耐鎘細菌的分離及其對土壤中鎘的形態(tài)影響

劉玉玲 ，鐵柏清 *，李園星露 ，魏祥東 ，彭 鷗 ，葉長城 ，劉孝利 ，孫 健

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，長沙 410128；2.湖南省重金屬污染耕地安全高效利用工程研究中心，長沙 410013；3.廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣州 510006）

重金屬鎘（Cd）因移動性大、毒性高、污染面積較廣被稱為“五毒之首”[1]。21世紀以來，隨著工業(yè)飛速發(fā)展，礦產(chǎn)累年采冶，導致農(nóng)田Cd污染日趨嚴重[2]。我國受Cd污染地區(qū)已涉及11個省（市）的25個地區(qū)[3]。目前對受重金屬污染的土壤修復，主要采用的技術(shù)方法有化學修復、物理修復、生物修復和微生物修復[4]。微生物作為土壤中的活性膠體，具有比表面積大、帶電荷、代謝活動旺盛、種類繁多、數(shù)量大等特點，有的土壤微生物不僅參與土壤中污染物的循環(huán)過程，還可作為環(huán)境載體吸附重金屬污染物[5]。由于微生物對重金屬具有積累、吸附和解毒作用，土壤重金屬污染微生物處理技術(shù)的發(fā)展及應用受到廣泛關(guān)注。Francesca等[6]研究發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌對Cd的生物吸附去除率達到77%。晉銀佳等[7]證實熒光假單胞菌菌體代謝能夠產(chǎn)生鐵載體，鐵載體能夠與Cd2+絡(luò)合，使得油麥菜對Cd的吸收減少，其中采用砂基方式培養(yǎng)的油麥菜Cd含量降幅最高達50.74%。

Delftia菌屬是1999年由Wen等[8]發(fā)現(xiàn)的一個新菌屬，目前對該類菌的研究主要集中于對有機污染物的去除能力上，如 Zhang 等[9]、梁泉峰[10]、Xiao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)Delftia能夠高效降解苯胺并分析了其降解的相關(guān)基因和降解途徑。González等[12]發(fā)現(xiàn) Delftia sp.能降解 2，4－D，在 2，4－D 初始濃度為 100 mg·L－1時，降解率達到99.9%。葉杰旭等[13]發(fā)現(xiàn)Delftia能以氯苯為唯一碳源和能源，并且能夠降解氯苯。對于Delftia修復重金屬污染土壤的研究較少，Prakash等[14]報道了D.tsuruhatensisAR－7可以通過胞內(nèi)積累或細胞膜吸附將 Se4+轉(zhuǎn)化為 Se0，Caravaglia 等[15]、Morel等[16]和Ubalde等[17]報道了Cr（Ⅵ）抗性菌 D.acidovorans AR 和 Delftia sp.JD2對Cr（Ⅵ）的生物轉(zhuǎn)化，其可將Cr（Ⅵ）還原成毒性較低的Cr（Ⅲ）。目前還沒有Delftia對于Cd污染土壤修復方面的報道。

土壤中重金屬以各種不同的形態(tài)存在，重金屬的不同形態(tài)具有不同的化學活性和生物有效性，重金屬形態(tài)分布在一定程度上可以反映重金屬的生物有效性和毒性變化，重金屬的形態(tài)及其轉(zhuǎn)化對研究重金屬的環(huán)境效益及重金屬污染治理修復具有重要意義[18－19]。目前，關(guān)于微生物－土壤重金屬形態(tài)的研究較少，本研究通過從礦區(qū)鎘污染土壤中篩選分離的耐Cd細菌，探究目標菌株對土壤中Cd形態(tài)分布的影響，以期為重金屬污染土壤微生物修復提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

表1 土壤理化性質(zhì)Table1 Soil physical and chemical properties

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自湖南省株洲市霞灣地區(qū)某冶煉廠周邊受重金屬污染的0～20 cm土層土壤，為偏中性紫砂土。由表1可知，重金屬含量普遍較高，與國家土壤環(huán)境質(zhì)量三級標準（為保障農(nóng)林生產(chǎn)和植物正常生長的土壤臨界值）相比，Pb、Zn、Cu、Cd的含量分別為國家土壤環(huán)境質(zhì)量三級標準的 2.71、10.06、15.61、174.87倍，其中Cd超標最為嚴重。

1.2 耐Cd菌株的篩選

培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15～20 g、蒸餾水 1 L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓滅菌鍋滅菌30 min。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

稱取5 g土樣，加入到45 mL已滅菌并裝有玻璃珠的液體培養(yǎng)基（Cd2+含量 50 mg·L－1）中，30 ℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng)，4 d為一個周期，一個周期結(jié)束后以10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的液體培養(yǎng)基（Cd2+含量 100 mg·L－1）中，150 r·min－1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)一個周期，再轉(zhuǎn)接4次，至液體培養(yǎng)基中的Cd2+濃度增加到300 mg·L－1。取最后一次富集培養(yǎng)液 0.2 mL，以 10 倍比稀釋法稀釋后涂布于分離純化培養(yǎng)基平板上，并在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～96 h。肉眼觀察菌落生長情況，并分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在新的分離純化培養(yǎng)基平板上繼續(xù)劃線分離，直到培養(yǎng)出菌落特征一致的純菌種。然后將純菌種接種到含Cd2+的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，觀察菌株生長情況，選擇生長較好的菌株保存并進行吸附試驗。取1 mL菌液接入50 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含Cd2+濃度為 10 mg·L－1和 100 mg·L－1，在 30 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，取25 mL培養(yǎng)液于13 000 r·min－1離心15 min，取上清液測定Cd2+濃度，并篩選Cd2+吸附率最高的菌株，即為目標菌株進行后續(xù)研究。

1.3 目標菌株鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化鑒定：觀察菌株的形態(tài)特征并根據(jù)菌株的形態(tài)特征，按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對分離純化的細菌進行鑒定。

菌株16S rRNA的擴增和鑒定：將1.2中篩選出的目標菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，取適量的菌體到30 μL無菌水中，98 ℃熱解 20 min 后，4000 r·min－1離心 1 min。取1 μL上清液作為模板DNA，用于PCR擴增。用細菌 16S rRNA 通用引物（27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′和 1492R：5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）來進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.4 目標菌株的生長曲線

將目標菌株接種在液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r·min－1培養(yǎng)24 h，以2%的接種量接入新的Cd2+濃度為0（CK）、10、100 mg·L－1培養(yǎng)基中，在 0～54 h 周期里，以3 h為時間間隔取樣，于600 nm下測定不同濃度下的生長曲線。

1.5 不同培養(yǎng)條件對菌株去除Cd2+效果的影響

1.5.1 菌體的制備

將目標菌株接種在液體培養(yǎng)基中30℃、120 r·min－1培養(yǎng)24 h，用無菌水洗滌兩次后制成OD600=1.6（7.6×108cfu·mL－1）的菌懸液。

1.5.2 pH對目標菌株吸附Cd2+的影響

將50 mL含10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每個 pH 值設(shè)置 3 個重復，滅菌后對培養(yǎng)液的pH進行測定，并做相應校正。按2%接種量分別接入菌懸液，30 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，13 000 r·min－1離心 5 min，采用 ICP－OES 測定上清液Cd2+的濃度，計算目標菌株對Cd2+的吸附量和吸附率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對目標菌株吸附Cd2+的影響

將 50 mL含 10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液 pH 調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，分別于10、20、30、35、40 ℃下 120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，測定方法同1.5.2。

1.5.4 培養(yǎng)時間對目標菌株吸附Cd2+的影響

將 50 mL含 10 mg·L－1Cd2+的培養(yǎng)液 pH 調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，于30℃、120 r·min－1分別振蕩培養(yǎng) 18、24、36、48、72 h，測定方法同1.5.2。

1.5.5 Cd2+濃度對目標菌株吸附Cd2+的影響

分別配制 Cd2+濃度為 1、5、10、50、100 mg·L－1的培養(yǎng)液，pH調(diào)為7.0，滅菌后按2%的接種量接入菌懸液，于 30 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h，測定方法同1.5.2。

1.6 菌株對土壤Cd形態(tài)的影響

試驗用土先經(jīng)過陽光曝曬后過2 mm篩，試驗用塑料小盆缽的上緣直徑10 cm，底面直徑9 cm，高14 cm。每盆裝土150 g（以風干土計）。將菌株培養(yǎng)48 h后接種 3 mL（T1，接種量為 1.44×1011cfus）和 10 mL（T2，接種量為 4.8×1011cfus）到土壤中，加蒸餾水使土壤含水量保持田間持水量的60%。以不加菌的為對照（CK），分別于接種后 0、5、10、20、30 d 取鮮土樣 10 g測定土壤Cd的形態(tài)。

1.7 分析方法

Cd的形態(tài)分析采用BCR法[20]，用ICP－OES（美國PE8300）測定其Cd的濃度。BCR提取法：（1）用40 mL 0.11 mol·L－1的醋酸（HOAc）在室溫（22±5）℃下提取弱酸可溶態(tài) Cd；（2）用 40 mL 0.5 mol·L－1鹽酸羥胺（pH=2.0）在室溫（22±5）℃下提取可還原態(tài) Cd；（3）加入 10 mL 8.8 mol·L－1H2O2（pH=2～3）溶液，先在室溫（22±5）℃下反應 1 h，間歇振蕩，然后在（85±2）°C 水浴反應1 h，取下蓋子繼續(xù)水浴加熱使其體積至3 mL；再向其中加入10 mL 8.8 mol·L－1H2O2（pH=2～3）溶液，85±2°C水浴反應1 h，繼續(xù)水浴加熱使其體積小于1 mL。冷卻后加入50 mL 1 mol·L－1NH4OAc提取可氧化態(tài)Cd；（4）殘渣態(tài)Cd提取采用全消解處理，消解步驟同土壤全量消解。

1.8 數(shù)據(jù)處理

圖表處理運用Microsoft Excel軟件；多重差異顯著性分析運用IBM SPSS Statistics 22.0軟件。計算公式：吸附率=（初始濃度－終濃度）/初始濃度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐Cd菌株的分離與鑒定

供試土壤樣品經(jīng)梯度富集培養(yǎng)后，分離純化得到生長良好的耐Cd菌株12株，其中細菌9株，真菌3株，分別命名為 B1～B9 和 F1～F3（表 2）。從表 2 可以看出，當液體培養(yǎng)基中Cd2+初始濃度為10 mg·L－1時，B9的吸附率最高，為65.64%，其次為B2，吸附率為47.14%，其他菌株的吸附率在7.78%～30.27%之間。當液體培養(yǎng)基中Cd2+初始濃度為100 mg·L－1時，各菌株Cd2+的吸附率均低于初始濃度10 mg·L－1。其中B9的Cd2+吸附率最高，為 44.30%，其次為 B2（26.02%），其他菌株的Cd2+吸附率均較低，在5%左右。根據(jù)本實驗的目的，選取Cd2+吸附率最高的B9菌株進行深入研究。

菌株B9菌落為黃色，呈圓形，有凸起，邊緣平整，光滑濕潤（圖1a），掃描電鏡下菌體呈桿狀（圖1b）。葡萄糖發(fā)酵試驗、檸檬酸鹽試驗為陽性，淀粉水解試驗、明膠水解試驗、吲哚試驗、V-P試驗為陰性，革蘭氏染色陰性，全部與D.acidovorans生理生化特征一致。16S rRNA序列比對結(jié)果表明，B9與D.acidovorans的序列具有99%的同源性（圖1c），結(jié)合菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗，可以確定目標菌株為Delftia sp.，基因登錄號為MF679148。

表2 耐Cd菌株處理后液體培養(yǎng)基中Cd濃度的變化Table2 Variation of cadmium concentration in medium after treatment with cadmium-resistant bacteria

圖1 菌株B9的形態(tài)學特征（a）、掃描電鏡圖（b）及其16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹分析（c）Figure1 Morphological characteristic（a）,scanning electron microscopy image（b）and the phylogenetic tree of 16S rRNA（c）of strain B9

2.2 不同Cd2+濃度下的生長曲線

圖2是 Cd2+濃度分別為 0、10、100 mg·L-1下，培養(yǎng)54 h后菌株B9的生長曲線。由圖2可見，Cd2+濃度為10 mg·L-1時B9對數(shù)期后的生長量降低，與CK都是在培養(yǎng)的36 h進入穩(wěn)定期。Cd2+濃度為100 mg·L-1時延長了B9生長的延滯期，B9延遲12 h后進入對數(shù)期，且進入對數(shù)期后生長量降低，進入穩(wěn)定期后OD600在2.5左右，表明B9對Cd2+有較強的耐受性。

圖2 菌株B9生長曲線Figure2 Growth curve of strain B9

2.3 不同培養(yǎng)條件對目標菌株B9去除Cd2+效果的影響

由圖3a可見，在培養(yǎng)溫度為30℃、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時，當 pH 值從 5 增加到 8，B9 對 Cd2+的吸附量和吸附率均顯著增加；當pH=8時，Cd2+的吸附量和吸附率達到最大值6.73 mg·L－1和69.85%；當pH值繼續(xù)增加時，B9對Cd2+的吸附量和吸附率均明顯降低。當pH=9時，B9對Cd2+的吸附率為42.39%，比pH=8 低 2.64 mg·L－1?？梢?，pH 是影響 B9 吸附 Cd2+的一個因素。根據(jù)實驗結(jié)果可知，B9在pH=8的環(huán)境中對Cd2+的吸附效果最好。

由圖3b可見，在培養(yǎng)溫度為30℃、pH=7、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時，0～48 h 時，B9 隨著培養(yǎng)時間的增加對Cd2+的吸附量和吸附率顯著增加，到48 h時Cd2+的吸附量和吸附率達到最大值8.13 mg·L－1和84.37%；培養(yǎng)時間達到72 h時，吸附量比48 h時有所減少，但差異不顯著。

由圖 3c可見，在 pH=7、Cd2+初始濃度為 10 mg·L－1時，當溫度從10℃增加到30℃，B9對Cd2+的吸附量和吸附率均顯著增加；當溫度從30℃增加到40℃，兩者吸附量和吸附率均沒有顯著差異，均保持在較高的水平，吸附量在8 mg·L－1以上，吸附率在85%以上。

由圖3d可見，在培養(yǎng)溫度為30℃、pH=7、Cd2+初始濃度在10 mg·L－1以下時，吸附率都在60%以上，濃度越低吸附率越高，初始Cd2+濃度為1 mg·L－1時，吸附率達到87.07%；初始Cd2+濃度為50 mg·L－1時，吸附率下降到31.8%。而B9對Cd2+的吸附量隨著Cd2+濃度的增加而不斷增加，B9對Cd2+吸附量從0.85 mg·L－1增加到 31.28 mg·L－1。

圖3 不同培養(yǎng)條件對菌株B9吸附Cd2+效果的影響Figure3 Influence of different culture conditions on the adsorption rate of Cd from strain B9

2.4 菌株B9對土壤Cd形態(tài)的影響

添加菌株B9后土壤弱酸可溶態(tài)Cd的含量隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)出先減少后趨于平緩的趨勢。土壤培養(yǎng)至第10 d時，T1（添加3 mL菌懸液）和T2（添加10 mL菌懸液）處理土壤樣品中弱酸可溶態(tài)Cd的含量均顯著減少，分別減少44.40 mg·kg－1和45.33 mg·kg－1（表3）；在培養(yǎng)的第10 d到第30 d，T1、T2土壤樣品的弱酸可溶態(tài)Cd的含量隨著時間的推移有所變化，但沒有出現(xiàn)顯著差異。T1、T2處理與CK相比，在培養(yǎng)的30 d內(nèi)弱酸可溶態(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，T1與T2兩個處理之間除了第30 d，其他時間無顯著差異，因此添加菌株B9對土壤中弱酸可溶態(tài)Cd含量影響較大，B9兩種不同添加量影響較小。

添加菌株B9后，CK處理中可還原態(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢（表3），培養(yǎng)至第 10d 可還原態(tài) Cd 含量減少 2.89 mg·kg－1；第10 d到第30 d內(nèi)可還原態(tài)Cd含量增加14.72 mg·kg－1，這可能與培養(yǎng)時保持加水有關(guān)。T1和T2處理中可還原態(tài)Cd含量隨培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，T1、T2處理培養(yǎng)到第10 d時，可還原態(tài)Cd含量均顯著增加，比開始土壤樣品的可還原態(tài) Cd 含量分別增加 13.71、17.60 mg·kg－1；T1在培養(yǎng)的第10 d到第30 d土壤中可還原態(tài)Cd含量雖有所變化，但沒有顯著性差異，培養(yǎng)至第30 d時，比開始增加了15.17 mg·kg－1。T2在培養(yǎng)的第10 d到第20 d土壤中可還原態(tài)Cd含量雖有所變化，但與第10 d相比，沒有顯著差異；培養(yǎng)到第30 d時，可還原態(tài)Cd含量上升到 38.06 mg·kg－1，比開始增加了 20.69 mg·kg－1。T1、T2和CK三個處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)可還原態(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對土壤中可還原態(tài)Cd含量影響均較大。

添加菌株B9后，CK、T1和T2三個處理可氧化態(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時間的增加均呈現(xiàn)出減少的趨勢（表3）。CK處理的可氧化態(tài)Cd在培養(yǎng)的前5 d內(nèi)顯著減少，之后含量雖然有變化，但差異不顯著，培養(yǎng)至第 30 d 時，比開始減少了 1.81 mg·kg－1。T1處理在培養(yǎng)前10 d內(nèi)可氧化態(tài)Cd含量顯著減少，減少量為2.44 mg·kg－1；培養(yǎng)的第 10 d 到第 30 d 差異不顯著。T2處理在培養(yǎng)的第30 d比開始時可氧化態(tài)Cd含量顯著減少，減少量為 1.08 mg·kg－1。T1、T2和 CK 三個處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)可氧化態(tài)Cd的含量均無顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對土壤中可氧化態(tài)Cd含量沒有顯著影響。

表 3 菌株 B9 對土壤 Cd 形態(tài)的影響（mg·kg－1）Table3 Effect of strain B9 on the speciation of Cd in the soil（mg·kg－1）

土壤樣品中鎘的殘渣態(tài)含量變化如表3所示，CK處理中殘渣態(tài)Cd含量隨著時間的變化沒有顯著差異，T1、T2處理殘渣態(tài)Cd含量隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢。T1處理培養(yǎng)至第20 d時，殘渣態(tài)Cd含量達到最大值34.20 mg·kg－1，比開始增加了 18.67 mg·kg－1，之后含量減少；T2處理土壤樣品中Cd的殘渣態(tài)含量持續(xù)增加，培養(yǎng)至第30 d時，殘渣態(tài)Cd含量達到最大值33.13 mg·kg－1，比開始增加了17.20 mg·kg－1。T1、T2和 CK 三個處理之間在培養(yǎng)的30 d內(nèi)殘渣態(tài)Cd的含量均具有顯著性差異，因此，添加菌株B9及其添加量對土壤中可還原態(tài)Cd含量影響均較大。

圖4為經(jīng)過30 d培養(yǎng)Cd形態(tài)百分比的變化情況，可見隨著培養(yǎng)時間的延長，添加B9菌懸液的處理能顯著降低土壤中弱酸可溶態(tài)Cd含量，增加可還原態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量，可氧化態(tài)Cd含量變化不明顯。CK處理中弱酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)30 d后降至最小值，減少了4.64%。T1處理中弱酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)10 d后降至最小值，減少了22.17%。T2處理中的酸可溶態(tài)Cd含量在培養(yǎng)20 d后降至最小值，減少了25.06%。在整個培養(yǎng)過程中，T2土壤中弱酸可溶態(tài)Cd的減少量一直大于T1。CK處理的可還原態(tài)Cd含量在培養(yǎng)的第10 d降至10.02%，培養(yǎng)至第30 d上升到17.45%。T1、T2處理中可還原態(tài)Cd含量增加明顯，培養(yǎng)至第30 d時分別達到19.47%和22.10%，比開始增加了9.66%和12.17%。CK、T1、T2處理中可氧化態(tài)Cd含量由4.95%、4.88%、4.33%分別降至3.84%、3.66%、3.77%，但 T1、T2與 CK 相比，減少量都沒有明顯差異。T1、T2處理中殘渣態(tài)Cd含量明顯增加，由8.88%、9.11%分別升至22.43%、22.72%，增加了13.55%、13.61%。CK中殘渣態(tài)Cd含量變化不明顯。

圖4 添加菌株B9后各形態(tài)Cd百分比動態(tài)變化Figure4 Dynamic changes of percentage of Cd under exogenous addition strain B9

3 討論

微生物對重金屬離子的吸附，不僅因微生物種類的不同而異，還受微生物生長和吸附條件的限制，如pH、溫度、吸附時間、初始重金屬濃度等。為了達到B9對Cd2+的最佳吸附效果，研究了B9吸附培養(yǎng)液中Cd2+的環(huán)境條件。培養(yǎng)液的pH值是影響菌株B9吸附Cd2+的一個重要因素（圖3a），較低的pH值不利于重金屬Cd2+的吸附，這可能是由于在較低的pH值下，液體培養(yǎng)基中的H+與Cd2+競爭表面吸附位點。而pH較高時B9對Cd的吸附率也減少，可能是Cd2+主要以氫氧化物沉淀的形式存在，氫氧化物沉積于菌體細胞表面，影響了Cd2+與吸附位點的結(jié)合，使得吸附率下降[21]。培養(yǎng)時間也會影響B(tài)9對Cd2+的吸附效果（圖3b），72 h時的吸附率略低于48 h時的吸附率，這可能是由于菌株生長消耗營養(yǎng)物質(zhì)，使菌株生長速率降低或生物量不再增加，隨著時間的延長出現(xiàn)了解吸現(xiàn)象；或者菌株在生長代謝過程中產(chǎn)生有生物毒性的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物隨著時間積累，對菌株的生長繁殖造成影響，從而導致B9對Cd2+的吸附量減少[22]。溫度對B9吸附Cd2+的影響（圖3c）主要表現(xiàn)在菌體的吸附活性上，溫度過高或過低都會降低B9對Cd2+吸附過程所需的活化能，進而對吸附能力造成影響。很多研究[23－24]顯示Delftia.sp生長的適宜溫度在37℃左右，與本研究結(jié)果相近。Cd2+濃度變化過程中（圖3d），吸附量比吸附率更能體現(xiàn)出B9對Cd2+的吸附作用，研究表明，微生物對重金屬離子的吸附能力與細胞表面的吸附位點的飽和度有關(guān)，Cd2+初始濃度較低時，B9表面帶負電荷的活性吸附位點多，能與培養(yǎng)液中Cd2+充分結(jié)合，使吸附量增加。Cd2+初始濃度的增加導致吸附位點逐漸被占用，從而導致吸附率減少[25]，同時，Cd2+濃度高時，會對菌體生長量產(chǎn)生影響（圖2），使菌體OD600值下降，這也會減少其對Cd2+的吸附量。

雖然土壤中重金屬元素的總量可以作為評價該土壤污染水平的關(guān)鍵因素，但不能真正反映其潛在的生態(tài)危害性，重金屬元素的不同存在形態(tài)的環(huán)境行為和生態(tài)效應不同，所以分析土壤中重金屬的不同形態(tài)很有必要[26]。本試驗研究顯示，B9接種到土壤后能夠使Cd的形態(tài)發(fā)生變化，且各種形態(tài)在培養(yǎng)的第10 d幾乎達到平衡，即弱酸可溶態(tài)Cd含量減少，可還原態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量顯著增加，而可氧化態(tài)Cd含量變化不顯著，這與曹霞[27]和范文宏等[18]得出的結(jié)論類似。添加菌株B9前，土壤中Cd形態(tài)百分比表現(xiàn)為弱酸可溶態(tài)＞可還原態(tài)＞殘渣態(tài)＞可氧化態(tài)，處理后土壤中Cd形態(tài)百分比表現(xiàn)為弱酸可溶態(tài)＞可還原態(tài)≈殘渣態(tài)＞可氧化態(tài)。土壤中Cd的弱酸可溶態(tài)雖然一直占比最高，但添加B9后Cd的形態(tài)還是由有效態(tài)向難溶態(tài)轉(zhuǎn)化，這能有效降低Cd在土壤中的毒性。添加B9能使Cd的形態(tài)發(fā)生變化可能是由于B9的生命活動的分泌物或代謝產(chǎn)物使重金屬形態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，如曹裕松等[28]發(fā)現(xiàn)細菌能將Cd2+還原成難溶的CdS。B9使Cd形態(tài)發(fā)生變化也可能是由于B9對重金屬Cd的吸附富集作用，微生物可通過帶電荷的細胞表面吸附重金屬離子，或通過攝取必要的營養(yǎng)元素主動吸收重金屬離子，將重金屬離子富集在細胞表面或內(nèi)部，一些微生物能產(chǎn)生胞外聚合物（如多糖、糖蛋白、脂多糖等），其帶有大量的陰離子基團，能與金屬離子結(jié)合；某些微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（如檸檬酸）也是一種很好的金屬螯合劑。有關(guān)B9對土壤中Cd形態(tài)變化的影響機理還需進一步研究。

4 結(jié)論

（1）從重金屬污染的土壤中分離得到對Cd2+具有較高吸附率的菌株為B9，經(jīng)鑒定該菌種為Delftia sp.。

（2）通過對不同培養(yǎng)條件下菌株吸附Cd2+效果的試驗，發(fā)現(xiàn)B9在pH=8、溫度為35℃、培養(yǎng)時間為48 h條件下，對Cd2+的吸附效果最好，并且Cd2+濃度在10 mg·L-1及以下時，吸附率在60%以上。

（3）目標菌株B9能影響土壤中Cd的形態(tài)，Cd從弱酸可溶態(tài)向可還原態(tài)和殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化。不同添加量處理下，弱酸可溶態(tài) Cd含量減少 44.40、45.33 mg·kg-1，可還原態(tài)Cd含量增加15.71、20.69 mg·kg-1，可氧化態(tài)Cd含量無明顯變化，殘渣態(tài)Cd含量增加18.67、17.2 mg·kg-1。

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