and stabilities of lysozyme and urease[J].Environment Science&Technology,2013,47（10）：5050-5056.

[22]Tomaszewski J E,Schwarzenbach R P,Sander M.Protein encapsulation by humic substances[J].Environmental Science&Technology,2011,45（14）：6003-6010.

[23]Tomaszewski J E,Madliger M,Pedersen J A,et al.Adsorption of insecticidal Cry1Ab protein to humic substances.2.Influence of humic and fulvic acid charge and polarity characteristics[J].Environmental Science&Technology,2012,46（18）：9932-9940.

[24]Jansson E,Tengvall P.Adsorption of albumin and IgG to porous and smooth titanium[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2004,35（1）：45-51.

[25]Huang Q Y,Liang W,Cai P.Adsorption,desorption and activities of acid phosphatase on various colloidal particles from an Ultisol[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2005,45（3/4）：209-214.

[26]Claus H,Filip Z.Effects of clays and other solids on the activity of phenoloxidases produced by some fungi and actinomycetes[J].Soil Biology and Biochemistry,1990,22（4）：483-488.

[27]Quiquampoix H,Staunton S,Baron M H,et al.Interpretation of the pH dependence of protein adsorption on clay mineral surfaces and its relevance to the understanding of extracellular enzyme activity in soil[J].Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects,1993,75（93）：85-93.

[28]Baron M H,Revault M,Servagent-Noinville S,et al.Chymotrypsin adsorption on montmorillonite：Enzymatic activity and kinetic FTIR structural analysis[J].Journal of Colloid and Interface Science,1999,214（2）：319-332.

[29]Karajanagi S S,Vertegel A A,Kane R S,et al.Structure and function of enzymes adsorbed onto single-walled carbon nanotubes[J].Langmuir,2004,20（26）：11594-11599.

[30]Maste M C L,Norde W,Visser A J W G.Adsorption-induced conformational changes in the serine proteinase savinase：A tryptophan fluorescence and circular dichroism study[J].Journal of Colloid and Interface Science,1997,196（2）：224-230.

[31]Bjerneld E J,F?ldes-Papp Z,K?ll M,et al.Single-molecule surfaceenhanced Raman and fluorescence correlation spectroscopy of horseradish peroxidase[J].The Journal of Physical Chemistry B,2002,106（6）：1213-1218.

[32]Arnebrant T,Nylander T.Sequential and competitive adsorption of βlactoglobulin and k-casein on metal surfaces[J].Journal of Colloid and Interface Science,1986,111（2）：529-533.

[33]Itoh H,Nagata A,Toyomasu T,et al.Adsorption of β-lactoglobulin onto the surface of stainless steel particles[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59（9）：1648-1651.

[34]Elofsson U M,Paulsson M A,Sellers P,et al.Adsorption during heat treatment related to the therma unfolding/aggregation of β-lactoglobulins A and B[J].Journal of Colloid and Interface Science,1996,183（2）：408-415.

[35]Lassen B,Malmsten M.Structure of protein layers during competitive adsorption[J].Journal of Colloid and Interface Science,1996,180（2）：339-349.

[36]Long J R,Shaw W J,Stayton P S,et al.Structure and dynamics of hydrated statherin on hydroxyapatite as determined by solid-state NMR[J].Biochemistry,2001,40（51）：15451-15455.

[37]Lundqvist M,Sethson I,Jonsson B H.Protein adsorption onto silica nanoparticles：Conformational changes depend on the particles′curvature and the protein stability[J].Langmuir,2004,20（24）：10639-10647.

[38]Vertegel A A,Siegel R W,Dordick J S.Silica nanoparticle size influences the structure and enzymatic activity of adsorbed lysozyme[J].Langmuir,2004,20（16）：6800-6807.

[39]Marsh R J,Jones R A L,Sferrazza M.Neutron reflectivity study of the adsorption of β-lactoglobulinat a hydrophilic solid/liquid interface[J].Journal of Colloid and Interface Science,1999,218（1）：347-349.

[40]Follows D,Holt C,Nylander T,et al.Beta-casein adsorption at the silicon oxide-aqueous solution interface：Calcium ion effects[J].Biomacromolecules,2004,5（2）：319-325.

[41]Murray B S,Deshaires C.Monitoring protein fouling of metal surfaces via a quartz crystal microbalance[J].Journal of Colloid and Interface Science,2000,227（1）：32-41.

[42]Tomaszewski J E,Schwarzenbach R P,Sander M.Protein encapsulation by humic substances[J].Environmental Science&Technology,2011,45（14）：6003-6010.

[43]Huang H M,Lin F Y,Chen W Y,et al.Isothermal titration microcalorimetric studies of the effect of temperature on hydrophobic interaction between proteins and hydrophobic adsorbents[J].Journal of Colloid and Interface Science,2000,229（2）：600-606.

[44]Tsai Y S,Lin F Y,Chen W Y,et al.Isothermal titration microcalorimetric studies of the effect of salt concentrations in the interaction between proteins and hydrophobic adsorbents[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2002,197（1）：111-118.

[45]Larsericsdotter H,Oscarsson S,Buijs J.Thermodynamic analysis of proteins adsorbed on silica particles：Electrostatic effects[J].Journal of Colloid and Interface Science,2001,237（1）：98-103.

[46]Brandes N,Welzel P B,Werner C,et al.Adsorption-induced conformational changes of proteins onto ceramic particles：Differential scanning calorimetry and FTIR analysis[J].Journal of Colloid and Interface Science,2006,299（1）：56-69.

[47]Takahara A,Hara Y,Kojio K,et al.Plasma protein adsorption behavior onto the surface of phase-separated organosilane monolayers on the basis of scanning force microscopy[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2002,23（2）：141-152.

[48]Ying P Q,Yu Y,Jin G,et al.Competitive protein adsorption studied with atomic force microscopy and imaging ellipsometry[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2003,32（1）：1-10.

[49]Stevens P W,Hansberry M R,Kelso D M.Assessment of adsorption and adhesion of proteins to polystyrene microwells by sequential enzyme-linked-immunosorbent assay analysis[J].Analytical Biochemistry,1995,225（2）：197-205.

[50]Roach P,Farrar D,Perry C C.Interpretation of protein adsorption：Surface-inducedconformationalchanges[J].JournaloftheAmericanChemical Society,2005,127（22）：8168-8173.

[51]McClellan S J,Franses E I.Adsorption of bovine serum albumin at solid/aqueous interfaces[J].Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects,2005,260（1）：265-275.

[52]Sigal G B,Mrksich M,Whitesides G M.Effect of surface wettability on the adsorption of proteins and detergents[J].Journal of the American Chemical Society,1998,120（14）：3464-3473.

[53]Sivaraman B,Fears K P,Latour R A.Investigation of the effects of surface chemistry and solution concentration on the conformation of adsorbed proteins using an improved circular dichroism method[J].Langmuir,2009,25（5）：3050-3056.

[54]Norde W,Anusiem A C I.Adsorption,desorption and re-adsorption of proteins on solid surfaces[J].Colloids and Surfaces,1992,66（1）：73-80.

[55]Sakiyama T,Tanino K,Urakawa M,et al.Adsorption characteristics of tryptic fragments of bovine β-lactoglobulin on a stainless steel surface[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,88（5）：536-541.

[56]Mori O,Imae T.AFM investigation of the adsorption process of bovine serum albumin on mica[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,1997,9（1/2）：31-36.

[57]Su T J,Lu J R,Thomas R K,et al.The conformational structure of bovine serum albumin layers adsorbed at the silica-water interface[J].The Journal of Physical Chemistry B,1998,102（41）：8100-8108.

[58]Su T J,Lu J R,Thomas R K,et al.Effect of pH on the adsorption of bovine serum albumin at the silica/water interface studied by neutron reflection[J].The Journal of Physical Chemistry B,1999,103（18）：3727-3736.

[59]De Kruif C G,Weinbreck F,De Vries R.Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides[J].Current Opinion in Colloid&Interface Science,2004,9（5）：340-349.

[60]Wang X,Ruengruglikit C,Wang Y W,et al.Interfacial interactions of pectin with bovine serum albumin studied by quartz crystal microbalance with dissipation monitoring：Effect of ionic strength[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55（25）：10425-10431.

[61]Gianfreda L,Bollag J M.Effect of soils on the behavior of immobilized enzymes[J].Soil Science Society of America Journal,1994,58（6）：1672-1681.

[62]Ross D J,McNeilly B A.Some influences of different soils and clay minerals on the activity of glucose oxidase[J].Soil Biology and Biochemistry,1972,4（1）：9-18.

[63]Garwood G A,Mortland M M,Pinnavaia T J.Immobilization of glucose oxidase on montmorillonite clay：Hydrophobic and ionic modes of binding[J].Journal of Molecular Catalysis,1983,22（2）：153-163.

[64]Boyd S A,Mortland M M.Selective effects of smectite-organic complexes on the activities of immobilized enzymes[J].Journal of Molecular Catalysis,1986,34（1）：1-8.

[65]鄔建敏.蛋白質(zhì)與酶在固相表面的吸附行為對其生物活性及穩(wěn)定性影響的研究[D].杭州：浙江大學(xué),2006.

WU Jian-min.The adsorption of protein/enzyme on solid surface and the effect of adsorption on protein/enzyme bioactivity and stability[D].Hangzhou：Zhejiang University,2006.

[66]Makboul H E,Ottow J C G.Michaelis constant（Km） of acid phosphatase as aected by montmorillonite,illite and kaolinite clay minerals[J].Microbial Ecology,1979,5：207-213.

[67]Gianfreda L,Rao M A,Violante A.Adsorption,activity and kinetic properties of urease on montmorillonite,aluminium hydroxide and A（lOH）x-montmorillonite complexes[J].Soil Biology and Biochemistry,1992,24（1）：51-58.

[68]Marzadori C,Francioso O,Ciavatta C,et al.Influence of the content of heavy metals and molecular weight of humic acids fractions on the activity and stability of urease[J].Soil Biology and Biochemistry,2000,32：1893-1898.

[69]Kelleher B P,Willeford K O,Simpson A J,et al.Acid phosphatase interactions with organo-mineral complexes：Influence on catalytic activity[J].Biogeochemistry,2004,71（3）：285-297.

[70]Marzadori C,Francioso O,Ciavatta C,et al.Activity and stability of jack bean urease in the presence of peat humic acids obtained using different extractants[J].Biology&Fertility of Soils,2000,32：415-420.

[71]Quiquampoix H,Burns R G.Interactions between proteins and soil mineral surfaces：Environmental and health consequences[J].Elements,2007,3（6）：401-406.

[72]Rao M A,Violante A,Gianfreda L.Interaction of acid phosphatase with clays,organic molecules and organo-mineral complexes：Kinetics and stability[J].Soil Biology and Biochemistry,2000,32（7）：1007-1014.

[73]Tietjen T,Wetzel R G.Extracellular enzyme-clay mineral complexes：Enzyme adsorption,alteration of enzyme activity,and protection from photodegradation[J].Aquatic Ecology,2003,37（4）：331-339.

[74]Dong L H,Yang J S,Yuan H L,et al.Chemical characteristics and influences of two fractions of Chinese lignite humic acids on urease[J].European Journal of Soil Biology,2008,44（2）：166-171.

[75]喬學(xué)琴.土壤活性顆粒表面酸性磷酸酶的固定機理與特性[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

QIAO Xue-qin.Bingding mechanisms and properties of acid phosphatase on soil active particles[D].Wuhan：Huazhong Agriculture University,2007.

[76]Rao M A,Gianfreda L.Properties of acid phosphatase-tannic acid complexes formed in the presence of Fe and Mn[J].Soil Biology and Biochemistry,2000,32（13）：1921-1926.

[77]Ahn M Y,Zimmerman A R,Martínez C E,et al.Characteristics of Trametes villosa laccase adsorbed on aluminum hydroxide[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,41（1/2）：141-148.

[78]Henzler K,Wittemann A,Breininger E,et al.Adsorption of bovine hemoglobin onto spherical polyelectrolyte brushes monitored by smallangle X-ray scattering and fourier transform infrared spectroscopy[J].Biomacromolecules,2007,8（11）：3674-3681.

[79]Tavolaro P,Tavolaro A,Martino G.Influence of zeolite PZC and pH on the immobilization of cytochrome c：A preliminary study regarding the preparation of new biomaterials[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,2009,70（1）：98-107.

[80]葉 鵬,萬容兵,王新平.載體材料與蛋白質(zhì)的相互作用及對其構(gòu)象的影響[J].高分子通報,2010,11：48-54.

YE Peng,WAN Rong-bing,WANG Xin-ping.Progress of study on interaction between support and protein and its effect on protein conformation[J].Chinese Polymer Bulletin,2010,11：48-54.

[81]Haynes C A,Norde W.Structures and stabilities of adsorbed proteins[J].Journal of Colloid and Interface Science,1995,169（2）：313-328.

[82]Quiquampoix H,Chassin P,Ratcliffe R G.Enzyme activity and cation exchange as tools for the study of the conformation of proteins adsorbed on mineral surfaces[J].Progress in Colloid and Polymer Science,1989,79：59-63.

[83]Simpson G H,Hughes J D.Arylsulphatase clay interactions.I.Adsorption of arylsulphatase by kaolinite and montmorillonite[J].Soil Research,1978,16（1）：27-33.

[84]Leprince F,Quiquampoix H.Extracellular enzyme activity in soil：Effect of pH and ionic strength on the interaction with montmorillonite of two acid phosphatases secreted by the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum[J].European Journal of Soil Science,1996,47（4）：511-522.

[85]Billsten P,Carlsson U,Elwing H.Studies on the conformation of adsorbed proteins with the use of nanoparticle technology[J].Surfactant Science Series,1998,75：627-650.

[86]Kondo A,Oku S,Higashitani K.Structural changes in protein molecules adsorbed on ultrafine silica particles[J].Journal of Colloid and Interface Science,1991,143（1）：214-221.

[87]Kondo A,Fukuda H.Effects of adsorption conditions on kinetics of protein adsorption and conformational changes at ultrafine silica particles[J].Journal of Colloid and Interface Science,1998,198（1）：34-41.

[88]Giacomelli C E,Norde W.The adsorption-desorption cycle.Reversibility of the BSA-silica system[J].Journal of Colloid and Interface Science,2001,233（2）：234-240.

[89]Zoungrana T,Findenegg G H,Norde W.Structure,stability,and activity of adsorbed enzymes[J].Journal of Colloid and Interface Science,1997,190（2）：437-448.

[90]Weetall H H.Immobilized enzymes.Analytical applications[J].Analytical Chemistry,1974,46（7）：602A-604A.

[91]鮑 騰,彭書傳,陳 冬,等.凹凸棒石粘土固定辣根過氧化物酶處理含酚廢水[J].環(huán)境工程學(xué)報,2012,6（9）：3179-3185.

BAO Teng,PENG Shu-chuan,CHEN Dong,et al.Horseradish peroxidase immobilization in palygorskite-based material for phenol wastewater treatment[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2012,6（9）：3179-3185.

[92]王 翠,姜艷軍,周麗亞,等.納米氧化硅固定辣根過氧化物酶處理苯酚廢水[J].化工學(xué)報,2011,62（7）：2026-2032.

WANG Cui,JIANG Yan-jun,ZHOU Li-ya,et al.Horseradish peroxidase encapsulated on nanosilica for phenol removal[J].CIESC Journal,2011,62（7）：2026-2032.

[93]代云容,丁士元,牛軍峰.電紡納米纖維膜固定化漆酶去除土壤中多環(huán)芳烴的研究[C]//持久性有機污染物論壇2011暨第六屆持久性有機污染物全國學(xué)術(shù)研討會論文集·哈爾濱,2011.

DAI Yun-rong,DING Shi-yuan,NIU Jun-feng.Removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil by immobilized laccase on electrospun nanofiber membranes[C]//Proceedings of the 2011 symposium on persistent organic pollutants forum and the sixth national symposium on persistent organic pollutants·Harbin,2011.

[94]Ma T T,Zhu L S,Wang J H,et al.Enhancement of atrazine degradation by crude and immobilized enzymes in two agricultural soils[J].Environmental Earth Sciences,2011,64（3）：861-867.

[95]張 穎,王 溪,姜 昭,等.固定化酶修復(fù)阿特拉津污染土壤效果及土壤細菌多樣性動態(tài)變化分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,44（11）：1-6.

ZHANG Ying,WANG Xi,JIANG Zhao,et al.Effect of atrazine-contaminated soil by immobilization enzyme and dynamic variation of soil microbial[J].Journal of Northeast Agricultural University,2013,44（11）：1-6.

[96]王 軍,王秀國,朱魯生,等.海藻酸鈉固定化莠去津降解酶的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2007,26（5）：1733-1737.

WANG Jun,WANG Xiu-guo,ZHU Lu-sheng,et al.Atrazine degrading enzyme′s immobilization in sodium alginate[J].Journal of Agro-Environment Science,2007,26（5）：1733-1737.

[97]葛世杰.固定化阿特拉津降解酶制備及其土壤修復(fù)效果研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

GE Shi-jie.Study on immobilized atrazine degradation enzyme properties and soil remediation effect[D].Harbin：Northeast Agricultural University,2013.

[98]何文英,陳光英,杜 娟,等.光譜法與分子模擬研究胡椒堿對牛血清白蛋白的鍵合作用[J].化學(xué)學(xué)報,2008,66（21）：2365-2370.

HE Wen-ying,CHEN Guang-ying,DU Juan,et al.Investigation on the binding of piperine to bovine serum albumin by optical spectroscopy and molecular modeling[J].Acta Chimica Sinica,2008,66（21）：2365-2370.

[99]唐志華.分子模擬技術(shù)與光譜法結(jié)合研究硫酸沙丁胺醇與兩種蛋白質(zhì)的相互作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20（24）：114-117.

TANG Zhi-hua.Studies of interaction between salbutamol sulfate and two proteins by molecular modeling and spectroscopic methods[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2014,20（24）：114-117.

[100]張晟瑞,王 芹,季曉輝.分子模擬技術(shù)與光譜法結(jié)合研究抑菌劑磺胺二甲嘧啶與人血清白蛋白之間的相互作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20（15）：104-107.

ZHANG Sheng-rui,WANG Qin,JI Xiao-hui.Molecular modeling and multi-spectroscopic approaches to study interaction between antimicrobial drug sulfamethazine and human serum albumin[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2014,20（15）：104-107.

[101]Chapron Y,Charlet L,Sahai N.Fate of pathological prion（PrPsc92-138）in soil and water：Prion-clay nanoparticle molecular dynamics[J].Journal of Biomolecular Structure and Dynamics,2014,32（11）：1802-1816.

[102]Andersen A,Reardon P N,Chacon S S,et al.Protein-mineral interactions：Molecular dynamics simulations capture importance of variations in mineral surface composition and structure[J].Langmuir,2016,32（24）：6194-6209.