基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS的“散茶發(fā)花”茯茶加工前后的物質(zhì)變化分析

黃浩，鄭紅發(fā)，趙熙，鐘妮，黃建安，劉仲華

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）（2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128）（3.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

歷年來，我國(guó)西北地區(qū)游牧民族日常生活以牛、羊肉及奶制品等高脂、高熱量食物為主。由于蔬菜的缺乏，日常生活中，傳統(tǒng)茯茶（茯磚茶）被人們作為膳食纖維添加而被廣泛攝取，氣候特點(diǎn)與飲食習(xí)慣造就了該茶在邊疆地區(qū)的興起，茯茶逐漸成為了人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?，“寧可三日無糧，不可一日無茶”[1～3]的美譽(yù)在邊疆地區(qū)的流傳見證了茯茶在我國(guó)邊疆地區(qū)的蓬勃發(fā)展；生活水平的提升與健康理念的加強(qiáng)，現(xiàn)代化茯茶加工工藝的發(fā)展及創(chuàng)新型茯茶產(chǎn)品的涌現(xiàn)推動(dòng)了茯茶產(chǎn)業(yè)鏈的快速形成和高速發(fā)展，顯著地提升了茯茶制品的流通量，如今，茯茶制品的銷售地區(qū)也由過去的邊疆地區(qū)逐漸向內(nèi)陸地區(qū)甚至全世界迅速擴(kuò)張。

茯茶特有的“發(fā)花”工藝造就了其獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)與保健功效[4,5]，現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)了由“發(fā)花”工藝給茶葉品質(zhì)成分與功能成分帶來的巨大改變。然而，以往的研究多數(shù)是通過對(duì)茯茶成品中單一成分或單一類別化合物的分離、提制及簡(jiǎn)單的常量成分的含量檢測(cè)來推斷茯茶品質(zhì)與功能形成的機(jī)理[6]，缺乏對(duì)“發(fā)花”工藝帶來的具體差異以及茯茶整體生化成分組成的變化規(guī)律研究?；谝合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）的代謝組學(xué)是目前植物、食品代謝組學(xué)研究中應(yīng)用較廣泛的方法[7～9]，其特點(diǎn)是可以通過高通量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與大規(guī)模計(jì)算，以系統(tǒng)生物學(xué)為基本出發(fā)點(diǎn)全面地研究生物機(jī)體代謝的變化規(guī)律，本研究利用不同茶類成分組成的差異及代謝組學(xué)的分析特點(diǎn)對(duì)不同原料加工而成的茯茶“發(fā)花”前后樣品的整體生化成分組成的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，以期從茶樣整體生化成分組成變化規(guī)律來考察與揭示“發(fā)花”的機(jī)理，為多樣化茯茶制品的開發(fā)及茯茶產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“金花”菌-冠突散囊菌（Eurotium cristatum），為本實(shí)驗(yàn)室自藏菌株[10,11]，分離自益陽(yáng)茶廠股份有限公司產(chǎn)茯磚茶（800 g裝，產(chǎn)于2007年）。

2013年產(chǎn)大紅袍（烏龍茶，福建武夷山，A），2010年產(chǎn)紅茶（紅茶，常德石門，B），2008年金湘益茯磚茶原料（黑茶，湖南益陽(yáng)，E）。按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求采用以上三種不同茶類為原料進(jìn)行“散茶發(fā)花”[12]處理（n=6），恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10 d即結(jié)束“發(fā)花”，“發(fā)花”茶樣經(jīng)70 ℃、4 h干燥即可，編號(hào)后置-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹13]。

乙腈（色譜純，美國(guó)MERCK）；甲醇（色譜純，美國(guó)MERCK）；甲酸（色譜純，美國(guó)MERCK）；超純水（Millipore超純水儀自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta 320 pH計(jì)（Mettler）；Motic B1光學(xué)顯微鏡（Motic公司）；萬分之一電子天平（Mettler AE240），MIKRO-35高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)產(chǎn)）；蘇凈超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)）；振蕩恒溫培養(yǎng)箱（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（江蘇環(huán)保儀器廠）；高溫高壓滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）等；冷凍干燥儀（廣州倍立思有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Switzerland，Buchi）；液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)（UPLC-MS/MS），包括 Acquity UPLCTMsystem（Waters Corp., Milford, MA, USA），以及Waters公司G2-S質(zhì)譜檢測(cè)器，ESI離子源、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）；0.22 μm微濾過濾頭（Millpore）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三種茶類“散茶發(fā)花”茯茶制備與茶湯制備

按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求將各茶類原料加水至相同最終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，放置培養(yǎng)箱控溫、濕度培養(yǎng) 10 d，“發(fā)花”結(jié)束后放置70 ℃恒溫干燥箱中4 h即可取出封存。

準(zhǔn)確稱取干燥茶樣2.0 g至250 mL具塞三角瓶，加沸水100 mL置90 ℃水浴鍋中浸提30 min，期間每10 min搖瓶一次，浸提結(jié)束后精細(xì)抽濾于100 mL容量瓶中冷卻并定容，混勻備用[14,15]。分析檢測(cè)樣品需經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過濾。

1.3.2 三種茶類“散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異化合物分析

1.3.2.1 三種茶類“散茶發(fā)花”茯茶發(fā)酵前后UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

色譜條件：液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)（UPLC-MS/MS），包括 Acquity UPLCTMsystem（Waters Corp., Milford, MA, USA），色譜柱：BEH C18column（i.d. 2.1 mm*50 mm, particle size 1.7 μm, Waters Corp., Milford, MA, USA），流動(dòng)相A為水相，5%乙腈（包含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B為有機(jī)相，95%乙腈（包含0.1%甲酸），柱溫45 ℃，流速為0.2 mL/min；梯度條件為：0～1 min，B：10%；1～13 min，B：10～100%；16～16.2 min，B：10%；16.2～20 min，B：10%[16]。

質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子模式以及Waters公司G2-S質(zhì)譜檢測(cè)器（含 ESI離子源、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）），毛細(xì)管電壓（capillary voltage）為3 kV，采樣錐電壓（sample cone voltage）為50 V；脫溶劑氣流（desolvation gas flow）為600 L/h，反吹氣流量（cone gas flow）為 60 L/h，脫溶劑氣溫度（desolvation temperature）為350 ℃，源溫度（source temperature）為100 ℃，質(zhì)量掃描范圍：50～1200 m/z[17]。

1.3.2.2 數(shù)據(jù)分析

采用美國(guó)Waters公司的型號(hào)為G2-S的質(zhì)譜儀，通過正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍為50～1200 m/z，采集數(shù)據(jù)得到原始數(shù)據(jù)。通過Masslynx軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，將質(zhì)譜檢測(cè)到的所有發(fā)酵物的峰進(jìn)行峰對(duì)齊，歸一化分析，自動(dòng)譜峰判別處理，再應(yīng)用多維統(tǒng)計(jì)方法分析所得數(shù)據(jù)[18]。運(yùn)用主成分分析將質(zhì)譜分析所得的多維數(shù)據(jù)降低到二維空間，最終以圖形的形式展示數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，分別對(duì)烏龍茶（大紅袍）、紅茶、黑茶（金湘益）三種茶葉發(fā)酵前與發(fā)酵10 d后樣品運(yùn)用偏最小二乘法-判別分析，建立PLS-DA的模型，從得分圖中可以直觀的觀察到供試茶樣之間的分離情況，同時(shí)從載荷圖中找到得分圖中相對(duì)應(yīng)的數(shù)軸，以不同數(shù)軸中離散的點(diǎn)來表示實(shí)驗(yàn)組對(duì)模型分離起貢獻(xiàn)作用的發(fā)酵產(chǎn)物，圖中向上的峰和向下的峰也可以表示這些發(fā)酵產(chǎn)物，從而找出差異發(fā)酵產(chǎn)物。通過變量重要性分析設(shè)定VIP值，將VIP值大于2的差異發(fā)酵物找出，再通過T檢驗(yàn)得到相應(yīng)的P值，觀察P值來決定變量是否具有差異，p<0.05視為有顯著差異，p<0.01視為有極顯著差異。最后，通過質(zhì)荷比匹配到相應(yīng)的分子式，通過數(shù)據(jù)庫(kù)[19]（www.hmdb.ca, Chemspider等）搜索得到一些相匹配的物質(zhì)，并對(duì)這些物質(zhì)的分子分別打碎一一進(jìn)行碎片離子掃描得到碎片離子譜圖，通過結(jié)構(gòu)分析進(jìn)一步確定其歸屬，同時(shí)結(jié)合相關(guān)領(lǐng)域的文獻(xiàn)報(bào)道，找出具體差異化學(xué)成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 茯茶制備

按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求將各茶葉原料加水至相同終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，放置培養(yǎng)箱控溫濕度培養(yǎng)10 d，“發(fā)花”結(jié)束后放置70 ℃恒溫干燥箱中4 h即可取出封存。經(jīng)各茶樣“發(fā)花”茯茶實(shí)物圖比對(duì)發(fā)現(xiàn)，相同劑量和相同時(shí)間“發(fā)花”處理的“發(fā)花”茶樣均表現(xiàn)出“金花”滿批，除外觀形態(tài)有細(xì)微差別外，其他并無表現(xiàn)出明顯差異性。圖1為三種茶類原料的茯茶“發(fā)花”實(shí)照?qǐng)D。

圖1 三種茶類“散茶發(fā)花”茯茶實(shí)照?qǐng)DFig.1 The photographs of Fu tea processed by “Fungal fermentation” with three tea materials

圖2 大紅袍茯茶“發(fā)花”前后正、負(fù)離子TIC圖比較Fig.2 Comparison of positive and negative total ion chromatograms (TIC) of Fu tea processed by “Fungal fermentation” with Dahongpao tea

2.2 三種茶樣原料加工的茯茶LC-MS色譜圖

圖3 紅茶制茯茶“發(fā)花”前后正、負(fù)離子TIC圖比較Fig.3 Comparison of positive and negative total ion chromatograms (TIC) of Fu tea processed by “Fungal fermentation” with Black tea

將各茶樣供試茶湯經(jīng)0.22 μm微濾膜過濾后進(jìn)樣LC-MS，得到各茶樣發(fā)酵前后的正、負(fù)離子模式的LC圖譜2、3和4，由圖可知，在正、負(fù)離子模式下，這3組茶樣發(fā)酵前后的峰與保留時(shí)間是比較相似的，各茶樣經(jīng)“發(fā)花”處理后，生化成分發(fā)生了一定程度的變化，這在圖譜上的保留時(shí)間及峰高、低能直觀觀察到，但當(dāng)樣本間存在較小的差異時(shí)在分析過程中必須對(duì)所得峰進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，形成數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)而作下一步分析。

圖4 金湘益磚茶原料制茯茶“發(fā)花”前后正、負(fù)離子TIC圖比較Fig.4 Comparison of positive and negative total ion chromatograms (TIC) of Fu tea processed by “Fungal fermentation” with the raw material of Jinxiangyi brick tea

2.3 PCA與PLS-DA對(duì)三組茶樣原料“散茶發(fā)花”前后差異代謝物分析

在大紅袍制茯茶PCA得分圖5中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)對(duì)應(yīng)的樣本，從圖中看出“發(fā)花”前和“發(fā)花”后樣本在PC1和PC2兩種主成分中呈現(xiàn)出分離狀態(tài)，說明兩組樣本是有差異的，而圖5載荷圖上的離散點(diǎn)則代表得分圖分離的變量，離散度越高，對(duì)得分圖貢獻(xiàn)越大；建立PLS-DA模型以論證每組茶樣的PCA與PCA-DA的分析結(jié)果（圖6），從而研究各組茶樣在“發(fā)花”處理后的物質(zhì)變化規(guī)律，為每組茶樣鑒定出具體差異發(fā)酵物。

圖5 大紅袍制茯茶正、負(fù)離子模式PCA得分圖與載荷圖Fig.5 Score plot and load diagram of positive and negative PCA of the Fu tea processed by Dahongpao

通過T檢驗(yàn)對(duì)“發(fā)花”前與“發(fā)花”后的每個(gè)發(fā)酵物進(jìn)行計(jì)算求出p值，p<0.05則認(rèn)為有顯著差異，p<0.01則認(rèn)為有極顯著差異。由此得到具有差異性的發(fā)酵物的質(zhì)荷比，并將這些有差異的發(fā)酵物分子進(jìn)行碎片離子掃描，根據(jù)質(zhì)荷比及其碎片信息搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

圖6 大紅袍制茯茶正、負(fù)離子模式PLS-DA得分圖與載荷圖Fig.6 Score plot and load diagram of positive and negative PLS-DA of the Fu tea processed by Dahongpao

根據(jù)以上分析流程，分析到大紅袍制茯茶“發(fā)花”前后的差異變量共有49個(gè)，為分析差異物的顯著性本研究采用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，如表1所示，大紅袍“發(fā)花”前后差異代謝物中EGCG、GCG、ECG、CG等酯型兒茶素均表現(xiàn)出極顯著下降，且下降幅度均超90%。除兒茶素類外，沒食子酸、氨基酸類以及少量的酯類等19個(gè)化合物均呈不同程度的下降，而簡(jiǎn)單兒茶素除GC無明顯差異外，EC、DL-C、EGC的含量較原料有25%～40%的幅度升高，原花青素與茶葉中幾種重要的生物堿也表現(xiàn)出相同變化，其中除可可堿與茶堿外，咖啡堿、黃嘌呤與次黃嘌呤含量均表現(xiàn)出極顯著升高；值得注意的是，幾種常見的茶葉中主要的黃酮化合物，槲皮素、山奈酚、牡荊素和蘆丁的含量均有增加，升高的幅度依次為 78%、63%、75%和65%；而大黃素則是在大紅袍“發(fā)花”結(jié)束后新增的一種蒽醌類化合物。

圖7 紅茶制茯茶正、負(fù)離子模式PCA得分圖與載荷圖Fig.7 Score plot and load diagram of positive and negative PCA of the Fu tea processed by Black tea

圖8 紅茶制茯茶正、負(fù)離子模式PLS-DA得分圖與載荷圖Fig.8 Score plot and load diagram of positive and negative PLS-DA of the Fu tea processed by Black tea

紅茶制茯茶PCA得分圖7中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)對(duì)應(yīng)的樣本，從圖中可以看出發(fā)酵前和發(fā)酵后樣本在PC1和PC2兩種主成分中呈現(xiàn)出分離狀態(tài)，說明兩組樣本是有差異的，而圖7載荷圖上的離散點(diǎn)則代表得分圖分離的變量，離散度越高，對(duì)得分圖貢獻(xiàn)越大；建立PLS-DA模型以論證每組茶樣的PCA與PCA-DA的分析結(jié)果，從而研究各組茶樣在“發(fā)花”處理后的物質(zhì)變化規(guī)律，為每組茶樣鑒定出具體差異發(fā)酵物。通過T檢驗(yàn)對(duì)發(fā)酵前與發(fā)酵后的每個(gè)發(fā)酵物進(jìn)行計(jì)算求出P值，p<0.05則認(rèn)為有顯著差異，p<0.01則認(rèn)為有極顯著差異。

由此得到具有差異性的發(fā)酵物的質(zhì)荷比，并將這些有差異的發(fā)酵物分子進(jìn)行碎片離子掃描，根據(jù)質(zhì)荷比及其碎片信息搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

圖9 金湘益磚茶原料制茯茶正、負(fù)離子模式PCA得分圖與載荷圖Fig.9 Score plot and load diagram of positive and negative PCA of the Fu tea processed by the raw material of Jinxiangyi brick tea

根據(jù)以上分析流程，分析到紅茶制茯茶發(fā)酵前后的差異變量共有40個(gè)，為分析差異物的顯著性本研究采用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

圖10 金湘益茯磚茶原料制茯茶正、負(fù)離子模式PLS-DA得分圖與載荷圖Fig.10 Score plot and load diagram of positive and negative PLS-DA of the Fu tea processed by the material of Jinxiangyi brick tea

如表 2所示，紅茶“發(fā)花”前后差異代謝物中EGCG、GCG、ECG和CG等酯型兒茶素均呈極顯著下降，下降幅度均超90%。其中EGCG與GCG則沒有在發(fā)花成品中監(jiān)測(cè)到，除兒茶素類外，沒食子酸、氨基酸類以及少量的酯類等 18個(gè)化合物均呈不同程度的下降，而簡(jiǎn)單兒茶素除GC無明顯差異外，EC、DL-C、EGC的含量較原料有40%～55%的幅度升高，茶葉中幾種重要的生物堿也相同的變化，幾種香氣物質(zhì)如紫羅蘭葉醛也有所增加在，增加幅度達(dá)50%，值得注意的是，4種常見的的黃酮化合物槲皮素、山奈酚、牡荊素和蘆丁的含量均有不同程度升高，升高的幅度依次為56%、51%、75%和78%；而大黃素則是在紅茶“發(fā)花”結(jié)束后新增的一種蒽醌類化合物。

在金湘益磚茶原料茯茶PCA得分圖9中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)對(duì)應(yīng)的樣本，從圖中可以看出發(fā)酵前和發(fā)酵后樣本在PC1和PC2兩種主成分中呈現(xiàn)出分離狀態(tài)，說明兩組樣本是有差異的，而圖9載荷圖上的離散點(diǎn)則代表得分圖分離的變量，離散度越高，對(duì)得分圖貢獻(xiàn)越大；建立PLS-DA模型以論證每組茶樣的PCA與PCA-DA 的分析結(jié)果（圖 10），從而研究“發(fā)花”前后茶樣在“發(fā)花”處理后的物質(zhì)變化規(guī)律，為每組茶樣鑒定出具體差異發(fā)酵物。通過T檢驗(yàn)對(duì)發(fā)酵前與發(fā)酵后的每個(gè)代謝物進(jìn)行計(jì)算求出p值，p<0.05則認(rèn)為有顯著差異，p<0.01則認(rèn)為有極顯著差異。由此得到具有差異性的發(fā)酵物的質(zhì)荷比，并將這些有差異的發(fā)酵物分子進(jìn)行碎片離子掃描，根據(jù)質(zhì)荷比及其碎片信息搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

根據(jù)以上分析流程，分析到金湘益磚茶原料茯茶發(fā)酵前后的差異變量共有49個(gè)，為分析差異物的顯著性本研究采用 SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，如表3所示，金湘益磚茶原料“發(fā)花”前后差異代謝物中EGCG、GCG、ECG、CG等酯型兒茶素全部表現(xiàn)為極顯著下降趨勢(shì)，下降均超90%。

除兒茶素外，沒食子酸、氨基酸類以及少量酯類等25個(gè)化合物均有不同程度的下降；而簡(jiǎn)單兒茶素除GC 無明顯差異外，EC、(±)-C、EGC 等較原料均有30%～60%的幅度升高；原花青素與茶葉中幾種重要的生物堿Caffeine、Theobromine、Theophylline、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤表現(xiàn)出相同的變化；值得注意的是，幾種常見黃酮化合物槲皮素、山奈酚、牡荊素、蘆丁和香橙素的含量都有升高，升高的幅度依次為75%、20%、72%和71%；常見香氣物質(zhì)2,6二甲基吡嗪的含量在“發(fā)花”結(jié)束后升高幅度達(dá)66%，大黃素則是在天尖茶原料“發(fā)花”結(jié)束后新增的一種蒽醌類化合物。

表1 大紅袍“散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異代謝物Table 1 Different metabolites before and after the processing of ‘Fungal fermentaiton’ of Fu tea processed by Dahongpao

2 4 G l y c e r i c a c i d/甘油酸 8.3 ±0.9 3.8 ±0.6**2 5 O x a l a t e/草酸 1 2.3 ±1.1 6.7 ±0.5**2 6 M a l o n i c a c i d/丙二酸 0.9 ±0.1 0.4 ±0.0 5**2 7 G l y c e r o l/甘油 0.4 ±0.0 3 0.2 ±0.0 3*2 8 G l y c o l i c a c i d/羥基乙酸 1.5±0.2 0.6 ±0.1**2 9 L y s i n e/賴氨酸 3.4 ±0.7 1.5±0.2**3 0 G l y c i n e/甘氨酸 2.9 ±0.6 1.2 ±0.1**3 1 L e u c i n e/亮氨酸 3.3 ±0.3 1.8 ±0.2*3 2 2,6-D i m e t h y l p y r a z i n e /2,6 二甲基吡嗪 1 6.2 ±1.2 7.9 ±0.8*3 3 M e t h y l p e n t a n o a t e/戊酸甲酯 2 2.7 ±2.1 1 2.3 ±1.3*3 4 M e t h y l h e x a n o a t e/己酸甲酯 7.3 ±0.7 3.2 ±0.3**3 5 T h e o p h y l l i n e/茶堿 4 4.9 ±8.2 5 7.6±4.3 *3 6 T h e o b r o m i n e/可可堿 9 2 2±3 0 8 1 1 0 5±1 2 0*3 7 C a f f e i n e/咖啡堿 4 8 8 5±8 8 3 6 1 8 0±5 5 2**3 8 X a n t h i n e/黃嘌呤 0.9 ±0.1 1.7 ±0.2**3 9 H y p o x a n t h i n e/次黃嘌呤 6.4 ±1.1 1 2.7 ±1.4**4 0 A r o m a d e n d r i n/香橙素 8.3 ±1.2 1 8.2 ±1.4**4 1 G l u c o s y l i s o m a l t o l/異麥芽酚葡糖苷 7.4 ±1.6 1 4.9 ±1.9**4 2 3-M e t h y l b u t y l b e n z o a t e /3-甲基丁酯苯甲酸 2.3 ±0.3 5.4 ±0.2**4 3 M a n n i t o l/甘露醇 1 1.3±1.8 2 3.3 ±4.4**4 4 P u r i n e t r i o n e/尿酸 5.7 ±1.6 1 0.8 ±1.0**4 5 3,4',5-T r i h y d r o x y-3',7-d i m e t h o x y f l a v a n o n e/3,4',5-三羥基-3',7 二甲氧基黃酮 5.9 ±1.1 9.1 ±1.3*4 6 5-E t h y l-2-m e t h y l p y r i d i n e /5-甲基-2-乙基吡啶 4 3.1 ±5.5 6 4.2 ±2.6*4 7 2,6-D i-t e r t-b u t y-4-e t h y l p h e n o l/2,6-二叔丁基-4-乙基苯酚 7.4 ±1.6 1 3.0 ±2.7*4 8 P a n a x a c o l/人參酮炔醇 4.3 ±0.8 7.3 ±1.3*4 9 R h e u m e m o d i n/大黃素 0 1.4±0.2**

表2 紅茶“散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異代謝物Table 2 Different metabolites before and after the processing of “Fungal fermentaiton” of Fu tea processed by Black tea

1 5 E C/表兒茶素 4 1 8±2 0 0 7 0 1±1 7**1 6 (±)-C/兒茶素 6 2 7.5±1 0 0 1 3 8 0±2 8 3**1 7 E G C/表沒食子兒茶素 4 7 ±1 8 8±1 7**1 8 A s p a r a g i n i c a c i d/天門冬氨酸 8.6 ±0.5 1 5.0 ±0.7*1 9 S e r i n e/絲氨酸 1 4.7 ±4.2 7.6 ±1.0**2 0 O x a l a t e/草酸 1 6.1 ±1.1 5.4±0.6**2 1 M a l o n i c a c i d/丙二酸 1 5.3 ±0.9 7.6 ±1.2*2 2 L y s i n e/賴氨酸 1 1.0 ±0.7 6.3 ±0.5*2 3 L e u c i n e/亮氨酸 1 8.9 ±1.7 6.5 ±0.7**2 4 2,6-D i m e t h y l p y r a z i n e/2,6 二甲基吡嗪 1 7.7 ±1.1 8.4 ±0.9**2 5 2-m e t h y l p y r a z i n e/2-甲基吡嗪 2.3 ±0.1 7.8 ±0.6**2 6 M e t h y l h e x a n o a t e/己酸甲酯 3.2 ±0.4 1 0.6 ±1 1**2 7 M e t h y l b u t y r a t e/丁酸甲酯 1 4.2 ±1.2 6.0 ±1.1**2 8 T h e o p h y l l i n e/茶堿 5 6.6±9.7 1 1 8.5±0.7**2 9 T h e o b r o m i n e/可可堿 1 1 0 9±4 1 2 2 5 3 0±4 2**3 0 C a f f e i n e/咖啡堿 8 4 0 0±9 7 6 1 0 9 5 0±6 3 6**3 1 H y p o x a n t h i n e/次黃嘌呤 2.7 ±0.2 5.6 ±1.0**3 2 A d e n i n e/腺嘌呤 1 9.6 ±1.5 5.0 ±0.7**3 3 3,4',5-T r i h y d r o x y-3',7-d i m e t h o x y f l a v a n o n e/3,4',5-三羥基-3',7 二甲氧基黃酮 4.7 ±0.5 2.2 ±0.1**3 4 5-E t h y l-2-m e t h y l p y r i d i n e/5-甲基-2 甲基吡啶 9.0 ±0.8 4.0 ±1.0**3 5 2,6-D i-t e r t-b u t y-4-e t h y l p h e n o l/2,6-二叔丁基-4-乙基苯酚 1 1.9 ±1.8 3 4.2 ±3.1**3 6 2-A c e t y l-5-m e t h y l f u r a n/2-乙?；谆秽?1 3.3 ±1.1 7.6 ±0.9*3 7 V i o l e t-l e a f a l d e h y d e/紫羅蘭葉醛 1 0.2 ±1.1 2 1.3 ±1.5**3 8 3,5-D i m e t h y l-2-(1-p r o p e n y l)p y r a z i n e/3,5-二甲基-2-(1-丙烯基)吡嗪 1 3.3 ±1.2 7.7 ±0.4*3 9 2-A c e t y l p y r r o l e/乙基吡咯 1 2.6 ±0.7 5.9 ±0.8**4 0 R h e u m e m o d i n/大黃素 0 2.0±0.2**

表3 金湘益原料“散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異代謝物Table 3 Different metabolites before and after the processing of “Fungal fermentaiton” of Fu tea processed by the raw material of Jinxiangyi brick tea

1 4 G C/沒食子兒茶素 1 1 1 5± 5 1 1 6 5 ±2 7 1 5 E C/表兒茶素 9 8 7±2 7 4 2 6 8 0±2 5 6**1 6 (±)-C/兒茶素 2 8 1 0±4 9 5 4 1 5 5±1 3 4**1 7 E G C/表沒食子兒茶素 1 4 3 0 ±1 9 2 3 4 3 5 ±4 5 5**1 8 A s p a r a g i n i c a c i d/天門冬氨酸 3 0.7 ±4.2 1 8.5 ±2.3**1 9 A l a n i n e/丙氨酸 6.8 ±1.1 2.3 ±0.6**2 0 S e r i n e/絲氨酸 7.3 ±0.3 5.2 ±0.7*2 1 M a l i c a c i d/蘋果酸 1 6.9 ±2.1 7.8 ±1.1*2 2 S u c c i n i c a c i d/琥珀酸 1 0.5 ±1.7 5.3 ±0.8**2 3 O x a l a t e/草酸 1 7.3 ±1.5 8.9 ±1.3**2 4 M a l o n i c a c i d/丙二酸 1 9.2 ±2.2 1 0.3 ±1.4*2 5 G l y c e r o l/甘油 2.6 ±0.3 0.8 ±0.0 4**2 6 G l y c o l i c a c i d/羥基乙酸 1 7.5 ±2.4 1 2.9 ±2.2*2 7 G l y c i n e/甘氨酸 0.7 9 ±0.0 3 0.3 8 ±0.0 2**2 8 L e u c i n e/亮氨酸 1 9.7 ±1.8 9.9 ±0.7**2 9 2,6-D i m e t h y l p y r a z i n e /2,6 二甲基吡嗪 5.2 ±0.6 1 1.8 ±2.1**3 0 M e t h y l p e n t a n o a t e/戊酸甲酯 6.8 ±0.8 2.6 ±0.3**3 1 M e t h y l h e x a n o a t e/己酸甲酯 2.1 ±0.2 0.9 ±0.0 4**3 2 T h e o p h y l l i n e/茶堿 1 6 8 ±3 7 2 1 3±4 **3 3 T h e o b r o m i n e/可可堿 7 0 2±1 6 2 8 7 6±6*3 4 C a f f e i n e/咖啡堿 6 5 6 0±4 8 1 7 7 0 0±2 5 4*3 5 X a n t h i n e/黃嘌呤 3.7 ±0.5 9.6 ±1.3**3 6 H y p o x a n t h i n e/次黃嘌呤 4.8 ±0.7 1 2.3 ±2.3**3 7 A r o m a d e n d r i n/香橙素 2 9.8 ±3.4 4 2.3 ±9.8**3 8 G l u c o s y l i s o m a l t o l/異麥芽酚葡糖苷 9.5 ±1.2 1 8.5 ±3.1**3 9 M a n n i t o l/甘露醇 3.6 ±0.4 1.8 ±0.3**4 0 3,4',5-T r i h y d r o x y-3',7-d i m e t h o x y f l a v a n o n e/3,4',5-三羥基-3',7 二甲氧基黃酮 0.9 9 ±0.1 2 0.4 3 ±0.0 3**4 1 5-E t h y l-2-m e t h y l p y r i d i n e /5-甲基-2-乙基吡啶 2 3.2 ±2.7 1 1.7±2.2**4 2 P a n a x a c o l/人參酮炔醇 1 2.3 ±1.4 4.7 ±0.9**4 3 2-A c e t y l p y r r o l e/2-乙基吡咯 3.9 ±0.7 8.7 ±1.6**4 4 2-m e t h y l p y r a z i n e /2-甲基吡嗪 1 5.7 ±2.3 7.8 ±2.1*4 5 2-A c e t y l-5-m e t h y l f u r a n/2-乙?；?5-甲基呋喃 2 2.9 ±2.7 1 4.3 ±1.7*4 6 A d e n i n e/腺嘌呤 1 6.3 ±4.2 8.2 ±2.1*4 7 3,5-D i m e t h y l-2-(1-p r o p e n y l)p y r a z i n e/3,5-二甲基-2-(1-丙烯基)吡嗪 9.7 ±0.8 4.8 ±0.5*4 8 M e t h y l b u t y r a t e/丁酸甲酯 0.5 ±0.0 3 0.2 3 ±0.0 1**4 9 R h e u m e m o d i n/大黃素 0 2.2±0.1**

3 結(jié)論

3.1 本研究運(yùn)用UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)，對(duì)基于不同原料的茯茶“散茶發(fā)花”加工前后的茶葉樣本進(jìn)行了代謝物分析，結(jié)果顯示，各茶樣“發(fā)花”前后的化學(xué)成分發(fā)生了顯著的變化，且分別從大紅袍、紅茶與金湘益磚茶原料制茯茶的“發(fā)花”前后找到了 49、40和49種重要的且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異性代謝物，研究中采用的三種茶類茯茶樣本（烏龍茶、紅茶與黑茶），跨茶類原料雖在茶葉品質(zhì)與內(nèi)在生化成分組成和含量上存在著一定差異，但經(jīng)相同“發(fā)花”處理后，這種差異被不同程度的縮小，綜合三種茶葉加工茯茶“發(fā)花”前后的差異代謝物結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)不同茶樣加工的茯茶可以從兒茶素類、氨基酸類、生物堿類及黃酮類總體類別上分析和討論“發(fā)花”處理帶來的物質(zhì)變遷規(guī)律。

3.2 兒茶素是茶葉中具有較強(qiáng)抗氧化作用的重要活性成分，主要分為酯型兒茶素與簡(jiǎn)單兒茶素，各類茶葉中兒茶素含量各有不同，通常以綠茶中含量占優(yōu)，本研究結(jié)果顯示，各茶葉加工的茯茶“發(fā)花”前后差異顯著代謝物中酯型兒茶素（EGCG/GCG/ECG/CG）均呈現(xiàn)出極顯著下降趨勢(shì)（p<0.01）（表1、2和3），此類物質(zhì)的變化主要與其自動(dòng)氧化和酶促氧化相關(guān)，兒茶素類較不穩(wěn)定，較為容易被水解酶水解形成簡(jiǎn)單兒茶素與沒食子酸，這與各茶樣制茯茶中部分簡(jiǎn)單兒茶素含量上升相符；同時(shí)微生物參與的發(fā)酵會(huì)在一定程度上產(chǎn)生有機(jī)酸從而使茶樣處于酸性條件下，兒茶素類結(jié)構(gòu)中的氫較為活潑容易發(fā)生聚合反應(yīng)，進(jìn)而形成黃烷醇類及原花青素類化合物，三種茶葉制茯茶“發(fā)花”樣本中的原花青素含量較其對(duì)應(yīng)原料均有不同程度的升高恰證實(shí)了這一點(diǎn)。

3.3 氨基酸類化合物是茶葉中一類重要的品質(zhì)、功能化合物，其對(duì)增進(jìn)茶湯鮮爽滋味具有積極作用，同時(shí)在黑茶加工中，氨基酸還是微生物能夠直接利用的重要含氮化合物。其中茶氨酸是茶葉中一種重要的特異游離氨基酸，其通常占茶葉總氨基酸的50%以上[20]。研究證明在黑茶加工中其很容易被水解為谷氨酸與谷氨酰胺進(jìn)而造成其含量顯著降低，三種茶樣加工茯茶中的茶氨酸與其他主要游離氨基酸均呈極顯著下降，其中含量占優(yōu)勢(shì)的茶氨酸分別下降大紅袍79%、紅茶83%、金湘益原料74%，其原因可能是微生物分泌的孢外酶與微生物熱將其水解后作為維持生長(zhǎng)繁殖的碳源和氮源；同時(shí)，氨基酸類還能與多酚類、兒茶素類等氧化聚合形成色素或沉淀；此外，在黑茶加工的發(fā)酵過程中在高溫、熱的條件發(fā)生氧化與降解從而導(dǎo)致其含量下降顯著。

3.4 生物堿是茶葉中又一重要且具有刺激大腦中樞神經(jīng)作用的活性化合物，茶葉中的生物堿主要有咖啡堿，可可堿和茶堿。研究證明，黃嘌呤、次黃嘌呤、可可堿與茶堿均能作為合成咖啡堿的前提物質(zhì)，因而可以推測(cè)這幾種化合物在“發(fā)花”過程中應(yīng)表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，三種茶樣加工的茯茶中幾種重要生物堿含量的升高證實(shí)了這一變化趨勢(shì)，同時(shí)也間接說明此研究中所用的供試真菌-“金花”菌具可能具有分泌咖啡堿合成酶的能力。

3.5 黃酮類化合物是茶葉中除兒茶素外又一重要的生物活性成分，茶葉中通常以黃酮苷形式存在[21]。本研究結(jié)果顯示幾種常見的黃酮化合物槲皮素、山奈酚、牡荊素、蘆丁、楊梅酮、香橙素和柚皮素均被檢測(cè)為顯著差異代謝物，其中前四種在各茶樣加工的茯茶中均有不同程度的上升，而含量占有的槲皮素與山奈酚分別增加大紅袍78%和63%、紅茶56%和51%、金湘益原料75%和20%，這與之前的研究結(jié)果一致[22]，而后三種則是呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律。這可能與其在茶葉中的含量及發(fā)花的周期相關(guān)，前四種為茶葉中黃酮苷化合物的主要糖基配體，在經(jīng)“發(fā)花”處理后，黃酮苷化合物被水解為相應(yīng)黃酮，但又因“發(fā)花”時(shí)間相對(duì)較短，因而其在成品中維持了一定的含量，反之則被氧化消耗而導(dǎo)致其含量進(jìn)一步降低[22]。另外三種茶樣制茯茶中又一差異代謝物3,4',5-三羥基-3',7二甲氧基黃酮是Ali從植物(Blumea balsamifera)中首次分離到[23]，此研究結(jié)果顯示三種茶葉制茯茶中該物質(zhì)均有檢測(cè)到且較其原料都有所降低。

3.6 此外，大黃素是在三種茶樣制茯茶中新增的一種蒽醌類化合物，該物質(zhì)在茯磚茶功能成分分離與“金花”菌的發(fā)酵產(chǎn)物分離純化研究中均有報(bào)道[24]，因此筆者推測(cè)大黃素為“金花”菌的特異次級(jí)代謝產(chǎn)物。

[1]傅冬和,劉仲華,黃建安,等.高通量篩選研究茯磚茶降脂功效[J].茶葉科學(xué),2006,26(3):209-214 FU Dong-he, LIU Zhong-hua, HUANG Jian-an, et al.Research of FUZHUAN Tea’s Therapy for Hyperlipidemia by High-Throughput Screening [J]. Journal of Tea Science,2006, 26(3): 209-214

[2]楊撫林,鄧放明,趙玲艷,等.黑茶微生物學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(1): 81-84 YANG Fu-lin, DENG Fang-ming, ZHAO Ling-yan, et al.Development of black tea microbiology [J]. Journal of Microbiology, 2006, 26(1): 81-84

[3]肖文軍,任國(guó)譜,傅冬和,等.茯茶輔助調(diào)節(jié)血脂作用研究[J].茶葉科學(xué),2007,27(3):211-214 XIAO Wen-jun, REN Guo-pu, FU Dong-he, et al. Study on the regulation of blood lipid by Fuzhuan tea [J]. Journal of Tea Science, 2007, 27(3): 211-214

[4]Fu D, Ryan E P, Huang J, et al. Fermented Camellia sinensis,Fu Zhuan Tea, regulates hyperlipidemia and transcription factors involved in lipid catabolism [J]. Food Research International, 2011, 44(9): 2999-3005

[5]Li Q, Liu Z, Huang J, et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(6): 1310-1316

[6]王增盛,施兆鵬,劉仲華,等.論茯磚茶品質(zhì)風(fēng)味形成機(jī)理[J].茶葉科學(xué),1991,11:49-55 WANG Zeng-sheng, SHI Zhao-peng, LIU Zhong-hua, et al.Discussion on the mechanism of quality and flavor formation of Fuzhuan brick tea [J]. Journal of Tea Science, 1991, 11(增刊): 49-55

[7]Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. ‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica, 1999,29(11): 1181-1189

[8]Fiehn O. Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes [J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48(1-2):155-171

[9]Keller A C, Weir T L, Broeckling C D, et al. Antibacterial activity and phytochemical profile of fermented Camellia sinensis(fuzhuan tea) [J]. Food Research International, 2013,53(2): 945-949

[10]黃浩,劉仲華,黃建安,等.“發(fā)花”散茶中“金花”菌的分離鑒定[J].茶葉科學(xué),2010,5:350-354 HUANG Hao, LIU Zhong-hua, HUANG Jian-an, et al.Isolation and identification of ‘Jinhua’ fungi from the Loose tea with ‘Fungus Growing’ [J]. Journal of Tea Science, 2010,30(5): 350-354

[11]黃浩,鄭紅發(fā),趙熙,等.不同茶類發(fā)花茯茶中“金花”菌的分離、鑒定及產(chǎn)黃曲霉毒素分析[J].食品科學(xué),2017,38(8):49-55 HUANG Hao, ZHENG Hong-fa, ZHAO Xi, et al.Identification and aflatoxin production of ‘golden flora’ fungi isolated from fu tea produced from different kinds of tea [J].Journal of Food Science, 2017, 38(8): 49-54

[12]黃浩.“散茶發(fā)花”的微生物與化學(xué)機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014 HUANG Hao. Study the microorganisms and chemical mechanism in the processing of ‘fungal fementation with loose tea’ [D]. Changsha: Hunan Agricultral University, 2014

[13]Qin J-H, Li N, Tu P-F et al. Change in tea polyphenol and purine alkaloid composition during solid-state fungal fermentation of postfermented tea [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(5): 1213-1217

[14]Yang X R, Ye C X, Xu J K et al. Simultaneous analysis of purine alkaloids and catechins in Camellia sinensis,Camellia ptilophylla and Camellia var. kucha by HPLC [J]. Food Chemistry, 2007, 100(3): 1132-1136

[15]Zhang L, Li N, Ma Z-Z et al. Comparison of the chemical constituents of aged Pu-erh tea, ripened Pu-erh tea, and other teas using HPLC-DAD-ESI-MSn[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(16): 8754-8760

[16]陳紅霞.普洱茶發(fā)酵過程的代謝組學(xué)研究[D].北京:北京化工大學(xué),2013 CHEN Hong-xia. A Metabonomic study during Pu-erh tea fermentation [D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2013

[17]Xie Guoxiang, Wang Yungang. Characterization of pu-erh tea using chemical andmetabolic profiling approaches [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(8):3046-3054

[18]Fan Twm, Lane An, Higashi Rm. The Handbook of Metabolomics [M]. Totowa: Humana Press, 2012

[19]Rafael Llorach, Ignacio Garrido. Metabolomics study of human urinary metabolome modifications after intake of almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) skin polyphenols[J]. Journal of Proteome Research, 2010, 9(11): 5859-5867

[20]肖會(huì)敏,何悅,黃敬群,等.HPLC法測(cè)定茶中茶氨酸、茶堿與咖啡因的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2012,27(3):200-202 XIAO Hui-min, HE Yue, HUANG Jing-Qun, et al.Determination of theanine, theophylline and caffeine in tea by HPLC [J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2012, 27(3):200-202

[21]宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,第三版,2003 WAN Xiao-chun. Tea biochemistry [M]. Beijing: Chinese Agricultural Press, the third edition, 2003

[22]黃浩,趙熙,黃懷生,等.茯茶“散茶發(fā)花”加工前后差異化學(xué)成分的分離與鑒定[J].茶葉科學(xué),2016,36(1):27-37 HUANG Hao, ZHAO Xi, HUANG Huai-sheng, et al.Isolation and identification of variant phytochemical in the processing of Fu Tea by fungal fermentation with loose tea[J]. Journal of Tea Science, 2016, 36(1): 27-37

[23]Ali D, Wong K, Lim P. Flavonoids from Blumea balsamifera[J]. Fitoterapia, 2005, 76(1): 128-130

[24]彭曉赟,梁法亮,李冬利,等.茯磚茶中冠突散囊菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性研究[J].中草藥,2013,44(14):5 PENG Xiao-yun, LIANG Fa-liang, LI Dong-li, et al.Secondary metabolites of Eurotium cristatum from Fu Brick Tea and their biological activities [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2013, 44(14): 5