乳酸菌R8高密度培養(yǎng)的發(fā)酵工藝研究

吳軍林，柏建玲，莫樹平，張菊梅

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州 510663）（2.廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）

傳統(tǒng)的菌體培養(yǎng)方式僅能解決菌體生長的營養(yǎng)需求而無法解除代謝產(chǎn)物的抑制，很難從跟不上解決菌體的高密度培養(yǎng)核心技術問題。高密度培養(yǎng)是近幾年來發(fā)酵工藝的重要目標與方向之一。乳酸菌要通過高密度培養(yǎng)技術達到理想的高濃度產(chǎn)量，需要優(yōu)化一系列相關的工藝參數(shù)來對發(fā)酵過程進行嚴格的控制。通過解決這些問題，設計出合適的培養(yǎng)途徑達到理想的菌體濃度[1]。

研究報道表明，影響乳酸菌增殖的因素有很多，如菌種的活力、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)周期、培養(yǎng)液的初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量和增殖因子等，其中培養(yǎng)基的物理性質(zhì)及成分會嚴重影響到乳酸菌菌體的收集工作，所以培養(yǎng)基的選擇多選用粘度小、蛋白質(zhì)含量低的透明液。微生物需從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)以獲得能量完成自身代謝過程并合成新物質(zhì)，培養(yǎng)基是試驗室中用來培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)液，配制出能夠滿足菌體生長所需各種營養(yǎng)的培養(yǎng)基是研究菌體高密度培養(yǎng)的前提條件。高細胞密度發(fā)酵（High cell density fermentation，HCDF）是指在一定的培養(yǎng)條件和體系內(nèi)，在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎上，盡可能多的積累生物量[2]。

工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)就是要以最低的生產(chǎn)成本獲取最高的細胞或代謝產(chǎn)物收益，因此確定低成本、高效率的高密度培養(yǎng)工藝是本研究關注的焦點。本文以一株已經(jīng)證實具有耐酸、耐膽汁的乳桿菌R8菌株為材料，對其高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝進行了研究。以菌體密度（OD600）及碳源（葡萄糖）的利用情況為主要參考指標，研究了中和劑、pH、接種量、初始糖含量、通氣方式以及補料工藝等對菌體在7.5 L攪拌發(fā)酵罐內(nèi)生長的影響，并經(jīng)過對試驗菌進行250 L中試放大工藝的優(yōu)化。最終確定一條低成本、高效率的高密度培養(yǎng)工藝。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

乳桿菌R8由本項目課題組廣東省微生物研究所篩選馴化提供[3]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 MRS培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖20.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母粉 4.0 g，Tween80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，檸檬酸銨 2.0 g，CH3COONa·3H2O 5.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 6.2。

1.2.2 液體種子及發(fā)酵培養(yǎng)基-改良MRS培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖 20.0 g，酵母粉 30.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，KH2PO42.5 g，檸檬酸三銨 2.5 g，CH3COONa·3H2O 6.25 g，Tween80 1.0 mL，pH 6.2。

1.2.3 平板計數(shù)用培養(yǎng)基

改良MRS液體培養(yǎng)基加1.5%～2%瓊脂。

1.3 試驗儀器

臺式冷凍離心機SIGMA 3K15，德國；生化培養(yǎng)箱LRH-250，上海；全波長掃描分光光度計，島津；UV-1800，日本；30 L發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司GUJS-30；250 L發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司GUJS-250。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

1.4.1.1 菌種保存

菌株R8于甘油管中-20 ℃保存。

1.4.1.2 液體種子培養(yǎng)

接種于改良MRS培養(yǎng)基，接種量2%，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。

1.4.2 檢測方法

1.4.2.1 發(fā)酵液菌體干重測定

取一定體積的發(fā)酵液，離心后用無菌水洗滌兩次，再將菌體干燥后稱重即可算得菌體干重，以g/L表示。

1.4.2.2 發(fā)酵液濃度測定

取一定體積培養(yǎng)液8000 r/min離心10 min，棄上清液，用等體積的無菌生理鹽水洗滌兩次后將菌體懸浮，測定600 nm下的吸光度值。

1.4.2.3 菌液活菌數(shù)測定

菌液用梯度稀釋法稀釋到一定倍數(shù)后涂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)，結(jié)果以CFU/mL表示[4]。

1.4.3 小試初始發(fā)酵工藝

用于小試工藝研究的是一臺攪拌型生物反應器（瑞士INFORS LabforsⅢ），帶有基本的溫控、補料和通氣裝置，總?cè)莘e 7.5 L，溫度自控，可在線監(jiān)控pH值（梅特勒pH電極），并可根據(jù)需要自動流加中和劑控制pH。與其它生物反應器相比，攪拌型生物反應器更易實現(xiàn)工業(yè)化，也是迄今為止使用最為廣泛的生物反應器。

小試初始發(fā)酵工藝：將種子液以2%（V/V）接種于裝液量為70%的7.5 L小罐，攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，不通氣，恒定pH 6.2，37 ℃恒溫培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

1.4.4 分批發(fā)酵條件優(yōu)化

在小試初始發(fā)酵工藝的基礎上，分別研究以下各因素對菌體生長的影響，每一步優(yōu)化的結(jié)果都用于下一步的發(fā)酵過程中，根據(jù)不同條件下菌體的生長情況逐步確定最佳的小試發(fā)酵工藝。

1.4.4.1 不同中和劑

12.5%氨水，6 mol/L NaOH。

1.4.4.2 不同pH

pH 5.4～6.6之間每0.4個pH單位為一個梯度的不同pH值。

1.4.4.3 不同接種量

2%，5%，8%。

1.4.4.4 不同初始碳源含量

初始葡萄糖濃度分別為20 g/L，30 g/L，40 g/L，50 g/L。

1.4.4.5 不同通氣方式

持續(xù)通氮氣0.02 vvm不保壓，間歇通氮氣不保壓（每2 h，以0.2 vvm的速率通氮氣5 min），通氮氣保壓0.02 Mpa。

1.4.5 補料分批發(fā)酵模式的研究

在分批培養(yǎng)最佳條件的基礎上，以初糖20 g/L開始發(fā)酵至對數(shù)生長期時（約4 h后）開始間歇流加葡萄糖液，使發(fā)酵液中的糖濃度維持在15 g/L左右，直至發(fā)酵結(jié)束，以分批培養(yǎng)作為對照，比較分析后確定合適的培養(yǎng)模式。

1.4.6 中試發(fā)酵工藝的確定

由30 L發(fā)酵罐到250 L發(fā)酵罐逐級擴大中試規(guī)模。初始的發(fā)酵工藝條件參考小試發(fā)酵工藝，根據(jù)中試情況調(diào)整工藝條件，從而確定250 L中試規(guī)模的發(fā)酵工藝。初始發(fā)酵工藝：經(jīng)活化后的種子液以 8%接種于裝液量為70%的30 L發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速60 r/min，通過自動流加氨水控制pH 5.8，間歇通氮氣不保壓（每2 h，以0.2 vvm的速率通氮氣5 min），37 ℃恒溫發(fā)酵至結(jié)束。發(fā)酵液離心分離收集菌體，添加保護劑后冷凍干燥制成凍干菌粉。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵條件優(yōu)化

本研究以菌體密度（OD600nm）及碳源（葡萄糖）的利用情況為主要參考指標，研究了中和劑、pH值、接種量、初始糖含量、通氣方式以及補料工藝等對菌體在7.5 L攪拌發(fā)酵罐內(nèi)生長的影響，逐步優(yōu)化菌體的小試發(fā)酵工藝。

2.1.1 中和劑的選擇

菌體代謝產(chǎn)物（乳酸和乙酸等）對菌體生長的反饋抑制是影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要原因，通過流加中和劑使培養(yǎng)液的pH值維持在菌體最適生長pH范圍內(nèi)可以有效緩解這種抑制作用，從而提高菌體的生長密度。

NaOH、KOH、NH3·H2O 和 Na2CO3等都是發(fā)酵工業(yè)中常用的中和劑。針對不同的微生物或不同培養(yǎng)基質(zhì)，不同的中和劑所能達到的效果也不盡相同，本試驗主要比較NaOH和NH3·H2O這兩種中和劑對試驗菌種生長的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1可看出，使用不同的中和劑，菌體的生長過程相似，隨著菌體濃度升高，碳源（葡萄糖）逐漸被消耗。從菌體濃度看，以氨水為中和劑更利于菌體的生長，穩(wěn)定期時的OD值在5以上，碳源在發(fā)酵12 h時已基本耗盡；以NaOH為中和劑，穩(wěn)定期時菌體濃度稍遜于氨水，OD值約4.52左右，碳源在發(fā)酵12 h時仍有少量剩余。以氨水作為中和劑，既可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，也可作為氮源被菌體利用，促進菌體的生長。后續(xù)試驗都采用12.5%的氨水作為中和劑。

圖1 不同中和劑對菌體生長的影響Fig.1 The effects of different neutralizers on bacterial growth

2.1.2 不同pH對菌體生長的影響

圖2 不同pH對菌體生長的影響Fig.2 The effects of different pH on the bacterial growth

微生物都有其最適生長pH值，本試驗研究了試驗菌在pH 5.4～6.6范圍內(nèi)的生長情況，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，菌體在不同pH條件下的生長過程相似，隨著碳源的消耗，菌體濃度不斷提高，pH維持5.8發(fā)酵12 h后的菌體濃度最大，OD值6.5左右，pH維持5.4發(fā)酵12 h后的菌體濃度最低，OD值不到5，pH值為6.2和6.6的情況基本相同，最終OD值都在5～6之間。從碳源利用情況來看，pH值在5.8～6.6之間時，12 h內(nèi)糖基本耗盡，在較低pH值（5.4）發(fā)酵時，12 h后仍有少量糖剩余，說明微酸性的環(huán)境較適合菌體生長。后續(xù)試驗中pH均控制在5.8。

2.1.3 接種量對菌體生長的影響

接種量一般可以影響到菌體的增值速度，縮短延滯期，本試驗比較了2%～8%不同的接種量對菌體生長的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同接種量對菌體生長的影響Fig.3 the effects of different inoculum concentration on bacterial growth

如圖3所示，5%與8%接種量的發(fā)酵過程相近，10 h時碳源均已耗盡，菌體達最大濃度，最終菌濃與2%接種量發(fā)酵12 h時基本相同，說明提高接種量的確加快了菌體的生長速度。

菌體濃度沒有明顯提高，很可能是因為培養(yǎng)基中的碳源較早耗盡，使得菌體不能充分生長，因此將接種量定為8%，繼續(xù)培養(yǎng)基初糖濃度的優(yōu)化試驗。

2.1.4 初始糖濃度對菌體小試發(fā)酵的影響

在2.1.3接種量的研究中發(fā)現(xiàn)初始糖含量20 g/L很可能無法滿足菌體生長的實際需要，因此在小試條件下對培養(yǎng)基的初始糖濃度做進一步的優(yōu)化，以確定適宜的初始糖濃度。

試驗中將初始糖濃度從20 g/L逐漸增至50 g/L，發(fā)酵結(jié)果見圖4。

圖4 不同初始糖濃度對小試條件下菌體生長的影響Fig.4 The effects of different initial glucose concentrations on the bacterial growth in the bench-scale test

結(jié)果表明原優(yōu)化培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度確實無法滿足菌體在小試管培養(yǎng)條件下的生長需求，提高初始葡萄糖濃度后，菌體的終濃度有顯著提升，當初始葡萄糖濃度為40 g/L，菌體的終濃度最高，OD值為11.5左右，糖在12 h的發(fā)酵過程中也基本耗盡，當初始糖濃度提高到50 g/L時，菌體終濃度OD值在10以上，但發(fā)酵至穩(wěn)定期時殘?zhí)菨舛热源笥?0 g/L，說明50 g/L的初糖濃度并不能更好的促進菌體的生長。因此后續(xù)試驗中將培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度調(diào)為40 g/L。

2.1.5 不同通氣方式對菌體生長的影響

大多數(shù)乳酸菌都為厭氧或兼性厭氧菌，在發(fā)酵過程中為菌體提供適宜的厭氧環(huán)境很可能會促進菌體生長，因此本試驗研究不同的通氣條件[a.持續(xù)通氮氣0.02 vvm不保壓，b.間歇通氮氣不保壓（每2 h，以0.2 vvm的速率通氮氣5 min），c.氮氣保壓（0.02 Mpa）]對菌體生長的影響，不通氣作對照，試驗結(jié)果見圖5。

圖5 不同的通氣方式對小試條件下菌體生長的影響Fig.5 The effects of different ventilation conditions on the bacterial growth in the bench-scale test

結(jié)果表明不同的通氣條件對菌體的生長確有影響，從圖5可看出，與不通氣相比，間歇通氮氣的條件下，菌體的終濃度最高，OD值達到12以上，在持續(xù)通氮氣或用氮氣保壓的條件下，菌體終濃度比不通氣時還低，說明充足的氮氣環(huán)境或有壓力的環(huán)境均不適合菌體的生長。因此確定采用間歇通氮氣不保壓的方式進行發(fā)酵。

2.2 分批補料發(fā)酵對菌體生長的影響

圖6 補料發(fā)酵模式對菌體生長的影響Fig.6 The effects of fed batch fermentation modes on the bacterial growth

本研究目的是確定補料發(fā)酵模式是否更適于菌體的高密度培養(yǎng)，試驗中補料采用的是一種低糖流加的方式，即在低初糖濃度的條件下開始發(fā)酵，在菌體進入對數(shù)生長期時，通過間歇流加新鮮糖液使發(fā)酵液內(nèi)葡萄糖濃度維持在一個較低的水平，這種發(fā)酵方式既可以減少高濃度底物對菌體生長產(chǎn)生的抑制效應，也可在發(fā)酵過程中對發(fā)酵液產(chǎn)生一定的稀釋效應以減少某些代謝產(chǎn)物對菌體生長的抑制作用。

試驗方法見1.3，以不補料的前期優(yōu)化后的小試工藝作對照（前期優(yōu)化后的小試工藝為：將種子液以8%（V/V）的接種量接種于裝液量70%的小罐，初糖濃度40 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，間歇通氮氣維持一定的厭氧環(huán)境，自動流加12.5%的氨水控制pH值恒定在5.8，37 ℃恒溫發(fā)酵），試驗結(jié)果見圖6。

從圖6可看出，補料發(fā)酵的條件下，菌體的快速增殖期延長至16 h，菌體最終濃度的OD值在12以上，這與無補料批式發(fā)酵12 h所達到的最終菌濃相當，說明低糖流加的補料發(fā)酵方式并不比批發(fā)酵方式更優(yōu)，反而在工藝上更加復雜。因此采用簡單易控的批發(fā)酵方式進行菌體的高密度培養(yǎng)更為合適。

2.3 中試發(fā)酵實驗結(jié)果

為實現(xiàn)菌體的規(guī)模化生產(chǎn)，經(jīng)過試驗室小試研究后，采用30 L和250 L的發(fā)酵罐進行逐級放大的中試發(fā)酵工藝研究。

初始發(fā)酵工藝參數(shù)參考小試，因30 L及250 L罐采用的是一檔6斜葉，兩檔6平葉的三檔攪拌漿，相比小罐的兩檔6平葉攪拌槳混勻效果更好，所以攪拌轉(zhuǎn)速降為60 r/min。

30 L罐發(fā)酵試驗結(jié)果見圖7，從菌體的生長情況及碳源的利用情況看與小試培養(yǎng)基本一致，菌體的終濃度也與小試相當，OD值12左右。說明由小試到30 L罐的放大過程是可行的。

250 L罐的種子液需由30 L罐發(fā)酵制備，種子液的制備過程主要分為控制pH值與不控制pH值兩種情況，因此分別用兩種方式得到的對數(shù)期中期（發(fā)酵7 h）的種子液接種250 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵控制工藝同30 L罐，結(jié)果見圖7、8。

圖7 30 L罐發(fā)酵過程曲線Fig.7 The fermentation progress curve of 30 L tank

圖8 不同種子液對250 L中試發(fā)酵的影響Fig.8 The effects of different seed solutions on 250 L pilot-scale fermentation

由圖7，8可看出，不控制pH的種子液在對數(shù)生長期時的菌體濃度要比控制pH的種子液低，同時因發(fā)酵液的pH值不同，菌體的生理狀態(tài)也不同，作為種子接入250 L發(fā)酵罐后的生長情況也會有所不同。通過比較a、b兩圖，可看出控制pH的種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵后生長速度相對較快，發(fā)酵10 h菌體已經(jīng)達最大濃度，OD值12左右，與小試培養(yǎng)的結(jié)果無差異，說明30 L到250 L的中試放大過程可行。經(jīng)過對試驗菌中試放大工藝的優(yōu)化，最終250 L規(guī)模所得發(fā)酵液的活菌濃度約為3.8×109CFU/mL，經(jīng)真空冷凍干燥所得的菌粉活菌濃度約為7.4×1010CFU/g。最后確定250 L中試發(fā)酵工藝為：將控制pH 5.8，37 ℃恒溫發(fā)酵7 h左右的種子液以 8%接種量接種于裝液量為 70%的250 L發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速60 r/min，自動流加氨水控制pH 5.8，間歇通氮氣不保壓（每2 h以0.2 vvm的速率通氮氣5 min），37 ℃恒溫發(fā)酵10 h左右結(jié)束。

3 結(jié)論

3.1 乳酸菌在培養(yǎng)過程中能分解培養(yǎng)基中的糖類而產(chǎn)生以乳酸為主的有機酸。由于代謝產(chǎn)物的積累會抑制菌體的生長，采用常規(guī)方法培養(yǎng)時，其培養(yǎng)液中的活菌數(shù)只能達到107～108CFU/mL?，F(xiàn)有的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法主要有緩沖鹽法、化學中和法和滲析法[5]，可以使培養(yǎng)液中活菌數(shù)達到109CFU/mL；另外還有細胞循環(huán)培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法、補料分批培養(yǎng)法和微囊化培養(yǎng)法等[6]，可使培養(yǎng)液中活菌數(shù)最高達到 1011CFU/mL。但是細胞循環(huán)培養(yǎng)存在膜容易污染，不能實現(xiàn)長時間的連續(xù)操作等問題；透析培養(yǎng)法存在設備投資大，對操作技術要求高等問題。本實驗綜合化學中和法和補料分批培養(yǎng)法等方法以菌體密度（OD600）及碳源（葡萄糖）的利用情況為主要參考指標，研究了中和劑、pH值、接種量、初始糖含量、通氣方式以及補料工藝等對菌體在7.5 L攪拌發(fā)酵罐內(nèi)生長的影響，逐步優(yōu)化菌體的小試發(fā)酵工藝為：將種子液以8%（V/V）的接種量接種于裝液量 70%的小罐，初糖濃度40 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，間歇通氮氣維持一定的厭氧環(huán)境，自動流加12.5%的氨水控制pH值恒定在5.8，37 ℃恒溫發(fā)酵。

3.2 經(jīng)過對試驗菌中試放大工藝的優(yōu)化，最終250 L規(guī)模所得發(fā)酵液的活菌濃度約為 8×109CFU/mL，經(jīng)真空冷凍干燥所得的菌粉活菌濃度約為 1.2×1011CFU/g。最后確定250 L中試發(fā)酵工藝為：將控制pH 5.8，37 ℃恒溫發(fā)酵7 h左右的種子液以8%接種量接種于裝液量為 70%的 250 L發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速 60 r/min，自動流加氨水控制pH 5.8，間歇通氮氣不保壓（每2 h以0.2 vvm的速率通氮氣5 min），37 ℃恒溫發(fā)酵10 h左右結(jié)束。

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