百合花花青素對(duì)改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化作用研究

熊英，王玉婷，王詩

（1.武漢市第五醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430050）（2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430072）（3.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100）

世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道全球每年肝病死亡人數(shù)達(dá)到100萬，其中肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟疾病中最為常見的環(huán)節(jié)。肝纖維化是許多慢性致病因子如酒精、化學(xué)物質(zhì)四氯化碳、藥物撲熱息痛等對(duì)直接作用于肝臟造成損傷而引起肝內(nèi)纖維結(jié)締組織廣泛增生并沉積的病理過程，其主要的特征是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix）合成與降解失去平衡，最終導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞肝功能發(fā)生紊亂[1,2]。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[3,4]，肝纖維化的病理病變是可以預(yù)防并治療的。如何預(yù)防、阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化是當(dāng)今肝病研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。國內(nèi)外諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，許多天然產(chǎn)物具有清除自由基、抗氧化、抗炎等多種生物活性，通過下調(diào)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物、炎癥因子的表達(dá)而減少纖維組織的增生沉積，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化[4,5]。因此，人們將目光聚焦于天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用，希望尋找到治療肝損傷，逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效單體物質(zhì)。

近年來，有相關(guān)研究報(bào)道了百合鱗片的部分生理功效，包括抗氧化、抗炎和抗癌等藥理活性，但是百合花花瓣的抗氧化活性、對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制尚未有人研究。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[6,7]從卷丹百合花（Lilium lancifolium）花瓣中提取花青素，通過建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST活力值及肝組織勻漿超氧化物歧化酶 SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px的活力、丙二醛MDA的含量，研究卷丹百合花花青素的抗氧化活性，探討其對(duì) CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠是否有保護(hù)機(jī)預(yù)防作用。于此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還采用Western Blot的方法初步分析了卷丹百合花花青素對(duì)肝保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重220～250 g，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2008-0004。

1.2 藥物與試劑

卷丹百合花花瓣（江蘇南京藝馨花卉有限公司）；四氯化碳CCl4（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；食用油；無水乙醇（上海生化）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所；小鼠抗大鼠 α-SMA單克隆抗體（美國Abcom），小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體（美國Abcom）。其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

離心機(jī)（飛鴿牌系列）；分析天平，HANGPING FA1004；超聲儀，廈門華益通超聲設(shè)備有限公司；恒溫水浴裝置，TB-85型，日本島津公司；酶標(biāo)儀，KHB ST-360，上?？迫A；免疫印跡電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.4 方法

1.4.1 百合花花青素提取

根據(jù)文獻(xiàn)方法略微調(diào)整后提丹百合花花青素[8,9]，步驟如下：將卷丹百合花花瓣粉碎，80%乙醇75 ℃回流提取3次，提取液合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇至無醇味，用蒸餾水配成1 g/mL的百合花醇提物。混合液經(jīng)101大孔樹脂分離得到花青素溶液，收集后經(jīng)武漢大學(xué)分析實(shí)驗(yàn)中心HPLC檢測(cè)為花青素類物質(zhì)。提取樣品回收乙醇，濃縮干燥成膏，水溶解制成高低兩個(gè)濃度，即1 g/kg和0.5 g/kg。

1.4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)

1.4.2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)將32只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Sham）、肝纖維化模型組（M）、百合花花青素低劑量組（LFF，0.5 g/kg）和百合花花青素高劑量組（LFF，1 g/kg），每組各8只。除Sham組外，其余三組大鼠皮下注射50% CCl4花生油溶液2.5 mL/kg進(jìn)行造模，每周2次，連續(xù)造模8周，首次造模CCl4花生油劑量加倍，正常大鼠皮下注射等量生理鹽水。造模同時(shí)，給藥組大鼠分別給予 1 g/kg和 0.5 g/kg的百合花花青素灌胃，Sham組和M組以等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。末次給藥24 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈采血后4500 r/min離心10 min，分離得到血清，同時(shí)采集肝臟等臟器組織-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

（1）血清生化指標(biāo)：取血清上清液，按試劑盒操作步驟ALT、AST活力值。

（2）肝組織勻漿生化指標(biāo)：制備 10%肝組織勻漿（生理鹽水）樣本，取上清液按照試劑盒操作步驟，測(cè)得SOD、CAT、GSH-Px的活力和MDA的含量。

（3）免疫印跡 Western-blot檢測(cè)肝組織 TGF-β1和 α-SMA的表達(dá)：蛋白裂解液提取蛋白樣品，BCA法檢測(cè)樣品蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取?5 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂奶粉封閉PVDF膜。剪下不同區(qū)域的PVDF膜，分別加小鼠抗大鼠的TGF-β1、α-SMA和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBST搖床震蕩漂洗8 min×4次；加入1:4000的二抗室溫孵育 1 h，TBST搖床震蕩漂洗 8 min×4次；ECL法曝光顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異用單因素方差分析，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響

當(dāng)肝組織受損時(shí)，血清中ALT、AST這兩種酶活性的增高反映了肝細(xì)胞的損害程度。由表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，模型M組大鼠血清中ALT、AST水平分別升高至257.64±23.53 U/L和384.36±32.68 U/L，約是正常Sham組的6倍（p<0.05或p<0.01）。

表1 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠血清中ALT和AST含量影響Table 1 The effect of Lilium lancifolium anthocyanins on the ALT and AST content in serum of liver fibrosis rats

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，模型M組大鼠在CCl4連續(xù)造模8周后血清中的ALT、AST顯著升高，造成了肝損傷。給予百合花花青素LFF灌胃治療后，低劑量組大鼠血清中 ALT、AST水平下降至 M 組的一半（p<0.05），而高劑量組大鼠血清中 ALT、AST明顯降低至 65.67±17.38 U/L 和85.58±13.68 U/L（p<0.01），接近正常水平。肝損傷大鼠在給予百合花花青素治療后，血清中ALT、AST較M組明顯下降，且百合花花青素對(duì)大鼠肝臟的保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量依賴性，對(duì)肝功能的改善作用隨濃度的增加而增加。本研究這一結(jié)果和Al-Dbass等人的研究相似，中藥醇提物抗肝損傷呈現(xiàn)劑量依賴性[4]，首次發(fā)現(xiàn)百合花花青素具有良好的肝功能改善作用。

2.2 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px及MDA的影響

肝纖維化中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）能清除自由基及過氧化物，從而避免氧化應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞造成的損傷，保護(hù)肝臟。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，肝纖維化程度越重，肝組織釋放的 MDA也越多。

從表2中可知，模型M組大鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px活力分別下降至 109.54±28.38 U/mg pro、13.56±6.37 U/mg pro 和435.23±108.95 U/mg pro，而MDA升高至14.84±2.37 nmol/mg pro，與空白Sham組比較，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05或 p<0.01）。給予百合花花青素 LFF干預(yù)治療后，低劑量組大鼠SOD、CAT、GSH-Px活力較M組均有明顯上升，分別增加至 175.78±21.74 U/mg pro、27.46±8.57 U/mg pro和496.96±115.64 U/mg pro（p<0.05）；高劑量組大鼠上述指標(biāo)進(jìn)一步回升接近正常水平，分別為215.87±23.78 U/mg pro、35.86±6.03 U/mg pro 和568.63±94.58 U/mg pro和M組比較結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05或p<0.01）。低劑量和高劑量給藥組MDA含量較M組明顯降低，分別下降至9.25±2.51 nmol/mg pro和6.79±2.38 nmol/mg pro（p<0.05或p<0.01）。SOD、CAT、GSH-Px在肝纖維化病理發(fā)展中，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活性反映了機(jī)體清除氧自由基和過氧化物的能力。

機(jī)體防御體系抗氧化能力越強(qiáng)，則可避免細(xì)胞膜受到攻擊產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物 MDA，從而逆轉(zhuǎn)有害物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的損傷[8]。本研究給藥干預(yù)后，大鼠肝組織抗氧化酶活力SOD、CAT、GSH-Px顯著上升，脂質(zhì)過氧化物MDA生成減少。這表明百合花花青素具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，能抵御氧化應(yīng)激造成的肝損傷。百合花花青素通過增強(qiáng)肝臟的抗氧化功能對(duì)肝纖維化有一定的治療和保護(hù)作用，且療效與百合花花青素所用劑量正相關(guān)。這和李曉斐等人的研究色素抗肝損傷的結(jié)果一致[10]，百合花花青素具由較強(qiáng)的抗氧化能力，治療肝損傷效果優(yōu)于紅花紅色素。

表2 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中抗氧化物指標(biāo)的影響Table 2 The effect of Lilium lancifolium anthocyanins on the antioxidant indexes in liver tissue of liver fibrosis rats

2.3 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響

圖1 百合花花青素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of Lilium lancifolium anthocyanins on the expression of TGF-β1 and α-SMA in liver of liver fibrosis rats

從圖1中可知，與空白Sham組比較，模型M組大鼠肝組織中TGF-β1和α-SMA表達(dá)增加了近2倍，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05或 p<0.01）。百合花花青素能明顯減少肝組織TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，給藥組大鼠肝纖維化相關(guān)指標(biāo)降低。尤其是低劑量組和高劑量組大鼠肝組織 α-SMA表達(dá)顯著下調(diào)，結(jié)果呈現(xiàn)劑量依賴性。

CCl4在肝組織富集可啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)釋放脂質(zhì)過氧化物，進(jìn)而誘導(dǎo) Kuffer大量表達(dá) TGF-β1。TGF-β1激活肝星狀細(xì)胞后作用于細(xì)胞上的I型受體，刺激膠原纖維的前體物質(zhì)大量釋放。α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物，也是膠原纖維合成的相關(guān)物質(zhì)。TGF-β1和α-SMA的大量表達(dá)使得細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶及膠原纖維的分泌釋放失衡，加劇了肝纖維化程度[9,10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥組大鼠肝組織中TGF-β1、α-SMA 表達(dá)量較模型組顯著降低，表明百合花花青素能有效的對(duì)抗 CCl4引起的肝星狀細(xì)胞活化，逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程，改善肝功能。

3 結(jié)論

3.1 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型是研究藥物護(hù)肝活性的經(jīng)典方法，其肝臟病理變化類似臨床肝纖維化。肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展受諸多因素的影響，如氧化應(yīng)激、炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)、細(xì)胞因子的激活與釋放等[8]。這些因素相互影響相互促進(jìn)，最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)締組織增生發(fā)生肝纖維化。因此，人們認(rèn)為抗氧化減少氧化應(yīng)激過程中相關(guān)細(xì)胞因子的釋放、下調(diào)纖維化物質(zhì)的表達(dá)，是治療、預(yù)防肝纖維化的重要靶點(diǎn)之一[9,11]。百合是中醫(yī)領(lǐng)域傳統(tǒng)的中藥藥材，研究表明百合提取物中的有效成分具有一定的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生理活性?；谶@一觀點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)就百合花提取物花青素改善 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

3.2 本文研究結(jié)果首次證實(shí)，百合花花青素能通過降低大鼠血清中ALT、AST水平平，增加肝組織抗氧化酶活力SOD、CAT、GSH-Px，減少脂質(zhì)過氧化物MDA的生成，起到保護(hù)肝臟的作用。百合花花青素可以清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基和過氧化物，具有良好的抗氧化能力，進(jìn)而顯著改善大鼠地肝損傷。百合花花青素通過下調(diào)肝組織TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化形成。百合花花青素的護(hù)肝效應(yīng)機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過氧化物損傷及下調(diào)細(xì)胞外纖維組織增生有關(guān)。

3.3 綜上所述，百合花花青素具有抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用，其可能的機(jī)制是通過抗氧化介導(dǎo)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，使TGF-β1和α-SMA表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活性受到抑制，細(xì)胞外間質(zhì)增生沉積減少，纖維化程度減輕。

[1]B S da Silva, G B Rodrigues, S W Rocha, et al. Inhibition of NF-kappaB activation by diethylcarbamazine prevents alcohol-induced liver injury in C57BL/6 mice [J]. Tissue &Cell, 2014, 46(5): 363-371

[2]Y Ijiri, R Kato, M Sadamatsu, et al. Chronological changes in circulating levels of soluble tumor necrosis factor receptors 1 and 2 in rats with carbon tetrachloride-induced liver injury [J].Toxicology, 2014, 316: 55-60

[3]G L Tipoe, T M Leung, E C Liong, et al.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) reduces liver inflammation, oxidative stress and fibrosis in carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in mice [J].Toxicology, 2010, 273(1-3): 45-52

[4]A M Al-Dbass, S K Al-Daihan, R S Bhat. Agaricus blazei Murill as an efficient hepatoprotective and antioxidant agent against CCl4-induced liver injury in rats [J]. Saudi Journal of Biological Sciences, 2012, 19(3): 303-309

[5]M Vuda, R D'Souza, S Upadhya, et al. Hepatoprotective and antioxidant activity of aqueous extract of Hybanthus enneaspermus against CCl4-induced liver injury in rats [J].Experimental and Toxicologic Pathology: Official Journal of the Gesellschaft Fur Toxikologische Pathologie, 2012, 64(7-8): 855-859

[6]B Shen, H Chen, C Shen, et al. Hepatoprotective effects of lignans extract from Herpetospermum caudigerum against CCl4-induced acute liver injury in mice [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2015, 164: 46-52

[7]B Lu, Y Xu, L Xu, et al. Mechanism investigation of dioscin against CCl4-induced acute liver damage in mice [J].Environmental Toxicology and Pharmacology, 2012, 34(2):127-135

[8]W Peng, C Zhang, H Lv, et al. Comparative evaluation of the protective potentials of human paraoxonase 1 and 3 against CCl4-induced liver injury [J]. Toxicology Letters, 2010, 193(2): 159-166

[9]R Jeyadevi, T Sivasudha, A Rameshkumar, et al. Phenolic profiling by UPLC-MS/MS and hepatoprotective activity of Cardiospermum halicacabum against CCl4induced liver injury in Wistar rats [J]. Journal of Functional Foods, 20113,5: 289-298

[10]Y Xie, H Hao, H Wang, et al. Reversing effects of lignans on CCl4-induced hepatic CYP450 down regulation by attenuating oxidative stress [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2014, 155: 213-221

[11]李曉斐,李志珂,武雙嬋,等.紅花紅色素對(duì)小鼠急性 CCl4性肝損傷的作用[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(7):1569-1573 LI Xiao-fei, LI Zhi-ke, WU Shuang-chan, et al. Effect of safflower red pigment on acute liver injury induced [J].Modern Food Science and Technology, 2013, 29(7): 1569-1573