可食性復合涂膜對滑子菇采后貯藏品質的影響

郭瑞，朱丹，宋靜雅，李文香，程凡升

（1.青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島 266109）（2.青島農業(yè)大學生命科學學院，山東青島 266109）

滑子菇（Pholiota nameko），又名珍珠菇、滑菇、光帽鱗傘，屬擔子菌綱、傘菌目、球蓋菇科、環(huán)銹傘屬[1]?；庸綄儆谡湎∑贩N，原產于日本[2]，是聯合糧農組織(FAO)向發(fā)展中國家推薦栽培的食用菌之一[3]。食用菌采后其生命活動仍繼續(xù)進行，隨著貯藏時間的延長，氧化-還原平衡遭受破壞，氧化產物積累，造成衰老和變色，外觀品質下降。此外，食用菌采后易出現軟化、老化、細菌或病毒感染而腐爛等品質衰敗現象，影響貯運和消費[4]。食用菌子實體的細菌性斑點病、滴水病和干腐病等都是由假單胞菌屬引起的，熒光假單胞菌是食用菌細菌性腐爛病的主要病原菌[5]，染菌后，子實體菌蓋或菌柄出現淡黃色水漬狀病斑，腐爛后散發(fā)出難聞的惡臭氣味，最終失去經濟價值不能食用[5,6]。因此，選擇合適、實用的采后處理方法對減少滑子菇鮮菇損失，抵御病原菌侵染，保持良好商品性狀和營養(yǎng)價值具有重要的意義。

以天然植物提取物作為保鮮劑與傳統(tǒng)的涂膜保鮮處理相結合，研制具有抗菌或抗氧化等特征的復合涂膜是近幾年果蔬保鮮的研究熱門[7～12]。涂膜保鮮是果蔬貯藏的重要輔助技術，根據微氣調理論，將具有成膜性的物質通過浸漬、噴灑等方法涂敷在果蔬的表面，風干后形成一種無色透明的半透膜，起到延長果蔬貨架期的作用[7]。趙梅等[10]發(fā)現納米殼聚糖涂膜對平菇保鮮具有積極影響。張沙沙等[11]采用黑虎掌菌提取液-殼聚糖-竹蓀提取液復合涂膜雙孢菇可達到延緩衰老的目的。百里香精油、乳鏈菌肽（nisin）等作為天然、高效的抗菌劑，具有較廣闊的應用前景[12～14]。百里香精油作為一種高效的植物源抑菌藥物，已被證明具有廣譜的抑菌性能[12,13]。Thierry R等[15]研究表明，百里香精油對有害疣孢霉菌絲的生長具有抑制作用。李偉麗等[14]的實驗結果顯示 nisin對腐敗醋中分離得到的微生物菌株均具有明顯的抑菌或殺菌活性。

本文將海藻酸鈉、L-半胱氨酸和nisin復配成可食性復合涂膜，研究了此復合涂膜對滑子菇的保鮮和抗病效果，旨在探索新型、高效、安全的滑子菇保鮮方法，為生產上應用復合涂膜保持采后滑子菇品質、延長貨架期提供適用技術和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滑子菇購于城陽果蔬批發(fā)市場，選取新鮮、成熟度一致、大小適中、無機械傷、無病蟲害及霉變的滑子菇作為試驗材料。菌種為本團隊從攜帶病斑、腐爛發(fā)黃的平菇中篩選出的一株病害菌株熒光假單胞菌Pseudomonas Fluorescens-YL(數據未發(fā)表)。

L-半胱氨酸、百里香精油、nisin、假單胞CFC選擇性培養(yǎng)基和假單胞菌 CFC選擇性培養(yǎng)基添加劑等購自國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈣等試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AR1140電子分析天平，購于美國奧豪斯國際貿易有限公司；UV757CRT紫外分光光度計OG02型高壓蒸汽滅菌鍋，購于新華醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2D無菌超凈工作臺，購于青島正恒實驗設備有限公司；FUMA QYC-200變頻搖床，購于上海?，斣囼炘O備有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

將滑子菇樣品隨機分成四組，標記為 A、B、C和D，分別做如下處理：A組針刺后，用毛筆將1 mL無菌水均勻涂抹在菇體表面；B組針刺后，用毛筆將1 mL菌懸液均勻涂抹在菇體表面；C組復合涂膜后，針刺，用毛筆將1 mL無菌水均勻涂抹在菇體表面；D組復合涂膜后，針刺，用毛筆將1 mL菌懸液均勻涂抹在菇體表面。常溫儲存10 d，測定相關指標。所用毛筆等器具均干凈無菌。

1.3.2 菌液

取保存在-80 ℃的甘油菌劃線活化，挑取單菌落于假單胞CFC選擇性培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋至108～109CFU/mL，備用。

1.3.3 可食性復合涂膜

稱取0.5 g海藻酸鈉，溶于100 mL蒸餾水中，邊水浴加熱（55 ℃～60 ℃）邊攪拌至海藻酸鈉呈透明、無顆粒狀，完全溶解，靜置脫氣。冷卻后加入 1%的甘油，1%百里香精，0.3 mg/kg L-半胱氨酸以及40 mg/g nisin，將滑子菇浸入涂膜液中，30 s后投入5%氯化鈣溶液，交聯2 min，自然風干。

1.3.4 指標測定方法

參照崔世瑞等[16]的方法測定可溶性蛋白質含量；采用愈創(chuàng)木酚氧化法[17]測定POD（過氧化物酶）活力；參照周巧麗[18]的方法測定總酚、類黃酮含量；采用可見分光光度計法[3]測定 PAL（苯丙氨酸酶）活力；采用分光光度計法[19]測定 MDA（丙二醛）含量。所有指標檢測均設置3個平行。

1.3.5 菌落總數測定

菌落總數測定參照GB 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：菌落總數測定》的方法[20]。

1.3.6 數據統(tǒng)計分析

試驗數據為 3次重復的平均值和標準差，采用SPSS軟件進行差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 復合涂膜對滑子菇體內部分酶活力的影響

2.1.1 復合涂膜對滑子菇POD活力的影響

過氧化物酶（POD）是一種氧化還原酶，在果蔬中可表現為一種衰老酶，其活性的變化可作為果蔬成熟和衰老的指標之一[21]。有研究表明，在子實體衰老初期，POD表現出保護作用，在維持組織中活性氧代謝平衡過程中能清除過氧化氫和脂類氫過氧化物；而在逆境或者衰老后期，表現出傷害效應，降低滑子菇耐儲性[21,22]，在過氧化氫存在下，催化酚類、類黃酮的氧化和聚合而導致組織褐變[23]。

圖1 滑子菇貯藏過程中POD酶活力的變化Fig.1 The changes of the POD activity of pholiota nameko during refrigeration storage

由圖1可知，POD活性在貯藏前期呈上升趨勢，達到一定值后開始下降。在常溫貯藏過程中，復合涂膜處理的C、D兩組在5 d，未復合涂膜處理的A、B兩組在3 d時POD活力達到峰值后逐漸降低；說明復合涂膜處理可明顯推遲 POD活力高峰的出現。本實驗結果與張榮飛等學者研究結果相似。張榮飛[24]發(fā)現納米SiO2復合膜處理雙孢蘑菇后POD活性峰值延緩3 d出現，實驗結果表明復合涂膜處理能更有效的抑制雙孢蘑菇在貯藏中的酶促作用，從而達到保鮮目的。

在貯藏前期，C組POD活力明顯高于A組，說明復合涂膜處理有利于滑子菇達到更高的POD活力，在維持組織中活性氧代謝平衡過程中表現出更好的清除過氧化氫和脂類氫過氧化物能力，從而延緩衰老；在貯藏后期，C組POD活力顯著低于A組，說明復合涂膜有利于抑制滑子菇的 POD活力，催化酚類、類黃酮的氧化和聚合而導致組織褐變，降低 POD對菇體的傷害效應，更好地維持菇體品質。對于接入病原菌熒光假單胞菌的B、D兩組也有相同的發(fā)現，說明復合涂膜處理的滑子菇，即使遭遇病原菌的侵染，也可以在一定程度上延緩衰老和菇體品質下降。

植物體內的抗氧化酶系主要還包括超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT，共同維持組織中活性氧代謝平衡[23]，二者活力變化結果與 POD相似。在清除O2-和H2O2防止膜過氧化過程中，SOD是抵抗氧化損傷的第一步，CAT能催化積累的過氧化氫為O2和H2O，減少氧化損傷引起的損傷。C組的SOD活力在5 d達到峰值21.20 U/g FW，對照組在3 d達到峰值10.67 U/g FW；C組的CAT活力在5 d達到峰值210.70 U/mg FW，對照組在3 d達到峰值172.31 U/mg FW（數據未發(fā)表）；說明復合涂膜處理的滑子菇體內抗氧化酶活力更高，高峰出現更晚。

2.1.2 復合涂膜處理對滑子菇 PAL活力的影響

圖2 滑子菇貯藏過程中PAL活力的變化Fig.2 The changes of the PAL activity of pholiota nameko during refrigeration storage

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接生物初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶；植保素是植物受病原菌侵染或寒冷、外傷脅迫而產生的一類低分子量抗微生物的化合物，PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一個生理指標[25]，其生成量與PAL活性呈正相關關系[26]。

由圖2可知，滑子菇PAL活力隨貯藏時間延長均逐漸下降，A、B和D組滑子菇PAL活力變化趨勢和含量相似，C組PAL活力下降速度最慢且在整個貯藏期間活力顯著高于其他三組，貯藏結束時，PAL活力約為8.75 U/g FW，是A組的3.50倍，說明復合涂膜處理有利于滑子菇的PAL活力維持在較高水平，具有更好的抗逆性，從而有利于抵抗外傷脅迫和阻止病原菌的侵入，保持菇體品質。對于復合涂膜后接病原菌的D組，在整個貯藏期間，PAL活力均略高于B組，不顯著，說明復合涂膜處理對滑子菇抵御病害也有一定保護作用。

2.2 復合涂膜對滑子菇可溶性蛋白質和丙二醛含量的影響

2.2.1 復合涂膜對滑子菇可溶性蛋白質含量的影響

滑子菇采收后消耗體內的糖類與蛋白質維持生命活動，隨著儲存時間的延長，不斷消耗的蛋白質成為主要營養(yǎng)來源，可溶性蛋白質含量的降低是滑子菇子實體衰老的重要指標，可溶性蛋白質的含量不僅是菇體品質和營養(yǎng)的重要評價指標之一，也反映出滑子菇子實體衰老的程度[27,28]。

圖3 滑子菇貯藏過程中可溶性蛋白含量的變化Fig.3 The changes of the soluble protein content of pholiota nameko during refrigeration storage

由圖3可知，滑子菇可溶性蛋白含量隨貯藏時間延長均逐漸下降。其中，C組蛋白質含量下降趨勢較為平緩，變化幅度最小，說明復合涂膜處理可更好地維持菇體可溶性蛋白質的含量，對滑子菇的衰老有延緩作用；D組可溶性蛋白質含量下降速度最快，變化幅度最大，最終含量最低且明顯低于其他組，這可能由于遭受病害侵襲，菌液及菌體的代謝物產物影響了滑子菇的代謝導致菇體衰老，可溶性蛋白質含量降低，破壞了菇體品質。D組蛋白質含量略高于B組，說明未復合涂膜處理的滑子菇遭受了更為嚴重的病害侵襲，復合涂膜具有一定的抗病效果，但效果不顯著。

2.2.2 復合涂膜對滑子菇丙二醛含量的影響

圖4 滑子菇貯藏過程中MDA含量的變化Fig.4 The changes of the MDA content of pholiota nameko during refrigeration storage

菇體的衰老與細胞質膜相對透性密切相關，衰老過程中產生的大量的活性氧自由基會直接或者間接啟動膜脂的過氧化作用，導致膜的損傷和破壞[29,30]，過氧化程度越高，細胞膜受損害程度越高，微生物入侵的可能性越大。MDA作為膜脂過氧化作用的最終產物，其含量可以反映出滑子菇子實體受傷害的程度。同時，MDA具有較強的交聯性質，可以使膜蛋白發(fā)生聚合，降低細胞膜流動性，進一步造成膜系統(tǒng)的損害而加速菇體自溶、衰老[29]。

由圖4可知，各組滑子菇的MDA含量在貯藏期間總體呈上升趨勢，未復合涂膜的A、B兩組MDA含量的增加速度快，說明膜脂過氧化快，果實逐漸衰老。復合涂膜處理的C、D兩組MDA的含量增幅小，增加速度慢，說明膜脂過氧化較為緩慢。在貯藏結束時，A組樣品MDA含量是原來的2.50倍，C組滑子菇的MDA含量僅為原來的1.81倍且整個貯藏期間均顯著低于對照組A，說明復合涂膜處理對滑子菇菇體中MDA的積累可起到抑制作用，可有效減緩細胞的脂膜過氧化程度，降低微生物入侵的可能性，保持菇體品質，延緩菇體衰老。

對于接病原菌處理的滑子菇，結果類似，B和D組樣品MDA含量分別是原來的2.25、2.21倍，D組MDA含量在整個貯藏期間均低于B組，說明復合涂膜后的滑子菇，在貯藏期間遭受病原菌侵害時，膜脂的過氧化作用更低，細胞膜受損害程度更低，可降低微生物入侵的可能性，在一定程度上可提高滑子菇抵御病害的能力。

2.3 復合涂膜對滑子菇總酚和類黃酮含量的影響

2.3.1 復合涂膜處理對滑子菇總酚含量的影響

圖5 滑子菇貯藏過程中總酚含量的變化Fig.5 The changes of the total phenolic content of pholiota nameko during refrigeration storage

果蔬采后褐變可歸納為酶促褐變和非酶褐變兩大類[30]，褐變現象會導致菇體外觀品質降低。酶促褐變是由多酚氧化酶作用于酚類物質底物而引起的，果實褐變程度與其組織內部總酚含量密切相關。同時，酚類物質與果蔬的色澤、品質及成熟衰老也密切相關[29,30]。

由圖5可知，各處理組滑子菇總酚含量呈上升趨勢，這可能是由于隨著貯藏時間的延長，滑子菇子實體受到環(huán)境的脅迫而引起組織內產生更多酚類物質，酚類物質可以參與組織的愈傷過程以及增強子實體對不良環(huán)境的抗逆性[29]。

酚類物質也是酶促褐變的重要底物，在多酚氧化酶PPO的催化下氧化為醌，醌進一步聚合形成深色物質，從而影響滑子菇的外觀質量、風味和營養(yǎng)品質等。Aquino-Bolan等[31]認為酚類物質積累會影響褐變程度，YE[32]等的實驗結果表明較低的總酚含量和較低的褐變程度具有相關性。

未復合涂膜的A、B兩組總酚含量的增幅大，增加速度快；復合涂膜處理的C、D兩組總酚含量的增幅較小。在貯藏期間，對照組A的總酚含量始終處于較高水平，顯著高于復合涂膜組（p<0.05）；說明復合涂膜的滑子菇酚類物質積累程度較低，更不利于酶促褐變的發(fā)生。對照組A的PPO活力在5 d達到高峰18.26 U/g FW，C組的PPO活力在7 d達到高峰14.13 U/g FW 后逐漸下降且在整個貯藏期間均低于對照組（數據未發(fā)表），說明滑子菇經復合涂膜處理后，PPO活力受到抑制，高峰的出現延緩了3 d，有利于延緩酶促褐變高峰的發(fā)生。綜合分析總酚含量和PPO活力，結果說明復合涂膜的滑子菇酚類物質積累程度較低，有利于延緩菇體褐變帶來的顏色加深等不良品質。對于接病原菌處理的B、D組，結果類似，D組滑子菇總酚含量增幅小，在整個貯藏期間均顯著低于B組，說明復合涂膜后，即使受到了病害菌侵襲，滑子菇的總酚積累也更少，褐變程度更低。

2.3.2 復合涂膜處理對滑子菇類黃酮含量的影響

圖6 滑子菇貯藏過程中類黃酮含量的變化Fig.6 The changes of the flavonoids content of pholiota nameko during refrigeration storage

類黃酮化合物是高等植物從初生代謝作用中生成的重要的酚類次生代謝物，與植物花色合成密切相關[34,35]，是一類植物色素的總稱，一般呈淺黃色或黃色。由圖6可知，滑子菇類黃酮含量呈上升趨勢，T Jiang等[34]實驗表明殼聚糖復合涂膜的香菇在貯存后期類黃酮含量也呈現上升趨勢，酚類物質的代謝導致類黃酮的積累。未復合涂膜的A、B兩組類黃酮含量均顯著高于復合涂膜處理組，其中，C組類黃酮含量均低于同期其他組，上升幅度最小。C組滑子菇類黃酮含量顯著低于A組，說明植物色素積累程度更低，有利于色澤的保持，延緩色澤加深；D組滑子菇類黃酮含量明顯低于B組，說明復合涂膜后，即使受到了病害菌侵襲，滑子菇的類黃酮積累也更少。

2.4 滑子菇菌落總數的測定

圖7 菌落總數測定Fig.7 Determination of colony count

圖8 復合涂膜貯藏開始和結束時的狀態(tài)Fig.8 The state of Pholiota nameko at the first and the last day after treatment with composite coating

滑子菇的微生物感染也是造成子實體的衰老、品質下降等現象的原因。食用菌常常因為微生物感染導致軟化腐爛，有毒物質，病害等，即使低溫干燥的環(huán)境下也難以減少微生物侵害，食用菌微生物侵染致病問題不容忽視[6,8]。

滑子菇菌落總數測定情況如圖7所示，圖8反應了復合涂膜的滑子菇在貯藏開始和結束時的狀態(tài)。由圖7和圖8可知，貯藏結束時，對照組滑子菇的菌落總數高達22.80×104CFU/g，復合涂膜處理后的滑子菇菌落總數為2.82×104CFU/g，也低于4 ℃處理的滑子菇菌落總數；說明復合涂膜處理可以顯著抑制滑子菇微生物數量的增長，抑制效果顯著，比低溫貯藏具有更好的抑菌效果，可有效防止因感染病害導致的褐變、軟化、腐爛等品質下降，保持食用價值和經濟價值。

本實驗的復合涂膜具有良好的抗菌性能，主要和其成分中的百里香精油、nisin有關。百里香精油作為一種高效的植物源抑菌藥物，已被證明具有廣譜的抑菌性能[12,13]，鄧雯瑾等[12]通過熒光假單胞菌的回接實驗，研究發(fā)現百里香復合薄膜對鮮切生菜的優(yōu)勢腐敗菌具有很好的抑制效果。張樂等[35]等發(fā)現，通過添加食品級乳鏈菌肽開發(fā)出的乳鏈菌肽-明膠-酪蛋白鈣復合膜，不僅具有良好的力學和光學特性，而且能夠有效地抑制食品腐敗的革蘭氏陽性菌的生長，從而增強對食物的保鮮效果。本實驗結果表明 nisin與海藻酸鈉、L-半胱氨酸等制成的可食性復合涂膜對滑子菇防病害菌侵染方面具有一定的應用價值，并為新型包裝材料的研發(fā)和減輕環(huán)境壓力，提供了理論基礎。

3 結論

以海藻酸鈉、L-半胱氨酸、百里香精和nisin等可食性原料復配的天然保鮮劑浸泡食用菌，風干后形成薄膜。SOD、POD、PPO和PAL為植物主要的抗氧化酶類，與植物體內活性氧代謝和抗病性密切相關，其活性的高低可以作為判斷果實耐貯性指標和衰老的標志[34,35]。結果發(fā)現，經復合涂膜處理的滑子菇，菇體POD酶活力峰值推遲2 d出現，且峰值高于未涂膜的滑子菇；PAL活力下降緩慢且在貯藏期間顯著高于未涂膜的滑子菇。說明涂膜后滑子菇的抗逆境能力更強，可更好地抵抗外傷脅迫和阻止病原菌的侵入，延緩子實體衰老；可溶性蛋白質含量流失較少且在貯藏期間均高于未涂膜的滑子菇，說明菇體保留了更多營養(yǎng)價值，衰老程度更低；MDA含量增幅最小且在整個貯藏期間均顯著低于對照，說明復合涂膜處理可有效減緩細胞的脂膜過氧化程度；滑子菇類黃酮含量顯著低于對照，說明植物色素積累程度更低，有利于色澤的保持，延緩色澤加深；總酚含量在整個貯藏期間均顯著低于對照，說明酚類物質積累程度低，有利于色澤的保持。在實驗期間，復合涂膜處理的滑子菇具有更好的品質，涂膜后的滑子菇在遭到病菌侵襲后，菇體品質比未涂膜處理的滑子菇好。貯藏結束時，復合涂膜滑子菇的菌落總數顯著低于對照組，也低于4 ℃冷藏的滑子菇，菇體腐爛率更低，食用品質保持更好，說明復合涂膜可以有效防止病原菌的侵害和病害的發(fā)生，這主要與復合涂膜原料中百里香精和nisin等抗菌劑的抑菌作用有關。

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