基于26S rRNA D1/D2區(qū)序列對不同時期大曲中酵母菌的分離與鑒定

竇曉，楊建剛，曹新志，馬瑩瑩，郭家秀，張琦，蘇暢

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢 643000）

大曲作為中國白酒發(fā)酵過程中的發(fā)酵劑，可以給發(fā)酵過程提供微生物、前體風味物質以及各種酶類[1～3]。酵母菌作為大曲微生物中的主要組成部分之一，對大曲的功能的形成有著不可或缺的作用。傳統的酵母菌株鑒定方法建立在菌株的形態(tài)、生理特性和生物化學特性質差異之上。然而這些特征會受培養(yǎng)條件的影響，在某種程度上具有不確定性，為確保鑒定結果的可靠性，鑒定一株菌經常需要完成 50～100項實驗[4]。費時費力且重復性不高。

核糖體RNA基因(rRNA)存在于所有細胞生物中并具有相同的起源和功能，因而可以反映所有物種間具有可比性的進化史。而且rDNA中有些片段具有高度的序列同源性或保守性，從而可為不同物種間的系統學比較提供研究參考點。

Kurtzman & Robnett[5,6]和 Fell等[7]測定了所有已知酵母種類的26S rRNA D1 D2區(qū)序列，發(fā)現在這一600 bp左右的片段中，種內序列變異小于等于1%，而種間序列差異大于 1%。目前這一標準已被國際酵母分類學界普遍接受，從而也使酵母菌的菌種鑒定變得相對容易。近年來，以核酸為研究對象的分子生物學技術以其簡便、準確等優(yōu)點逐漸應用到酵母菌的分類鑒定中。

單鏈構象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)技術是基因突變分析中最常用的方法之一。其理論基礎是單鏈DNA具有序列特異性的二級或三級構象。一個或多個堿基的差異能影響其構象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，構象的改變表現為單鏈DNA遷移率的改變，根據各樣品的單鏈遷移率，就可以把突變體和非突變體區(qū)分開。該方法最初應用于人類基因點突變的檢測中[8,9]，由于其在檢測堿基差異方面的高分辨力，而廣泛應用于人類和植物病原真菌種的鑒定和菌株分析中[10,11]。

本研究通過對不同時期大曲中分離的酵母菌的26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列進行分析，在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST)，比較供試菌株與已知酵母菌相應序列的同源性。依據分離鑒定的結果對大曲生產過程中的酵母菌的演替規(guī)律進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

大曲取自瀘州老窖制曲生態(tài)園，對生產過程中0、3、5、7、10、25、90 d的大曲進行采集。在形態(tài)學觀察的基礎上，挑取了260株酵母進行26S rRNA基因D1/D2區(qū)的序列測序與比對。

1.1.2 儀器試劑

基因擴增儀（GT9612）購自杭州柏恒科技有限公司；離心機（CF15R）購自日立集團；電泳儀（JK600C）購自北京君意東方電泳設備有限公司；凝膠成像系統Alpha Innotech購自美國Alpha公司；Taq PCR Master Mix，引物NL1，NL4均購自北京博邁德生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

在瀘州老窖制曲生態(tài)園中采取第0、3、5、7、10、25、90 d的大曲，每個時期的大曲雜碎混勻后取50 g加入到450 mL無菌水里面充分混勻后，吸取1 mL混合液到裝有9 mL無菌水的試管中，依次做成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6五個梯度，然后再用YPD培養(yǎng)基（酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）和PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）進行平板分離。

1.2.2 總DNA的提取

在涂布的平板上挑取單菌落再劃線純化，分離純的酵母菌株。用Makimura等[12]方法提取菌體總DNA。在斜面上挑取少量酵母菌體（一環(huán)），置于一已滅菌的1.5 mL的離心管內。加入100 μL裂解液（100 mM Tris，30 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8.0 15P滅菌30 min備用），100 ℃水浴15 min。加入100 μL 2.5M的醋酸鉀后（室溫冷卻后），置于冰上30 min至60 min。在4 ℃下13000 r/min離心5 min，上清液移至一新1.5 mL離心管內(200 μL槍)。加入等體積的氯仿異戊醇（24:1），劇烈震蕩10 min（上下搖動，除去蛋白），13000 r/min，離心15 min，吸取100 μL上清液至另一只滅菌的1.5 mL離心管中。重復上一步，直到兩相之間沒有沉淀，將上清液移至另一只滅菌的 1.5 mL離心管中（可省略）。加入等體積（100 μL）的冷的異丙醇，放置-20 ℃靜置15 min（沉淀DNA）。13000 r/min離心15 min。用100 μL 70%乙醇洗滌沉淀。重復上一步驟。將沉淀置于真空干燥器中抽干乙醇（65 ℃烘干 30 min或65 ℃水?。＜尤?50 μL已滅菌的 MILLI-Q 水（ddH2O），在4 ℃下溶解2 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增和測序

PCR擴增26S rRNA D1 D2區(qū)，PCR擴增反應所用引物參照 Kurtzman等[5]，正向引物 NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物 NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR 采用25 μL體系，擴增反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 8 min。PCR反應產物的瓊脂糖電泳檢測：取2 μL PCR擴增原液點樣于 1%的瓊脂糖凝膠，電泳，溴化已錠(EB)染色后在紫外燈照射下確定是否擴出所要片段。26S D1 D2區(qū)擴增出單一明亮條帶，片段大小約為500～600 bp。

1.2.4 DNA序列分析方法

DNA序列分析：用DNA Star軟件并結合DNA正反向序列圖譜對DNA序列進行拼接和校正。將校正后的序列在國際核酸數據庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov.blast)中進行同源序列搜索，初步確定受試菌株的分類地位，一般在D1 D2區(qū)可以按如下經驗值判斷：(1)與最近緣種的模式菌株相似率為 100%，可確定為同一種；(2)與最近緣種的模式菌株的相似率<98%，可初步確定為新種；(3)與最近緣種的模式菌株的相似率在99%～100%之間，它們的關系要視不同的情況而定，除考慮序列差異外，還應考慮生理生化性狀差異。

SSCP分析：用 DCodeTM 突變檢測電泳儀進行SSCP檢測。參照使用說明配置丙稀酰胺，甲叉雙丙稀酰胺(37.5:1)的8%凝膠。把PCR產物稀釋2～5倍，取5 μL(大約150～300 ng)與等量的上樣緩沖液(0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4% 0.5 mol EDTA，pH 8.0)混勻，在95 ℃下變性10 min，迅速放在冰上，放置15 min。把變性后的樣品依次加入到點樣孔中，200 V電壓10 ℃電泳16 h。電泳結束后將凝膠按照 Wallace[13]的方法進行硝酸銀染色，用相機拍照保存。

2 結果與討論

2.1 26S rRNA D1/D2區(qū)序列的擴增

在對分離的260株菌的26S rRNA D1/D2區(qū)序列進行了PCR擴增，下圖為PCR擴增產物電泳圖，顯示產物的長度都在500～750 bp，這與酵母菌的D1/D2區(qū)域序列長度為500～600 bp左右相符合，說明擴增正常。電泳效果圖見圖1。

圖1 26S rRNA D1/D2區(qū)序列PCR擴增產物電泳圖Fig.1 PCR amplification product electrophoresis of 26S rRNA D1/D2 region sequence

2.2 26S rRNA D1/D2區(qū)序列的比對

對分離的260株菌的26SrRNA基因D1/D2區(qū)序列在 GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST)后，將同源性大于 99%的菌株歸為同一個種發(fā)現有101株菌與異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的同源性高于99%，故將這101株酵母菌鑒定為異常威克漢遜酵母(Wickerhamomyces anomalus)；其中 52株菌與扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的同源性大于99%，故鑒定為扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)；11株菌與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相似度為 100%；Clavispora lusitaniae 18株；庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)15株；假絲酵母(Candida glabrata)16株；Kluyveromyces marxianus 13株；Torulaspora delbrueckii 9株；生絲畢赤酵母(Hyphopichia burtonii)7株；Meyerozyma guilliermondii 3株；Pichia caribbica 2株；其余均為一株。表1為部分菌株在Genbank數據庫中進行同源序列搜索后結果。

表1 部分菌株26S rRNA基因D1/D2區(qū)與模式菌株比對結果Table 1 Comparison of 26S rRNA gene D1 / D2 region of part of the strains with model strains

2.3 對不同種菌株的 26S rRNA基因D1/D2-SSCP圖譜比較

為了進一步確定它們之間的種間差異，對部分不同菌株進行26S rRNA D1/D2-SSCP圖譜分析比較，結果如圖2所示。所比較株菌D1/D2-SSCP圖譜都包括兩條泳動慢的單鏈和一條泳動快的雙鏈。雙鏈位置的不同反映菌株間26S rRNA基因D1/D2區(qū)片段長度的差異，堿基序列的差異通過單鏈位置及兩單鏈位置關系的差異反映在SSCP圖譜上。因此，由圖2可以看出不同類型株菌的核型差異很明顯。

圖2 部分菌株間的26S rRNA基因D1/D2-SSCP圖譜比較Fig.2 Comparison of 26S rRNA D1 / D2-SSCP patterns among some strains

2.4 基于26S rRNA D1/D2區(qū)序列構建M-L系統樹

圖3 基于26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列構建的M-L系統樹Fig.3 M-L system tree based on 26S rRNA D1 / D2 regionsequence

用軟件MEGA6.06對所有序列進行比對后，刪除兩端未對齊的堿基生成進化樹，并進行1000次的Bootstraps檢驗。采用“Maximum Likelihood Tree”(M-L)方法顯示進化樹，結果見圖。構建了22種不同菌株與其相似度最接近的模式菌株的M-L系統樹如（圖3），通過系統發(fā)育樹對大曲中分離出的不同類型的酵母的種間親緣關系進行了直觀界定。

2.5 不同時期大曲酵母菌的分布規(guī)律

根據對260株酵母菌的26S rRNA D1/D2區(qū)序列比對鑒定的結果以及前期平板計數的結果對不同時期大曲中的酵母菌進行統計分析。如圖4所示，在大曲生產初期酵母種群數量較多，在頂溫區(qū)（7 d～10 d）種群減少，酵母數量最多，但種群開始減少，主要以異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主，成品大曲（90 d以后）酵母主要以扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主。這可能是隨著大曲培菌過程中溫度的變化使酵母群落發(fā)生了相應的演替。

圖4 不同時期大曲中酵母的分布Fig.4 Yeastdistributions in Daqu in different periods

3 討論

3.1 本文通過傳統的平板計數的方法對大曲培菌過程中的酵母菌的種群變化進行了初步的統計分析，發(fā)現頂溫區(qū)（7～10 d）酵母數量最多，主要以異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuLigera）為主，成品大曲（90 d以后）酵母主要以扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主。成品大曲中的酵母菌種類相對單一，而它又能直接參與中國白酒的發(fā)酵過程，因此對成品大曲中含量最高的扣囊復膜酵母進行更深一步的的研究很有必要。但傳統分離由于自身的局限性對各時期的優(yōu)勢菌株的體現并沒有現代分子生物學那樣系統直觀，例如DGGE和高通量等方法。Zhang Liqiang等運用PCR-DGGE技術解析了不同類型大曲中微生物的組成差異[14]；Zheng等運用高通量測序技術對30年窖齡和300年窖齡的瀘州老窖窖泥微生物的多樣性進行了系統分析[15]；這些技術與傳統的分離鑒定方法存在著很大的優(yōu)勢，可以簡單直觀地反映出某一時期某種物質中的可培養(yǎng)的以及不可培養(yǎng)的微生物的組成，但傳統分離也存在著自身獨有的優(yōu)勢，相比較現代分子生物學技術它可以得到活的菌株，為微生物的進一步研究提供基礎。因此運用現代分子生物學技術手段來指導傳統分離將是以后的發(fā)展方向。

3.2 隨著DNA序列分析技術的日趨成熟和簡易化，序列分析方法已經被廣泛應用于酵母菌的分類鑒定以及系統學研究。而 26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列在GenBank/EMBL/DDBJ等國際核酸序列數據庫中的公布為酵母菌的分類鑒定帶來了極大的方便[16]。

3.3 26S rRNA的Dl/D2區(qū)域位于大亞基的5′端，序列長度在600 bp左右，該段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關系較近的菌株之間的分類研究。此區(qū)域序列已建成了完備的分析數據庫，用其進行酵母菌種的鑒定更為方便準確，其應用也最為廣泛[17,18]。本實驗也是依于此對大曲生產過程中不同時期的樣品中分離出的酵母菌進行了26S rRNA基因D1 D2區(qū)的序列同源性分析，共分析鑒定了260株酵母菌。從而確定了大曲生產過程中不同時期的酵母菌的組成結構，初步掌握了大曲中酵母菌的演替規(guī)律，對研究傳統中國白酒的功能微生物奠定了一定的基礎。

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