納豆菌液態(tài)發(fā)酵谷物產(chǎn)納豆激酶及發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性研究

趙謀明，鄒穎，林戀竹，吳見

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣州市賽健生物科技有限公司，廣東廣州 510640）

血栓是由于血液中的纖維蛋白、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞粘連而形成的一種疾病，可以形成于諸如大腦、心臟和靜動(dòng)脈血管等部位。血栓骨架由纖維蛋白所構(gòu)成，目前治療血栓的焦點(diǎn)在于分解纖維蛋白[1,2]。納豆菌是從納豆中分離得到的對(duì)人體無病原性的安全菌株。納豆激酶(nattokinase簡(jiǎn)稱NK)是一種在納豆發(fā)酵過程中由納豆菌(Bacillus natto)或納豆枯草桿菌(B.subtilis natto)產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶[3～5]。納豆激酶具有高效溶血栓作用，是國內(nèi)外科研熱點(diǎn)之一[6～9]。與傳統(tǒng)的溶栓藥物相比納豆激酶具有以下優(yōu)勢(shì)：體內(nèi)半衰期長(zhǎng)；分子量相對(duì)較小，更易被人體吸收；溶栓途徑多元化，溶栓能力較強(qiáng)[10]。納豆激酶作為新型治療心腦血管疾病的藥物，兼具多種優(yōu)勢(shì)，開發(fā)前景相當(dāng)廣闊[11]。

自由基在細(xì)胞內(nèi)的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷進(jìn)一步導(dǎo)致生物體逐漸衰老[12]。谷物作為人們攝食的主要來源不僅提供能量、蛋白質(zhì)還有營(yíng)養(yǎng)成分，近年來國內(nèi)外研究報(bào)道，谷物中含有大量多酚類化合物，包括酚酸、黃酮類化合物和原花青素等，這些多酚類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性[13～15]。據(jù)報(bào)道，肽類物質(zhì)也具有很強(qiáng)的抗氧化活性可清除自由基從而延緩衰老[16]。

微生物發(fā)酵長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是一種提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，谷物發(fā)酵也受到研究者的廣泛青睞，Juan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆在經(jīng)過枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后總酚和總黃酮的含量都有提高；Wei等[18]研究了解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵鷹嘴豆產(chǎn)纖溶酶，及抗氧化活性有所提高。然而，關(guān)于利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵谷物制備富含納豆激酶、谷物多酚且具有強(qiáng)抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物的報(bào)道較少。

本文研究目的是：添加四種谷物(糙薏仁、玉米、蕎麥和糙米)、三種預(yù)處理方式(打粉、浸泡蒸煮和打粉蒸煮)以及不同發(fā)酵時(shí)間(36 h和48 h)對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶、蛋白酶酶活、谷物總酚遷移率、總酚殘留率以及發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響，為利用納豆菌開發(fā)具有顯著溶栓、抗氧化活性的功能性食品提供理論和方法的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

納豆菌(Bacillus subtilis natto)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院贈(zèng)送；糙薏仁、玉米、蕎麥、糙米購自南沙舊鎮(zhèn)天匯百貨；凝血酶、纖維蛋白原購自廣州博弋康貿(mào)易有限公司；AAPH、熒光素、Trolox純度為99%，購于美國Sigma公司；大豆蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麥芽糖，上海伯奧生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；101-3A型烘箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；UV-721型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；LRH-250A-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器，江蘇蘇昆儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨2%，麥芽糖1%，CaCl20.2%，MgSO40.05%，Na2HPO40.2%，NaH2PO40.1%，pH 7.0～7.2。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 納豆菌液態(tài)發(fā)酵時(shí)間曲線測(cè)定

納豆菌利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵 60 h得到發(fā)酵上清液，每隔6 h取樣測(cè)定其生物量、蛋白酶活及納豆激酶酶活。

1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

在優(yōu)化后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件下(種齡20 h，接種量2%(V/V)，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，裝液量25 mL/250 mL)，分別以10%的添加量在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入經(jīng)打粉（粒徑0.9 mm）、浸泡蒸煮(打粉后浸泡6 h在蒸煮20 min)、打粉蒸煮(打粉后蒸煮20 min)預(yù)處理后的四種谷物(糙薏仁、玉米、蕎麥、糙米)分別發(fā)酵36 h、48 h，4000 r/min離心10 min，上清液即為發(fā)酵產(chǎn)物，沉淀即為發(fā)酵殘?jiān)?/p>

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物的制備

將發(fā)酵產(chǎn)物中按1:2（V/V）加入乙酸乙酯，萃取三次，收集乙酸乙酯相，合并，45 ℃減壓蒸干，溶于1 mL DMSO，即得到發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物。

1.3.4 發(fā)酵殘?jiān)喾犹崛∥锏闹苽?/p>

于發(fā)酵殘?jiān)屑尤?5 mL無水乙醇，60 ℃超聲(800 W)提取1 h，4000 r/min離心10 min，得到上清液即發(fā)酵殘?jiān)喾犹崛∥铩?/p>

1.3.5 蛋白酶酶活的測(cè)定

根據(jù)GB/T 23527-2009進(jìn)行，測(cè)定步驟如下：

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0～50 g/mL的酪氨酸溶液1.0 mL于試管中，各加入5.0 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液及 1.0 mL福林酚試劑，混合均勻后在40 ℃水浴鍋中顯色20 min，用分光光度計(jì)測(cè)定680 nm波長(zhǎng)下的吸光值。以樣品與空白在680 nm下測(cè)定光密度值之差為橫坐標(biāo)，酪氨酸濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：將稀釋后的樣品與酪蛋白底物溶液分別放入40 ℃恒溫水浴中預(yù)熱2 min。在樣品管與空白管中各加入1.0 mL樣品溶液，樣品管中加入1.0 mL酪蛋白溶液，混勻，40 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2.0 mL 4%三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，保溫20 min；空白管則先加入 TCA使樣品失活，再加酪蛋白溶液，其他步驟同上；保溫結(jié)束后，過濾取 1.0 mL上清液，加入5.0 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液中，再加入1.0 mL福林酚試劑，充分混合后在40 ℃顯色20 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定680 nm下的吸光值。空白、樣品管各測(cè)定3個(gè)平行。將樣品與空白在680 nm下測(cè)定光密度值之差代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到y(tǒng)s。

樣品的蛋白酶酶活(U/mL)=ys*(4/10)*n，其中 n為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.6 納豆激酶酶活的測(cè)定-纖維蛋白平板法

參照Astrup[19]的方法并加以改進(jìn)。

纖維蛋白平板的制備：磷酸鹽緩沖溶液的配制：將13.35 mg纖維蛋白原溶于15 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制成0.89 mg/mL的纖維蛋白原緩沖溶液。將其放在50 ℃水浴中恒溫5～10 min。將凝血酶溶于1 mL磷酸鹽緩沖溶液中，制得7.5 U/mL的凝血酶緩沖溶液。1%的瓊脂糖溶液20 mL，用微波爐融化，在50 ℃水浴中恒溫10 min。待纖維蛋白溶液和瓊脂糖溫度一致時(shí)，將凝血酶1 mL和纖維蛋白15 mL與瓊脂糖溶液迅速混勻，立即倒平板。

用塑料吸管進(jìn)行打孔，取10 μL發(fā)酵產(chǎn)物加樣于纖維蛋白原平板，37 ℃溫育18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈的直徑，并計(jì)算面積。定義：1 min內(nèi)水解纖維蛋白產(chǎn)生0.01 mm2透明圈的酶量為1 U，根據(jù)透明圈的面積計(jì)算得到發(fā)酵液的納豆激酶酶活(U)。

1.3.7 生物量的測(cè)定方法(細(xì)胞干重法)

采用萬春艷[20]等的方法，準(zhǔn)確量取25 mL發(fā)酵液，4 ℃條件下8000 r/min離心15 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次后，將菌體轉(zhuǎn)移到干燥皿中，于105 ℃條件下烘干至恒重。

1.3.8 總酚含量的測(cè)定

采用Lin等[21]的方法，取樣0.5 mL，加入蒸餾水至6 mL，搖勻，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，在1～8 min內(nèi)加入20%（m/m）的Na2CO3溶液1.5 mL，加入蒸餾水至10 mL，搖勻，40 ℃保溫2 h，迅速冷卻后，立即在760 nm處測(cè)定其吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得總酚含量。

1.3.9 總酚遷移率和殘留率的測(cè)定

總酚遷移率指的是發(fā)酵產(chǎn)物中總酚量占谷物的比率，而總酚殘留率指的是發(fā)酵殘?jiān)锌偡恿空脊任锏谋嚷省?/p>

總酚遷移率=發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物總酚含量/谷物含量；

總酚殘留率=發(fā)酵殘?jiān)喾犹崛∥锟偡雍?谷物含量。

1.3.10 氧自由基吸收能力(ORAC)

參考Lin等[22]的方法，在微孔板中分別加入25 μL樣品溶液或 Trolox溶液，或緩沖液(75 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，pH=7.4)，然后加入75 μL 0.159 μmol/L熒光素鈉溶液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL 38.25 mmol/L AAPH，保持反應(yīng)體系溫度恒定為37 ℃，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，開始計(jì)時(shí)反應(yīng)并讀數(shù)(f0)，每分鐘讀一次數(shù)(f1,f2,...,f70)，共讀71次數(shù)(共計(jì)反應(yīng)70 min)，將每次讀數(shù)連成曲線。計(jì)算公式如下：

AUC = 0.5 (f0+fn)+(f1+f2+··+ fi+··+fn-1)；

Net AUC = AUC樣品- AUC空白

AUC：曲線下的面積；Trolox濃度與Net AUC成線性關(guān)系，換算得到樣品的ORAC值，即達(dá)到每千克樣品的氧自由基吸收能力所需Trolox的量(mmol /kg)。ORAC值越高，則樣品抗氧化活性越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以p<0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆菌液態(tài)發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆菌生物量、蛋白酶酶活和納豆激酶酶活的影響

圖1 納豆菌液態(tài)發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆菌生物量、納豆激酶酶活、蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effects of Bacillus natto liquid fermentation time on the biomass and enzyme activities of nattokinase and protease

納豆菌利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶、蛋白酶以及其生物量隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在發(fā)酵前期，納豆菌生物量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，至12 h，達(dá)到最高值，并在30 h內(nèi)保持恒定，但在發(fā)酵后期隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其生物量逐漸減少；在發(fā)酵前期，納豆菌所產(chǎn)蛋白酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，至24 h，達(dá)到最高值，但在發(fā)酵后期隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆菌所產(chǎn)蛋白酶酶活逐漸降低；在發(fā)酵前期，納豆菌所產(chǎn)納豆激酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，至24 h，達(dá)到最高值，并在60 h內(nèi)保持恒定。對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶以及蛋白酶最適發(fā)酵時(shí)間為24 h。發(fā)酵時(shí)間是影響微生物產(chǎn)酶的一個(gè)重要因素。在發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌在產(chǎn)酶總量達(dá)到峰值時(shí)就應(yīng)當(dāng)及時(shí)停止發(fā)酵，否則酶活力就可能會(huì)出現(xiàn)回落的現(xiàn)象[23]。

2.2 添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶酶活、納豆激酶酶活的影響

圖2 添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effects of grains on protease activity produced by Bacillus natto liquid fermentation

圖3 添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶酶活的影響Fig.3 Effects of grains on nattokinase activity produced by Bacillus natto liquid fermentation

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加經(jīng)不同預(yù)處理方式(打粉、浸泡蒸煮、打粉蒸煮)處理后的四種谷物(糙薏仁、玉米、蕎麥和糙米)，納豆菌液態(tài)發(fā)酵24 h，所得發(fā)酵產(chǎn)物過于粘稠、不易分離、得率低且所產(chǎn)納豆激酶酶活、蛋白酶酶活均顯著低于利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵24 h所產(chǎn)納豆激酶酶活、蛋白酶酶活。因此，本文考察發(fā)酵36 h、48 h對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶、蛋白酶酶活的影響，其結(jié)果如圖2和3所示。而對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶以及蛋白酶最適發(fā)酵時(shí)間為24 h，故對(duì)照組為利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵24 h所產(chǎn)納豆激酶酶活、蛋白酶酶活。

添加谷物可顯著影響納豆菌產(chǎn)蛋白酶酶活。采用直接打粉的方式處理谷物，以添加糙米發(fā)酵48 h所產(chǎn)蛋白酶活性最強(qiáng)，而添加糙薏仁、玉米、蕎麥發(fā)酵36 h或48 h所產(chǎn)蛋白酶活性較弱；采用浸泡蒸煮的方式處理谷物，添加玉米、蕎麥、糙米發(fā)酵48 h所產(chǎn)蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，以添加糙米發(fā)酵48 h所產(chǎn)蛋白酶活性最強(qiáng)(2444.19 U/mL，是對(duì)照組的1.97倍)；采用打粉蒸煮的方式處理谷物，添加糙米發(fā)酵48 h所產(chǎn)蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組，以添加糙米發(fā)酵48 h所產(chǎn)蛋白酶活性最強(qiáng)。另有李志江[24]等研究表明糙米發(fā)酵過程能獲得較高活性蛋白酶活。

此外，添加谷物可顯著影響納豆菌產(chǎn)納豆激酶酶活。采用直接打粉的方式處理谷物，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加四種谷物，經(jīng)納豆菌發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：添加糙薏仁、玉米、蕎麥所得發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶酶活顯著低于對(duì)照組，而添加糙米發(fā)酵48 h所得納豆激酶酶活與對(duì)照組相比無顯著性差異(p>0.05)；采用浸泡蒸煮的方式處理谷物，添加糙米發(fā)酵48 h，所得發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶酶活顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，而添加玉米、蕎麥發(fā)酵36 h或48 h所產(chǎn)納豆激酶酶活略低于對(duì)照組；采用打粉蒸煮的方式處理谷物，添加糙薏仁、玉米和蕎麥所得發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶酶活顯著低于對(duì)照組，而添加糙米發(fā)酵48 h所得納豆激酶酶活與對(duì)照組相比無顯著性差異(p>0.05)。

總的說來，三種預(yù)處理方式中，以浸泡蒸煮的方式處理谷物，所得發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶及納豆激酶酶活最強(qiáng)，這可能歸因于該方式處理谷物有利于其中淀粉糊化，便于納豆菌利用；四種谷物中，以添加蕎麥、糙米所得發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶及納豆激酶酶活最強(qiáng)；以發(fā)酵 48 h所得發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶及納豆激酶酶活最強(qiáng)。尤其以添加經(jīng)浸泡蒸煮的方式處理的糙米發(fā)酵48 h所得酵產(chǎn)物中納豆激酶酶活最強(qiáng)(719.67 U/mL)。綜上所述，添加糙米和蕎麥可顯著促進(jìn)納豆菌產(chǎn)納豆激酶、蛋白酶。采用浸泡蒸煮處理四種谷物、延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可顯著提高其發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶酶活、納豆激酶酶活。

2.3 納豆菌發(fā)酵對(duì)谷物總酚遷移率、總酚殘留率的影響

糙薏仁、玉米、蕎麥和糙米富含多酚類化合物，然而，植物中大部分多酚類化合物與細(xì)胞壁緊密結(jié)合，難以被有機(jī)溶劑提取。雖酸法與堿法可提取這部分結(jié)合型多酚，但往往會(huì)破壞多酚結(jié)構(gòu)，影響其活性，并對(duì)環(huán)境造成污染[25]。因此，找尋一種高效、綠色提取結(jié)合型多酚的方法，是亟待解決的問題之一。近年來的研究結(jié)果表明：利用微生物發(fā)酵法，可顯著提高多酚類物質(zhì)的提取率[17,18]。

采用浸泡蒸煮的方式處理谷物，添加四種谷物發(fā)酵 36 h，總酚遷移率從高到低排序依次是：糙薏仁>蕎麥>糙米>玉米，發(fā)酵48 h時(shí)，總酚遷移率從高到低排序依次是：蕎麥>糙薏仁>糙米>玉米，且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚遷移率略有增加。就總酚殘留率而言，添加四種谷物發(fā)酵36 h和48 h時(shí)，蕎麥的總酚殘留率（1.77±0.11，1.96±0.11 mg/g干谷物）最高，且顯著高于其余三種谷物（p<0.05），糙米的總酚殘留率最低，這與不同谷物本身總酚含量有所不同有關(guān)?？偟恼f來，四種谷物中，以添加蕎麥、糙薏仁所得發(fā)酵產(chǎn)物中總酚含量最高；以發(fā)酵48 h所得發(fā)酵產(chǎn)物中總酚含量最高。

因本文采用乙醇提取發(fā)酵殘?jiān)卸喾宇惢衔?，所得多酚為游離型多酚，總酚殘留率即為發(fā)酵殘?jiān)卸喾拥奶崛÷?。發(fā)酵產(chǎn)物中多酚以及發(fā)酵殘?jiān)锌杀惶崛〉亩喾佣伎勺鳛楣δ苄砸蜃討?yīng)用于功能性食品中。

隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，或谷物前處理方式的改變，發(fā)酵殘?jiān)锌杀灰掖继崛〉亩喾佑兴黾樱俅握f明利用納豆菌發(fā)酵，可顯著提高多酚類物質(zhì)的提取率。

表1 納豆菌發(fā)酵對(duì)谷物總酚遷移率、總酚殘留率的影響Table 1 Effects of Bacillus natto fermentation on the migration ratio and residue ratio of grain polyphenol

2.4 添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物抗氧化活性的影響

本文對(duì)比研究了添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物抗氧化活性的影響，其結(jié)果如表2所示。添加谷物發(fā)酵36 h時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的ORAC值介于13.32～23.84 μmol trolox equiv/mL之間，其抗氧化活性從高到低依次為：添加蕎麥組>添加糙薏仁組>添加玉米組>添加糙米組；延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至48 h，發(fā)酵產(chǎn)物的 ORAC值介于 18.19～30.37 μmol trolox equiv/mL之間，略高于發(fā)酵36 h所得發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性。另外地，對(duì)照組的 ORAC值為 11.03 μmol trolox equiv/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：添加谷物發(fā)酵，可顯著提高納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性。

在此基礎(chǔ)上，本文考察了不同谷物、不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：添加谷物發(fā)酵36 h時(shí)所得多酚提取物的ORAC值介于0.36～0.82 μmol trolox equiv/mL，以添加蕎麥組所得多酚提取物的ORAC值最高；延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至48 h，所得多酚提取物的 ORAC值介于 0.63～1.24 μmol trolox equiv/mL之間，以添加蕎麥組所得多酚提取物的ORAC值最高，發(fā)酵48 h所得多酚提取物的抗氧化活性顯著高于發(fā)酵36 h所得多酚提取物。這與前文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，多酚含量高，則其抗氧化活性強(qiáng)。然而，與發(fā)酵產(chǎn)物的ORAC值相比，發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物的ORAC值較低，說明發(fā)酵產(chǎn)物中，除谷物多酚外，還含有豐富多肽類物質(zhì)、微生物代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。谷物多酚、肽類物質(zhì)與微生物代謝產(chǎn)物是發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

四種谷物富含蛋白質(zhì)，尤其富含Tyr和Trp等強(qiáng)抗氧化活性的氨基酸，是抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)來源，據(jù)報(bào)道[16]，肽的抗氧化活性與其氨基酸的組成及排列順序、疏水性、空間體積大小及酸堿性等有關(guān)：(1)肽的抗氧化活性主要是由于其序列中Tyr、Trp、Cys或Met等具有供質(zhì)子或供電子能力的氨基酸殘基存在；(2)肽序列中的疏水性氨基酸如Leu、Pro、Phe及Val對(duì)肽的抗氧化活性具有重要貢獻(xiàn)；(3)肽序列中的酸性氨基酸殘基對(duì)肽的抗氧化活性起到關(guān)鍵作用。

在發(fā)酵過程中，納豆菌所產(chǎn)蛋白酶會(huì)適度水解谷物蛋白，生成肽類物質(zhì)。因此，采用納豆菌液態(tài)發(fā)酵谷物，可制備富含納豆激酶、谷物多酚、肽類物質(zhì)且具有強(qiáng)溶栓、抗氧化活性的功能性食品。

表2 添加谷物對(duì)納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Table 2 Effects of grains on the antioxidant activity of Bacillus natto liquid fermentation products

3 結(jié)論

3.1 添加糙米和蕎麥可顯著促進(jìn)納豆菌產(chǎn)納豆激酶、蛋白酶。采用浸泡蒸煮處理四種谷物、延長(zhǎng)發(fā)酵的時(shí)間可顯著提高其發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶酶活、納豆激酶酶活。

3.2 添加谷物(尤其是蕎麥)發(fā)酵，可顯著提高納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性。谷物多酚、肽類物質(zhì)與微生物代謝產(chǎn)物是發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 采用納豆菌液態(tài)發(fā)酵谷物，可制備富含納豆激酶、谷物多酚、肽類物質(zhì)且具有強(qiáng)溶栓、抗氧化活性的功能性食品。

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