蛋白質(zhì)雜化熒光金納米簇的制備及在汞離子快速檢測(cè)中的應(yīng)用

彭 濤 王見一 謝三磊 姚 凱 孫淑娟 曾于洋 江海洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京 100193)

1 引 言

貴金屬熒光納米簇是一種新型熒光納米材料，由幾個(gè)到幾百個(gè)原子組成，粒徑約為0.2～3.0 nm，接近電子的費(fèi)米波長，呈現(xiàn)獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、化學(xué)等特性，在生物分析成像、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[1～3]。熒光金納米簇(AuNCs)具有較強(qiáng)的光致發(fā)光、良好的光穩(wěn)定性、大的斯托克斯位移和高的熒光量子產(chǎn)率，是目前研究最廣泛的貴金屬熒光納米簇，已被用于過氧化氫[4]、金屬離子[5]、茶多酚[6]等的檢測(cè)。2009年，Xie等[7]以牛血清白蛋白(BSA)為配體，在溫和的條件下制備出具有紅色熒光特性的蛋白質(zhì)雜化熒光金納米簇(AuNCs@BSA)。目前，已有多種有機(jī)物用于AuNCs的合成，如樹枝狀分子或高聚物(聚酰胺、聚乙稀亞胺等)、氨基酸(脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、酶(辣根過氧化物酶、胰蛋白酶、溶菌酶、胃蛋白酶等)及一些小分子物質(zhì)(硫辛酸、二硫蘇糖醇)等[8]。因?yàn)锽SA原料易得，且以BSA為配體合成AuNCs的過程簡單、條件溫和，所以AuNCs@BSA在很多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[9～11]。

重金屬在生態(tài)環(huán)境中不易降解，且容易聚集在生物體內(nèi)，通過食物鏈傳遞進(jìn)入人體內(nèi)，對(duì)人類健康有潛在的致癌和致畸等毒性[12]。汞離子(Hg2+)是一種常見的重金屬污染物，廣泛存在于水體、土壤及食物中，Hg2+容易聚集在生物體內(nèi)，對(duì)動(dòng)物和人的大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及腎臟都有較強(qiáng)的毒性[13,14]。我國衛(wèi)生部規(guī)定飲用水中Hg2+含量不可超過1.0 μg/L[15]。目前，Hg2+的檢測(cè)方法包括電化學(xué)法[16]、比色法[17]、原子吸收光譜法[18]、質(zhì)譜法等[19]，但是這些方法大多檢測(cè)過程繁瑣、周期長。因此，建立一種快速、靈敏、便捷的Hg2+檢測(cè)方法具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

文獻(xiàn)[20]報(bào)道，Hg2+可使AuNCs@BSA的熒光發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的猝滅，所以AuNCs@BSA可作為一種熒光探針用于檢測(cè)Hg2+。本研究以BSA作為穩(wěn)定劑和還原劑，在溫和的條件下, 采用一步法將氯金酸還原，合成具有紅色熒光的AuNCs@BSA，并以其為熒光檢測(cè)探針檢測(cè)水中Hg2+。將此探針用于自來水中的Hg2+的快速靈敏檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

恒溫磁力攪拌器(德國Heigoph公司)； WFH-203 (ZF-1)三用紫外分析儀(上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司)；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

牛血清白蛋白(BSA， 99.9%)、三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/mL),均購自美國Sigma-Aldrich公司)；膠體金(實(shí)驗(yàn)室制備)[21]；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水(18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司純水儀制備)。

2.2 AuNCs@BSA的合成

所有玻璃儀器經(jīng)重鉻酸溶液浸泡24 h后，用雙蒸水沖洗干凈。根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法合成AuNCs@BSA。將BSA溶液(50 g/L)和HAuCl4溶液(0.01 mol/L)在37℃等體積混合(共12 mL)，磁力攪拌反應(yīng)2 min后，逐滴加入1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12.0，在37℃條件下攪拌反應(yīng)12 h，溶液顏色由亮黃色變?yōu)樽攸S色。將制備好的AuNCs@BSA用透析袋(100 kDa，美國Sigma-Aldrich公司)在雙蒸水中透析12 h后，用無菌離心管收集(約15 mL)，在4℃保存，于3個(gè)月內(nèi)使用。

2.3 離子檢測(cè)方法

將制備好的AuNCs@BSA用雙蒸水稀釋100倍后，加入酶標(biāo)板各孔中(50 μL/孔)，然后加入50 μL樣品，反應(yīng)2 min后，用多功能酶標(biāo)儀掃描記錄各孔在360 nm激發(fā)光下的熒光發(fā)射光譜。

2.4 檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化

以添加了Hg2+(1 μg/L)的空白樣品為陽性對(duì)照，綜合考慮陰性樣品的熒光強(qiáng)度及陽性樣品的抑制率(Inhibition rate,I, %)，確定最優(yōu)AuNCs@BSA的用量、檢測(cè)體系的離子濃度及pH值。抑制率計(jì)算公式如下：

I(%)=(1-F/F0)×100%(1)

其中，F(xiàn)和F0分別為陰性和陽性樣品的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNCs@BSA的表征及性能評(píng)價(jià)

AuNCs@BSA、BSA溶液、HAuCl4溶液、膠體金溶液在365 nm的紫外燈下的照片如圖1A所示，只有AuNCs@BSA溶液發(fā)出明顯的紅色熒光。熒光光譜表征結(jié)果(圖1B)表明，AuNCs@BSA的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為360和635 nm。高分辨掃描電鏡表征結(jié)果如圖1C所示，AuNCs@BSA呈現(xiàn)規(guī)則的單分散球形，粒徑為(2.00 ± 0.05) nm。根據(jù)文獻(xiàn)[22]報(bào)道，超小粒徑的金屬熒光納米簇具有類過氧化物酶的生物催化性。分別取500 μL H2O2和TMB溶液混勻后，加入100 μL純化后的BSA@AuNCs溶液，5 min后，溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色(圖1D)。以上結(jié)果均表明成功合成了蛋白質(zhì)雜化的熒光金納米簇[23]。因?yàn)锳uNCs@BSA的粒徑接近電子的費(fèi)米波長，它的能級(jí)譜帶變得不連續(xù)，成為不連續(xù)的離散能級(jí)，電子可在各能級(jí)間發(fā)生躍遷，從而表現(xiàn)出熒光性質(zhì)[2]。如圖1E所示，在AuNCs@BSA加入Hg2+標(biāo)準(zhǔn)品，其熒光發(fā)射光譜明顯降低，證明Hg2+可猝滅AuNCs@BSA的熒光。

圖1 AuNCs@BSA表征結(jié)果： (A) 紫外燈(360 nm)下的照片；(B) 激發(fā)和發(fā)射光譜圖；(C) 透射電鏡表征圖；(D)過氧化物模擬酶活性；(E) Hg2+猝滅AuNCs@BSA熒光。Fig.1 Characterizations of AuNCs@BSA: (A) Image under UV light illumination, (B) fluorescent spectrum, (C) transmission electron microscopy (TEM) image , (D) mimic peroxidase activiety and (E) fluorescence quenched by Hg2+.

3.2 AuNCs@BSA熒光猝滅檢測(cè)自來水中汞離子的參數(shù)優(yōu)化

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hg2+可以猝滅AuNCs@BSA的熒光。采用單一變量法對(duì)AuNCs@BSA的稀釋倍數(shù)及用量、檢測(cè)體系的pH值等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。如圖2A所示，分別用雙蒸水(ddH2O)、0.05 mol/L嗎啉乙磺酸緩沖液(MES，pH 6.0)、0.05 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 6.0)、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.0)、0.05 mol/L Tris-HCl(pH 6.0)、0.05 mol/L硼酸緩沖液(BB，pH 6.0)、0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(CB，pH 9.6)共7種溶液作為AuNCs@BSA稀釋液。結(jié)果表明，以ddH2O為稀釋液時(shí)，陰性熒光強(qiáng)度和陽性抑制率均最佳。分別將AuNCs@BSA用ddH2O稀釋10、20、40、60、80、100、150和200倍后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著AuNCs@BSA在體系中的用量增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但是陽性抑制率變化不規(guī)律，當(dāng)AuNCs@BSA稀釋100倍后檢測(cè)，陽性抑制率最高(圖2B和2C)。 隨pH值增加，陰性樣品AuNCs@BSA的熒光強(qiáng)度沒有明顯變化，但當(dāng)pH=5.0時(shí)陽性抑制率最高(圖2D)。

圖2 緩沖體系(A)、稀釋液體積(B)、稀釋倍數(shù)(C)和pH值(D)對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig.2 Optimization of (A) buffer system, (B) dilution solution volume, (C) dilution folds and (D) pH value

本方法選擇pH=5.0的ddH2O將AuNCs@BSA稀釋100倍后檢測(cè)Hg2+，靈敏度較高。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限定

由不同濃度的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、 0.5、 1、 5、 10、 50、 75、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800和900 μg/L)的熒光光譜圖(圖3A)可見，隨著Hg2+濃度增加，體系在635 nm處的熒光強(qiáng)度下降；以Hg2+濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3B所示，在75～900 μg/L之間，Hg2+濃度和熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系y=-0.27x+ 762.02(R2=0.9959)；在低濃度范圍(0.5～75 μg/L)，熒光強(qiáng)度和Hg2+的濃度對(duì)數(shù)成反比例關(guān)系，線性方程為y=-26.76lgx+ 803.1(R2=0.9951)，檢出限(LOD)為0.14 μg/L(3σ)，低于國標(biāo)規(guī)定的自來水中Hg2+的限量水平(1.0 μg/L)。如表1所示，與同類的金屬納米簇?zé)晒夥╗26,27]相比，本體系檢出限較低，線性范圍較寬，且檢測(cè)時(shí)間短。

圖3 不同濃度Hg2+的熒光光譜圖(A)及線性關(guān)系曲線(B)，插圖為0.5～75 μg/L范圍內(nèi)的校正曲線。Fig.3 Fluorescent spectra of the detection system in the presence of different concentrations of Hg2+ (A) and calibration curve (B). Inset is calibration curve in low concentration range (0.5-75 μg/L)

表1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)Hg2+的性能比較

Table 1 Comparison of different methods for Hg2+detection

檢測(cè)方法Methods檢測(cè)時(shí)間Detectiontime(min)線性范圍Linearrange(μg/L)檢出限LOD(μg/L)參考文獻(xiàn)References金納米簇?zé)晒夥℅oldnanoclustersbasedfluorescentassay30．5～7575～9000．141本方法Thiswork金納米簇?zé)晒夥℅oldnanoclustersbasedfluorescentassay239．6～668．81200～17604．64[26]銅納米簇?zé)晒夥–oppernanoclustersbasedfluorescentassay302．4～481．76[27]比色法和熒光法化學(xué)傳感器Colorimetricandfluorescentchemosensor-0～4000～40015．311．8[28]比色法Colorimetricassay>20-0～2．40．008～20．4960．0312[29][30]表面增強(qiáng)拉曼散射Surface?enhancedRamanscattering>60-0．02[31]試紙條傳感器Stripbiosensor>608×10-5～88×10-5[32]

3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

圖4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A)及Cu2+干擾消除(B)Fig.4 (A) Specificity and (B) elimination of interference of Cu2+

3.5 實(shí)際樣品分析

對(duì)北京海淀區(qū)不同區(qū)域的10個(gè)自來水樣本，用本方法對(duì)樣本中的Hg2+進(jìn)行快速檢測(cè)，10個(gè)樣本均未檢出。在空白自來水樣品中分別添加0.5、 5、 10、 50和100 μg/L的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)品，用本方法進(jìn)行檢測(cè)，回收率在86.8%～113.4%之間(n=3)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，表明本方法實(shí)用性良好。

4 結(jié) 論

本研究通過一步法合成了具有紅色熒光的蛋白質(zhì)雜化納米簇，其熒光能被Hg2+有效猝滅。通過對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了快速、 靈敏、 便捷、 準(zhǔn)確的自來水中的Hg2+的熒光檢測(cè)方法，檢出限低于國標(biāo)對(duì)于自來水中Hg2+的限量值，可用于自來水中Hg2+的檢測(cè)。

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