響應(yīng)面優(yōu)化千日紅酪氨酸酶抑制活性成分的提取工藝

穆燕，胡松青

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，廣東深圳 518055）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

酪氨酸酶是一種生物體內(nèi)催化黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，與生物體的重要生理過(guò)程密切關(guān)系，其活性的異常過(guò)量表達(dá)既可導(dǎo)致人體的色素沉著性疾病產(chǎn)生[1]，抑制酪氨酸酶的活性可降低L-DOPA合成多巴醌的速率，從而降低黑色素的合成速率，減輕黑色素的異常沉積以達(dá)到祛斑美白的目的[2]。然而傳統(tǒng)的美白活性成分（如汞及其化合物、氫醌等）具有細(xì)胞毒性、刺激性、致敏性及不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，目前已被禁用于化妝品中。因此，尋找新一代天然、安全和高效的植物美白活性成分成為近幾年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[3]。千日紅是一種具有美白祛斑功效的植物，目前，已從千日紅中分離香豆素、阿魏酸和一些黃酮類(lèi)物質(zhì)等[4]，但是，由于已有研究并不以從千日紅研究開(kāi)發(fā)酪氨酸酶為目的，如黃良琴等從千日紅中提取揮發(fā)油并研究其化學(xué)成分[5]，劉存瑞等對(duì)千日紅中的色素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究[6]；李金花等測(cè)量了千日紅中多糖的含量[7]；劉星堦等確定了千日紅祛痰有效成分[8]，然而，作為一種具有美白祛斑作用的花茶，鮮有人對(duì)關(guān)于千日紅對(duì)酪氨酸酶抑制作用進(jìn)行深入研究。本文采用溶劑提取法提取粗提物，探討具有美白祛斑作用的千日紅粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，進(jìn)而研究不同的提取條件對(duì)不同中藥類(lèi)植物中酪氨酸酶抑制活性成分的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析相結(jié)合考察浸提時(shí)間、浸提溫度、溶劑濃度、液料比對(duì)提取效果的影響，以確定最適的提取工藝參數(shù)。研究結(jié)果對(duì)開(kāi)發(fā)天然植物來(lái)源酪氨酸酶抑制劑并應(yīng)用于化妝品、食品和藥物領(lǐng)域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原料

千日紅：產(chǎn)地云南，購(gòu)自廣州清平市場(chǎng)；L-酪氨酸，生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司；酪氨酸酶，生化試劑，美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；Sunrise酶標(biāo)儀，瑞士 TECAN公司；KR 251高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；PB-10pH計(jì)、BSA224S萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)sartorius公司；SHA-B恒溫振動(dòng)器，常州澳華儀器有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯式培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酪氨酸酶活性的測(cè)定

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)原理

酪氨酸或者多巴在酪氨酸酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為多巴色素，多巴色素在475 nm處具有特征吸收，因此，可以通過(guò)比色法測(cè)定酪氨酸酶的活性。

1.3.1.2 試劑配制

（1）1 mol/L氫氧化鉀溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取氫氧化鉀11.20 g，用脫氣的去離子水溶解，冷卻后移入200 mL容量瓶中定容，轉(zhuǎn)移到膠塞試劑瓶中待用。

（2）pH 6.8磷酸緩沖溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫鉀6.80 g，用1 L去離子水溶解后，用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)pH至6.8。

（3）1.0 mmol/L單酚底物的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取L-酪氨酸酶0.0181 g，用pH 6.8磷酸緩沖溶液溶解后移入100 mL容量瓶定容，搖勻后移入試劑瓶于4 ℃保存待用。

1.3.1.3 酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[9,10]的測(cè)定方法并作適當(dāng)修改。將 110 μL的L-酪氨酸溶液分別加入96孔板的三個(gè)孔中，記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，在1號(hào)孔中加入70 μL樣品溶劑，在2、3孔中加入已配制好的待測(cè)樣品溶液70 μL，然后，在1、2號(hào)孔加入30 μL酪氨酸酶溶液（溶于pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液），用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液將三個(gè)孔內(nèi)的溶液體積補(bǔ)至 210 μL，體系中酶的終濃度為173 U/mL。

將反應(yīng)液于30 ℃孵育30 min后，在492 nm處測(cè)其吸光值，計(jì)為A1、A2、A3，按式（1）計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率（%IR）：

其中，A1-底物、酪氨酸酶在樣品溶劑存在下體系反應(yīng)30 min的吸光度；A2-底物、酪氨酸酶在抑制劑存在下體系反應(yīng)30 min的吸光度；A3-底物、抑制劑反應(yīng)30 min的吸光度。

1.3.2 酪氨酸酶活性抑制成分的提取

稱(chēng)取5 g（干基）千日紅，加入250 mL 50%（V/V）乙醇溶液，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，60 ℃下提取3 h后中速濾紙抽濾，將濾過(guò)液去溶劑減壓濃縮干燥，過(guò)濾棄渣，將濾過(guò)液于55 ℃真空濃縮干燥，加入50%（V/V）乙醇溶液定容至100 mL，測(cè)定粗提液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率數(shù)據(jù)。

1.3.3 千日紅中酪氨酸酶抑制活性成分提取的單因素實(shí)驗(yàn)

（1）浸提溫度的影響

稱(chēng)取5 g（干基）中藥類(lèi)植物，加入250 mL 50%（V/V）乙醇溶液，分別在20、40、50、60和80 ℃水浴振蕩2 h，過(guò)濾棄渣，將濾過(guò)液于55 ℃真空濃縮干燥，加入50%（V/V）乙醇溶液定容至100 mL，待測(cè)。

（2）浸提時(shí)間的影響

稱(chēng)取 5 g（干基）中藥類(lèi)植物，加入 250 mL 50%(V/V)乙醇溶液，在50 ℃水浴分別振蕩0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 h，過(guò)濾棄渣，將濾過(guò)液于55 ℃真空濃縮干燥，加入50%(V/V)乙醇溶液定容至250 mL，待測(cè)。

（3）液料比的影響

稱(chēng)取5 g（干基）中藥類(lèi)植物，分別加入250 mL 50%(V/V)乙醇溶液按照液料比20、30、40、50和100 mL/g(V/M)加入100、150、200、250和500 mL 50%(V/V)乙醇溶液，在50 ℃水浴振蕩2 h，過(guò)濾，55 ℃真空濃縮干燥，加入50%(V/V)乙醇溶液定容至100 mL待測(cè)。

（4）乙醇濃度的影響

稱(chēng)取5 g(干基)中藥類(lèi)植物，分別加入20、40、50、60和80%(V/V)乙醇水溶液250 mL，在50 ℃水浴振蕩2 h，過(guò)濾棄渣，將濾過(guò)液于55 ℃真空濃縮干燥，加入50%(V/V)乙醇溶液定容至100 mL，待測(cè)。

1.3.4 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[11,12]

以中藥類(lèi)植物提取物對(duì)酪氨酸酶活性%IR抑制率為目標(biāo)函數(shù)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化浸提溫度、浸提時(shí)間、液料比和乙醇濃度等主要提取條件參數(shù)。

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化千日紅中酪氨酸活性抑制成分的提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。按照方程xi=(Xi-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼（xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，Xi（0）為中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)），以自變量的編碼值+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平[13]。以提取物酪氨酸酶活性的抑制率%IR為響應(yīng)值。

x1=(X1-70)/10；x2=(X2-2)/1；

x3=(X3-50)/10；x4=(X4-40)/10。

假設(shè)由最小二乘法擬合的響應(yīng)值與自變量之間的相關(guān)關(guān)系的多元二次回歸方程為：

其中，A0為常數(shù)項(xiàng)，A1、A2、A3、A4為線(xiàn)性系數(shù)，A12、A13、A14、A23、A24、A34為交互項(xiàng)系數(shù)，A11、A22、A33、A44為二次項(xiàng)系數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用OriginPro 8.0數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行處理，并用t檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性（p<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 千日紅的乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

圖1 不同濃度千日紅粗粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of crude extract with various concentrations from GG on tyrosinase activity

不同濃度千日紅的乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制規(guī)律如圖1所示。由圖1看出，在實(shí)驗(yàn)所選的濃度范圍內(nèi)，千日紅的乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性具有很明顯的抑制效果，且呈濃度依賴(lài)性，即隨著千日紅乙醇粗提物濃度的增大，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也增加。對(duì)千日紅乙醇粗提物濃度與酪氨酸酶活性抑制率的變化規(guī)律進(jìn)行線(xiàn)性擬合，可以得到其關(guān)系方程為：

其中，IR-酪氨酸酶的抑制率，%；C-千日紅乙醇粗提物的質(zhì)量濃度，mg/mL。

擬合曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)的平方 R2=0.99，說(shuō)明線(xiàn)性擬合是有效的。根據(jù)擬合方程，可以計(jì)算千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的IC50=3.32 mg/mL。

千日紅作為一種美容花茶，具有降火消炎、排毒養(yǎng)顏、延緩衰老、活血養(yǎng)顏和美膚祛斑等作用，常飲能調(diào)理氣血、養(yǎng)顏消斑、美白皮膚，使皮膚光滑富有光澤和彈性，而且，對(duì)治療內(nèi)分泌紊亂引起的黃褐斑、雀斑、色斑和暗瘡等有明顯療效。實(shí)際上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明千日紅對(duì)黑色素合成的關(guān)鍵限速酶-酪氨酸酶的催化活性有顯著的抑制作用。

2.2 千日紅中酪氨酸酶抑制有效組分的乙醇提取研究

2.2.1 浸提溫度的影響

圖2 浸提溫度對(duì)千日紅乙醇提取物中酪氨酸酶抑制成分的活性影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the the activity of tyrosinase inhibitor in the ethanol extracts from GG

在不同浸提溫度下，從千日紅中提取的乙醇粗提物的重量及其對(duì)酪氨酸酶活性的影響如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著提取溫度的上升，粗提物的質(zhì)量增大，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，溶劑的粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，提取液的擴(kuò)散系數(shù)增加，促使浸提速度加快。但當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃后，千日紅的乙醇粗提物質(zhì)量之增幅減小后逐漸趨于平緩。在溶劑相同的情況下，不同浸提溫度所提的粗提物成分大致相同，只是所提的活性成分的質(zhì)量存在一定程度的差異，故隨著粗提物質(zhì)量的增大，將其定容到相同體積時(shí)粗提液中酪氨酸酶抑制活性成分濃度增大，其對(duì)酪氨酸酶的抑制率隨之增大。也就是說(shuō)，千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率隨溫度上升而增大，與提取質(zhì)量呈正相關(guān)趨勢(shì)，這也說(shuō)明千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有濃度依賴(lài)性。

2.2.2 浸提時(shí)間的影響

圖3 浸提時(shí)間對(duì)千日紅乙醇粗提物中酪氨酸酶抑制成分的活性影響Fig.3 Effects of extraction time on the the activity of tyrosinase inhibitor in the ethanol extracts from GG

浸提時(shí)間影響到溶劑與不同細(xì)胞位置活性物質(zhì)的接觸程度。隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑能夠滲透到千日紅細(xì)胞組織的更多部位，與細(xì)胞活性物質(zhì)有更多的接觸并溶解，從而提高有效成分的提出效果。用乙醇水溶液從千日紅中浸提不同時(shí)間，乙醇粗提物的重量及其對(duì)酪氨酸酶活性的變化如圖3所示。從該圖可知，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，千日紅乙醇粗提物的質(zhì)量不斷增加，但當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到2 h后，所提物質(zhì)的質(zhì)量增幅緩慢趨于平緩。同時(shí)，千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在3 h達(dá)到最大值，粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性基本維持穩(wěn)定，不再增加。說(shuō)明，在此條件下，千日紅乙醇粗提物中酪氨酸酶活性物質(zhì)的溶出已經(jīng)達(dá)到平衡，繼續(xù)增加時(shí)間不會(huì)有更多的活性物質(zhì)被提取出來(lái)。

2.2.3 液料比的影響

不同的液料比會(huì)影響到活性物質(zhì)的提取速度和最終提取率。液料比過(guò)低，因溶劑量少，活性物質(zhì)不能被充分提取出來(lái)，這會(huì)影響到提取率。液料比過(guò)高，雖然能充分溶解活性物質(zhì)，但是會(huì)增大提取溶劑的用量，并加大后續(xù)濃縮的負(fù)荷。在不同液料比下，從千日紅中提取的乙醇粗提物的重量及其對(duì)酪氨酸酶活性的影響如圖4所示。從圖4可以看出，隨著提取液料比的增大，提取的粗提物質(zhì)量迅速增加，當(dāng)液料比達(dá)到50 mL/g(V/M)時(shí)，所千日紅乙醇粗提物提物質(zhì)不會(huì)隨著液料比的增加而明顯增加。所得千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制規(guī)律與粗提物的質(zhì)量變化呈正相關(guān)變化，也在50 mL/g(V/M)達(dá)到最大值。

圖4 液料比對(duì)千日紅乙醇粗提物中酪氨酸酶抑制成分的活性影響Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the the activity of tyrosinase inhibitor in the ethanol extracts from GG

2.2.4 乙醇濃度的影響

圖5 乙醇濃度對(duì)千日紅乙醇粗提物中酪氨酸酶抑制成分的活性影響Fig.5 Effects of ethanol concentration on the activity of tyrosinase inhibitor in the ethanol extracts from GG

采用不同體積濃度的乙醇水溶液從千日紅中提取有效成分，乙醇粗提物的重量及其對(duì)酪氨酸酶活性的變化如圖5所示。從圖5可知，千日紅的乙醇粗提物的質(zhì)量隨著乙醇濃度的增大而不斷降低，在乙醇濃度超過(guò)60%(V/V)時(shí)，總粗提物的質(zhì)量明顯減少。根據(jù)相似相溶原理，低濃度的乙醇水溶液可以溶解植物中的極性成分，如蛋白質(zhì)、淀粉和鞣質(zhì)等，而這些物質(zhì)是構(gòu)成植物細(xì)胞的主要成分，所提取的粗提物重量也就最大。而且，隨著乙醇濃度在 20%(V/V)～80%(V/V)范圍內(nèi)變化時(shí)，千日紅的乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果首先不斷增強(qiáng)，在乙醇濃度達(dá)到為40%～50%(V/V)時(shí)出現(xiàn)極大值，隨后，隨著乙醇濃度的增加，粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用下降，咎其原因可能是，低濃度乙醇水溶液提取大量的蛋白質(zhì)、淀粉、鞣質(zhì)等強(qiáng)極性成分對(duì)酪氨酸酶基本沒(méi)有抑制作用，而且，適當(dāng)增加乙醇濃度，有利于具有酪氨酸抑制活性成分的浸出，但是過(guò)大的乙醇濃度沒(méi)有起到有效溶解酪氨酸酶活性成分的目的，使得所提取的千日紅乙醇粗提物的酪氨酸酶抑制率下降，可見(jiàn)，乙醇濃度是影響千日紅中酪氨酸酶抑制活性物質(zhì)提取的重要因素。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù) 2.2節(jié)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert8.05b統(tǒng)計(jì)軟件中Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，以浸提溫度X1（℃）、浸提時(shí)間X2（h）、液料比X3（mL/g（V/M））、乙醇濃度X4（%（V/V））4個(gè)因子為自變量，分別標(biāo)記為A、B、C和D。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，四者的取值范圍確定為 60～80 ℃、1～3 h、40～60 mL/g、30～50%。

以千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表 1，各因素和水平見(jiàn)表2。采用Design-Expert 8.5b軟件，按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的安排進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表2中。

表1 試驗(yàn)自變量因素編碼及水平Table 1 The code and level of factors for the trial

應(yīng)用Design-Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得多元二次方程見(jiàn)公式4。對(duì)式4的數(shù)學(xué)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表 3。由方差分析結(jié)果可以得到以下信息：

（1）模型p<0.0002，說(shuō)明該模型極顯著。

（2）模型的失擬項(xiàng)p=0.0615>0.05，沒(méi)有顯著性意義，說(shuō)明，數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

（3）模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.8022，表明該模型擬合程度較好，同時(shí)，該模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)有較好的擬合性，在選取的自變量變化范圍內(nèi)，可用于響應(yīng)值變化的分析和預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 RSM experimental designs and results

（4）由表3對(duì)回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型中一次項(xiàng)中提取溫度和提取時(shí)間極顯著（p<0.01），說(shuō)明，溫度和時(shí)間是提取過(guò)程中的關(guān)鍵因素。而乙醇濃度顯著(p<0.05)，二次項(xiàng)系數(shù)X12極顯著（p<0.01），交互項(xiàng)系數(shù)X1X4顯著（p<0.05），其他項(xiàng)均不顯著。該模型反映，在千日紅酪氨酸酶活性成分的提取過(guò)程中，對(duì)于 RSM 所選取的影響因素和影響水平內(nèi)，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)活性成分的提取影響最為顯著，其次是乙醇濃度，液料比不顯著，提取溫度和乙醇濃度有顯著的交互作用。通過(guò)比較式（2）中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小，可以直接判斷因子影響的主次性。由式（4）方程可知，提取溫度對(duì)酪氨酸酶活性成分的得率影響最大，其次是提取時(shí)間，再次是乙醇濃度，最后是液料比。

（5）將表2中的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值采用OriginPro 8.0對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t-檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兩組數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著差異（p=0.9999），說(shuō)明，模型可靠。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA of response surface quadratic model

2.3.2 交互因子效應(yīng)分析

由回歸模型方差分析結(jié)果可知，溫度和乙醇濃度的交互項(xiàng)顯著，根據(jù)回歸方程，應(yīng)用 Design Expert 8.5b軟件，繪制溫度因素和乙醇濃度因素的響應(yīng)曲線(xiàn)及其等高線(xiàn)，如圖 6所示，其他交互項(xiàng)因沒(méi)有顯著性，未列出。

圖6 溫度和乙醇濃度對(duì)千日紅乙醇粗提物IR影響的響應(yīng)面分析圖（時(shí)間2 h，液料比50 mL/g）Fig.6 Response surface analysis for the effect of temperature and ethanol concentration on the inhibition rate of ethanol extracts from GG

由圖6響應(yīng)曲面分析的立體圖和等高線(xiàn)圖可知，固定浸提時(shí)間和液料比不變，響應(yīng)值會(huì)隨著浸提溫度和乙醇濃度的升高而增大，且增幅較大。乙醇濃度與溫度因素交互時(shí)，響應(yīng)值出現(xiàn)最高點(diǎn)，在單因素實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制劑具有極值點(diǎn)，與溫度因素交互后，最大值出現(xiàn)在乙醇濃度為50%，說(shuō)明溫度會(huì)影響有機(jī)溶劑對(duì)植物細(xì)胞的穿透性。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行最優(yōu)化分析，以千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最適提取條件為：提取溫度為 80 ℃、提取時(shí)間為3 h、液料比為59.99 mL/g(V/M)、乙醇濃度為49.96%(V/V)，在此條件下，所得千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為54.94%。

考慮到實(shí)際情況，在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)將最適提取條件調(diào)整為：提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為3 h、液料比為 60 mL/g(V/M)、乙醇濃度為 50%(V/V)，在此最適工藝參數(shù)條件下，做了三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，并采用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行單樣本t-檢驗(yàn)，實(shí)測(cè)千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為（53.86±2.11）%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。表明，該模型可靠，采用該模型優(yōu)化的工藝參數(shù)具有可行性。

3 小結(jié)

以酪氨酸酶活性抑制率為指標(biāo)，研究千日紅粗提物對(duì)酪氨酸酶活性影響的基礎(chǔ)上，探討了提取溫度、提取時(shí)間、液料比和乙醇濃度等因素對(duì)千日紅中酪氨酸酶抑制活性成分提取的影響，并應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法對(duì)四個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，小結(jié)如下：

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)考察各因素對(duì)從千日紅中提取酪氨酸酶抑制活性成分的影響，結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)所選的參數(shù)范圍，乙醇粗提物重量及酪氨酸酶抑制活性隨著浸提溫度的升高、浸提時(shí)間的延長(zhǎng)、液料比增大而增大，而乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于活性成分較好的溶出。

3.2 應(yīng)用RSM優(yōu)化了從千日紅中提取酪氨酸酶抑制活性組分的各因素，發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)所選的參數(shù)范圍內(nèi)，各因素對(duì)千日紅乙醇粗提物中酪氨酸酶抑制活性成分的活性影響顯著性依次是：提取溫度>提取時(shí)間>乙醇濃度>液料比，并確定了最佳提取條件：提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為3 h、液料比為60 mL/g(V/M)、乙醇濃度為50%(V/V)。在此條件下，RSM 模型預(yù)測(cè)千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為 54.94%，實(shí)測(cè)千日紅乙醇粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率為（53.86±2.11）%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。

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