馬立克病病毒miR-M4-5p宿主靶基因cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定

薛正飛，滕 蔓，李會珍，馬圣明,3，宋利娜，張 雅，羅 俊,3，張改平*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002； 2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室，河南省動物免疫學(xué)重點實驗室，鄭州 450002；3. 河南科技大學(xué)，動物科技學(xué)院，動物疫病與公共安全重點實驗室，洛陽 471003)

馬立克病(Marek’s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染雞引起的一種腫瘤性免疫抑制性傳染病[1]。MDV屬于皰疹病毒科,α-皰疹病毒亞科,馬立克病毒屬。依據(jù)生物學(xué)特性的不同,MDV可分為血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(HVT)三種血清型[2],而在最新的病毒分類中又被重新命名為禽皰疹病毒2型(GaHV2)、禽皰疹病毒3型(GaHV3)和火雞皰疹病毒Ⅰ型(MeHV1)[3]。其中,僅MDV-1具有致病性和致瘤性。目前,雖然可以用疫苗較好地預(yù)防MD腫瘤發(fā)生,但由于疫苗免疫壓力及病毒自身進(jìn)化等原因,MDV流行毒株的毒力正不斷增強[4]。MDV感染雞群后不僅導(dǎo)致宿主免疫抑制,而且可快速誘發(fā)腫瘤及大批雞死亡,因此MDV感染被認(rèn)為是研究皰疹病毒致病和致腫瘤的理想模型[5]。

microRNA(miRNA)是一類長度為21～25 nt的非編碼小分子RNA,它們在細(xì)胞的發(fā)育與分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等許多生物學(xué)過程中調(diào)控蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[6-7]。 MDV-1共編碼26個成熟體miRNA,其中miR-M4-5p與宿主miR-155具有相同的種子序列,是miR-155的同源物[8]。由于miR-155參與調(diào)控許多腫瘤的形成過程,被認(rèn)為是致癌基因[9-13],miR-M4-5p可能也發(fā)揮著類似的重要作用。最近的研究表明miR-M4-5p在MDV致瘤性方面直接發(fā)揮著重要作用。敲除miR-M4-5p的MDV致病和致瘤能力顯著減弱[14]，但具體的作用機制仍然不是十分清楚。此前通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測和試驗驗證,我們已證實LTBP1是miR-M4-5p一個重要的宿主靶基因[15]。由于生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA的靶基因存在候選分子眾多、篩選及鑒定工作量大等缺點,本研究采用hybrid-PCR的策略構(gòu)建miR-M4-5p的宿主候選靶基因cDNA文庫[16],通過雙熒光素酶報告試驗(dual fluorescence reporter assays, DLRA)分析miR-M4-5p與候選靶基因的相互作用,為進(jìn)一步揭示miR-M4-5p的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

HEK 293T細(xì)胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存；雞胚成纖維細(xì)胞(chick embryo fibroblast,CEF)分離自7～8日齡SPF雞胚。

1.2 主要試劑、載體

TRIzol Reagent，購自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase、PremixTaqTM、DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ、PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser、DNA Ligation kit和pMD19-T(simple)vector,均購自寶生物工程(大連)有限公司；DLRA系統(tǒng),購自Promega公司；Annealing Buffer for Oligos(5×),購自碧云天生物科技公司；psiCHECK-2和pcDNA6.2-miR-neg載體,由中山大學(xué)徐輝博士饋贈；pcDNA6.2-miR-M4-5p、pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p質(zhì)粒和菌種[15],由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室構(gòu)建并保存。

1.3 引物合成

本研究使用的DNA引物均使用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名稱、序列等相關(guān)背景信息見表1。

表1 用于擴(kuò)增或合成候選靶基因3′-UTR的引物

Table 1 Primers used for amplifying the wild type or mutated 3′-UTRs of putative mRNA targets

編號No.引物名稱Primername序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴(kuò)增長度/bpAmplicon1CSNK2A2-3'-UTR-FCSNK2A2-3'-UTR-RCTCGAGATTCACAGTTGCCTCCTGCGGCCGCGAATATGGAATGTAAACAGAT1992PDK3-3'-UTR-FPDK3-3'-UTR-RCTCGAGGGCTTCTGACAGTGGGAGCGGCCGCAAAACATCAAGTAATCTC1993PRICKLE1-3'-UTR-FPRICKLE1-3'-UTR-RCTCGAGTCCCTGAATTTGAAGAAGCGGCCGCGACCCATAAATAACACT2424SEPT2-3'-UTR-FSEPT2-3'-UTR-RCTCGAGAAGTGAGACCACCATTCGCGGCCGCAAGCTCTGCAAATTCAA1755PPFIBP1-3'-UTR-FPPFIBP1-3'-UTR-RCTCGAGTTCTACTCCAAACACCCTGGCGGCCGCTTACGTTGCCCTCTTCA1966COLA-3'-UTR-FCOLA-3'-UTR-RCTCGAGACCCAACTTGCTTTCATGCGGCCGCTTACAGAGCAGCCATCC2057WWTR1-3'-UTR-FWWTR1-3'-UTR-RCTCGAGTGTCCTCAGGCTTCGTTGCGGCCGCCTGGTACTGGCAGATGG2428BCAT1-3'-UTR-FBCAT1-3'-UTR-RCTCGAGTACTGGATAAACTAAAGGAAGCGGCCGCTTGATGAGGAAAACTGC2049MMP2-3'-UTR-FMMP2-3'-UTR-RCTCGAGTTTGCTTCCTGCACTTTGCGGCCGCTGAGAAACATTCCATCA22010RCN1-3'-UTR-FRCN1-3'-UTR-RCTCGAGATCTGTTCTGAATGCTAAAGGCGGCCGCCTACAGGGAGAGCATAAACC22511ANTXR1-3'-UTR-FANTXR1-3'-UTR-RCTCGAGGAATGGGATTTGGTGAGGCGGCCGCGCTTCAGATTTATGGGTT18112PELI2-3'-UTR-FPELI2-3'-UTR-RCTCGAGGTCCCTTCTGCTTCCATGCGGCCGCCTTCCACGGGTACAACA24413TECPR1-3'-UTR-FTECPR1-3'-UTR-RCTCGAGGACTGAGGGTGCTGTAGGCGGCCGCGATTTTATTTGGATGAGC16214VAPB-3'-UTR-FVAPB-3'-UTR-RCTCGAGGCAAGATTCTTCTGCCTCCGCGGCCGCCATCAAACAGGATTGGTCTT18115CIRBP-3'-UTR-FCIRBP-3'-UTR-RCTCGAGATGGACACTGGGCTTGGGCGGCCGCCGTTGGCTTTCCTGCTC21216RFXAP-3'-UTR-FRFXAP-3'-UTR-RCTCGAGTGGTGGAGGTGCTTGCTGCGGCCGCCACAAAACAATTCTTGGTCC22717TBC1D9B-3'-UTR-FTBC1D9B-3'-UTR-RCTCGAGGTGCTGAAGGCAAGGAGGCGGCCGCTACAGGGCAGAGGAGGC18718NT5C3A-3'-UTR-FNT5C3A-3'-UTR-RCTCGAGGAATAAGCCGCGTGCATGGGGCGGCCGCAAGAAAAATATGTATGAAAA18919ITGB5-3'-UTR-FITGB5-3'-UTR-RCTCGAGAGTTGTGCTCGTGGATTGCGGCCGCAACTCTTGTATCCTAATTTC24120CARHSP1-3'-UTR-FCARHSP1-3'-UTR-RCTCGAGGCTGTCTGCGTGGGTCAGCGGCCGCGCATCTGGATTGCCTTT18521GMPS-3'-UTR-FGMPS-3'-UTR-RCTCGAGGCTACATCCCACCTGACGCGGCCGCTTAACAACCGGAACACG190

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

1.4 候選靶基因文庫的構(gòu)建

按照TRIzol RNA提取試劑盒說明書,提取CEF細(xì)胞的總RNA。用NanoDrop-2000全波長紫外分光光度計(Invitrogen公司)測定RNA濃度和純度。按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒說明書，將提取的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行套式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)中miR-M4-5p的種子序列特異性上游錨定引物序列為5′-GRRGGGTTCCGRTRCRGCRTTR-3′(由于miRNA在結(jié)合靶基因時,允許G:U配對，所以在設(shè)計合成特異性錨定引物時，將與U對應(yīng)的堿基用R代替，表示A或G堿基)。取全部PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析3′ RACE PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收介于150～1 000 bp的全部PCR產(chǎn)物,連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞鋪板培養(yǎng),挑選單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng),用miR-M4-5p種子序列特異性錨定引物和inner引物(TaKaRa)進(jìn)行菌液PCR鑒定,將陽性克隆菌的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。分析測序結(jié)果,通過BLAST進(jìn)行序列相似性比對分析,確定候選靶基因的名稱和基因全序列。

1.5 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

以CEF基因組cDNA為模板,優(yōu)先擴(kuò)增miRNA結(jié)合靶點在3′-UTR區(qū)域內(nèi)的29個候選靶基因片段。PCR反應(yīng)體系包括:ExTaq10 μL,候選靶基因3′-UTR上下游引物(表1,#1～29)各1 μL (10 μmol·L-1),CEF cDNA 1 μL(100 ng·μL-1)和ddH2O 7 μL。PCR程序:95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,連接pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞挑單菌落PCR鑒定陽性后送測序,將目的片段從測序正確的T載體上切割下來并回收,與同樣酶切處理的psiCHECK-2回收載體產(chǎn)物4 ℃過夜連接,然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂氨芐抗性平板培養(yǎng)過夜,挑單菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將合成的3′-UTR突變寡核苷酸(表1,#30～36)分別用ddH2O溶解至終濃度為50 μmol·μL-1,進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)體系包括: 無核酸酶水40 μL,寡核苷酸退火緩沖液(5×) 20 μL,正、反寡核苷酸鏈各20 μL (50 μmol·L-1)。反應(yīng)程序: 95 ℃變性2 min,然后每90 s下降1 ℃直至25 ℃。同上所述,構(gòu)建雙熒光報告載體。

1.6 雙熒光素酶報告試驗

psiCHECK2-3′-UTR和pcDNA6.2-miR-M4-5p質(zhì)粒各取300 ng,均勻混于12.5 μL無血清培養(yǎng)基中,按照48孔細(xì)胞板每孔1 μg Lipofectamine 2000和12.5 μL質(zhì)粒的比例均勻混合,按Lipofectamine 2000說明書,將孵育后的Lipofectamine 2000和混合質(zhì)粒(25 μL·孔-1)共轉(zhuǎn)染匯合度為80%～90%的HEK 293T細(xì)胞。以pcDNA6.2-miR-neg為陰性對照,每組均設(shè)3個重復(fù),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染36 h后,將HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)基棄去,用PBS洗2次,然后用DLRA系統(tǒng)進(jìn)行報告基因檢測。首先用20 μL ddH2O稀釋細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,室溫孵育15 min。然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至96孔白底透明酶標(biāo)板中,每孔加入100 μL LAR II,輕柔混合均勻后用Ω酶標(biāo)儀(OMG Labtech)測定螢火蟲熒光素酶數(shù)值。最后向每孔加入100 μL Stop and Glo Reagent,輕柔混合均勻后,同上測定海腎熒光素酶數(shù)值。最后統(tǒng)計分析海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性比值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-M4-5p宿主候選靶基因cDNA文庫的構(gòu)建

將hybrid-PCR產(chǎn)物電泳分析后割膠回收(圖1),連接pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化E.coliJM109后鋪板培養(yǎng),挑取600個單菌落接菌活化后進(jìn)行菌液PCR鑒定,共有580個菌落可以擴(kuò)增出目的條帶(圖2),將這580個樣品送樣測序,共獲得403個有效的基因序列。BLAST分析獲得88個單一基因序列(表2)。其中,結(jié)合位點在3′-UTR的基因有63個,結(jié)合位點在CDS的基因有20個,結(jié)合位點在5′-UTR的基因有5個。結(jié)合位點在3′-UTR的63個基因中有29個基因的結(jié)合位點與miR-M4-5p的種子區(qū)完全互補(包括G:U)。我們優(yōu)先選擇這29個基因進(jìn)行下一步的DLRA試驗分析。

M. DNA marker圖1 Hybrid-PCR特異性引物示意圖(A)和hybrid-PCR產(chǎn)物電泳分析(B)Fig.1 Schematic of miR-M4-5p hybrid primer (A) and agarose gel electrophoresis of PCR products (B)

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～12. 菌液克隆號M. DNA marker; 1-12. Clone number of bacterial fluid圖2 Hybrid-PCR產(chǎn)物的部分菌液PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Identification of part hybrid-PCR products by agarose gel electrophoresis

表2 miR-M4-5p靶標(biāo)文庫候選基因列表

Table 2 Putative target mRNAs of miR-M4-5p

編號No.基因Gene結(jié)合位置Bindingsite編號No.基因Gene結(jié)合位置Bindingsite編號No.基因Gene結(jié)合位置Bindingsite1CSNK2A23'-UTR31RAC13'-UTR61PPM1E3'-UTR2PDK33'-UTR32RBM243'-UTR62PCYT1A3'-UTR3PRICKLE13'-UTR33FKBP73'-UTR63SLC12A43'-UTR4SEPT23'-UTR34MARCKS3'-UTR64RPL27CDS5PPFIBP13'-UTR35NDFIP13'-UTR65RPL12CDS6COLA3'-UTR36ST53'-UTR66CCT2CDS7WWTR13'-UTR37PARD3B3'-UTR67ALAS1CDS8BCAT13'-UTR38RPL173'-UTR68USP14CDS9MMP23'-UTR39SEC16A3'-UTR69ALDH7A1CDS10RCN13'-UTR40CDC423'-UTR70MAP1BCDS11ANTXR13'-UTR41ATP6AP23'-UTR71PSPHCDS12PELI23'-UTR42P4HA13'-UTR72SSBP1CDS13TECPR13'-UTR43TTC193'-UTR73RPS12CDS14VAPB3'-UTR44EPB41L33'-UTR74EXOC3CDS15CIRBP3'-UTR45CCT33'-UTR75COX6CCDS16RFXAP3'-UTR46USPL13'-UTR76RFTN2CDS17TBC1D9B3'-UTR47SSBP23'-UTR77KIAA0947CDS18NT5C3A3'-UTR48MMP163'-UTR78KPNB1CDS19ITGB53'-UTR49APOA13'-UTR79DHX36CDS20CARHSP13'-UTR50DYNC1H13'-UTR80RBBP6CDS21GMPS3'-UTR51LOC4288243'-UTR81TOR1AIP1CDS22BTAF13'-UTR52ANKRD13'-UTR82DNAJA4CDS23AMOTL13'-UTR53TMEM113'-UTR83SEC23BCDS24DAZAP13'UTR54EMG13'-UTR84EBF35'-UTR25NOL83'-UTR55SUMO33'-UTR85CCDC805'-UTR26LOC7768163'-UTR56COCH3'-UTR86CPEB45'-UTR27IGF2R3'-UTR57PSMG43'-UTR87DEDD5'-UTR28RAB3GAP13'-UTR58TAF1D3'-UTR88EIF4A25'-UTR29DDX3X3'-UTR59NRAS3'-UTR30PTGES33'-UTR60FXYD63’-UTR

UTR.非編碼區(qū)；CDS.編碼區(qū)

UTR. Untranslated regions; CDS. Coding sequence

2.2 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建及鑒定

利用表1所示的引物對#1-29,通過PCR從CEF基因組cDNA中擴(kuò)增29個候選靶基因的部分3′-UTR片段(圖3A),經(jīng)測序分析確定目的序列與預(yù)測完全相符,分別提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后電泳割膠回收上述PCR產(chǎn)物,將純化的3′-UTR PCR產(chǎn)物分別連接到psiCHECK2載體上,通過雙酶切驗證和測序鑒定,成功構(gòu)建了29個psiCHECK2-3′-UTR報告載體(圖3B)。

M. DNA marker 圖3 候選靶基因3′-UTR的PCR擴(kuò)增(A)和psiCHECK2-3′-UTR重組質(zhì)粒酶切鑒定(B)Fig.3 The PCR amplification of 3′-UTRs of target genes (A) and identification of the recombinant psiCHECK2-3′-UTR plasmid by double enzyme digestion (B)

2.3 雙熒光素酶報告試驗

第一輪DLRA篩選,將psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒分別和pcDNA6.2-miR-M4-5p質(zhì)粒或陰性對照質(zhì)粒pcDNA6.2-miR-neg共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,36 h后用DLRA系統(tǒng)檢測熒光值并計算相對熒光素酶活性(即海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值)。結(jié)果顯示,在29個候選靶基因中,有19個基因的psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒與pcDNA6.2-miR-M4-5p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞的海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值顯著低于陰性對照組的比值(圖4)。

第二輪DLRA篩選,將第一輪篩選到的19個候選基因再次重復(fù)試驗,但同時加上psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒和pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,DLRA結(jié)果顯示有7個候選基因的psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒和pcDNA6.2-miR-M4-5p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的熒光比值與pcDNA6.2-miR-neg質(zhì)?；騪cDNA6.2-mut-miR-M4-5p質(zhì)粒對照組差異均顯著(圖5)。

第三輪DLRA篩選,首先構(gòu)建第二輪中篩選獲得的7個候選基因的3′-UTR突變體psiCKECK2重組質(zhì)粒,然后同時用這些psiCHECK2-3′-UTR突變體質(zhì)粒代替psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒進(jìn)行DLRA試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1的3′-UTR突變后失去抑制效果,而TBC1D9B的3′-UTR突變后仍有抑制效果,NT5C3A的psiCHECK2-3′-UTR質(zhì)粒和pcDNA6.2-miR-M4-5p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的熒光比值與陰性對照組差異不顯著(圖6)。三輪DLRA結(jié)果表明,PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1可以確定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

誤差線表示三次獨立重復(fù)試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。*.差異顯著(P<0.05)Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖4 DLRA分析miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR的體外相互作用Fig.4 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p and the 3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

誤差線表示三次獨立重復(fù)試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。*.差異顯著(P<0.05)Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖5 DLRA分析miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR突變體的體外相互作用Fig.5 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p and the mut-3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

3 討 論

miRNA通過與不同靶基因相互作用,可以調(diào)控多種生物學(xué)過程。近年來,發(fā)現(xiàn)MDV編碼的病毒miRNA在MD腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。之前的動物攻毒試驗數(shù)據(jù)也顯示,缺失miR-M4前體基因的MDV突變毒株與其親本毒株相比致瘤率顯著下降[14]。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測和試驗驗證,已經(jīng)證實了miR-M4-5p可在感染宿主體內(nèi)靶向調(diào)控宿主基因LTBP1的表達(dá),影響TGF-β的成熟及向胞外分泌的過程,進(jìn)而抑制TGF-β信號通路來激活原癌蛋白c-MYC的過表達(dá),最終可能促進(jìn)誘導(dǎo)MD腫瘤的發(fā)生[15]。目前有多種軟件可用于miRNA的靶基因預(yù)測與分析,但在具體分析時主要遵循以下幾個原則,如miRNA與靶基因的互補性、靶基因在不同物種間的保守性、miRNA-mRNA之間形成雙鏈的穩(wěn)定性等。除了生物信息學(xué)方法之外,也開發(fā)出了很多其他有效的研究策略和方法[17]。用hybrid-PCR通過錨定引物尋找特定miRNA的候選靶基因的方法最早是在2011年提出來的[16],通過模擬miRNA在體內(nèi)與mRNA的靶向結(jié)合調(diào)控過程,利用PCR擴(kuò)增出特定的基因片段,結(jié)合生物信息學(xué)分析初步鑒定這些錨定擴(kuò)增出來的候選基因,從而構(gòu)建一個相對軟件預(yù)測來說更為可信的候選靶標(biāo)文庫,大大降低了后期試驗驗證的工作量。如果再綜合生物學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果可以更好地優(yōu)化miRNA靶基因篩選與鑒定的實驗流程,極大地提高研究效率。

針對MDV-1編碼的miR-M4-5p，我們之前通過軟件預(yù)測并參考相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)找到了一個重要的靶基因LTBP1。本研究中我們又采用hybrid-PCR構(gòu)建候選靶標(biāo)cDNA文庫,初步篩選鑒定的克隆中有63個候選靶基因的預(yù)測結(jié)合位點位于3′-UTR,其中只有25個候選靶基因的預(yù)測結(jié)合位點在CDS或5′-UTR。在這些候選靶基因中，尚未發(fā)現(xiàn)此前已報道鑒定的miR-M4-5p宿主靶基因，這可能與目前篩選鑒定的克隆數(shù)量有關(guān)，也可能與候選靶基因的表達(dá)豐度有關(guān)，因為hybrid-PCR過程可能會導(dǎo)致高豐度表達(dá)的基因掩蓋低豐度基因。多數(shù)情況下,miRNA結(jié)合到靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域以發(fā)揮調(diào)控作用,因此我們首先關(guān)注靶標(biāo)文庫中結(jié)合位點在3′-UTR的63個候選靶基因。進(jìn)一步分

下劃線序列為突變的種子序列或靶點序列;誤差線表示三次獨立重復(fù)試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。*.差異顯著(P<0.05)The underlined nucleotide sequences indicate the mutated seed sequences or binding sites; Error bars indicate the standard deviation (SD) for triplicate experiments. *. Significant difference (P<0.05)圖6 DLRA分析miR-M4-5p、mut-miR-M4-5p與候選靶基因3′-UTR及mut-3′-UTR的體外相互作用Fig.6 Analysis of the in vitro interactions between miR-M4-5p or mut-miR-M4-5p and the 3′-UTR or mut-3′-UTR of putative target genes utilizing dual luciferase reporter assay (DLRA)

析這63個候選靶基因的結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)有29個候選靶基因的預(yù)測靶點序列與miR-M4-5p種子區(qū)完全互補匹配,其他則不完全匹配。miRNA的種子區(qū)對其調(diào)節(jié)功能影響很大,即使一對堿基不互補都可能會顯著影響其調(diào)節(jié)功能,所以我們優(yōu)先針對與miR-M4-5p種子區(qū)完全互補的29候選靶基因進(jìn)行下一步的DLRA鑒定工作。經(jīng)過3輪篩選,逐步縮小篩選范圍。第一輪篩選初步驗證了19個候選靶基因可以與miR-M4-5p相互作用；第二輪篩選進(jìn)一步驗證了7個候選靶基因與miR-M4-5p的相互作用具有種子序列依賴性；而第三輪篩選通過種子序列及靶點雙突變驗證分析,最終將PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1這5個基因鑒定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

在這5種初步鑒定的宿主靶基因中,COLA編碼的蛋白質(zhì)目前尚無相關(guān)功能報道。ANTXR1是跨膜蛋白,其生理狀態(tài)下的功能尚不十分清楚,可能參與細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持[18-19]。PRICKLE1編碼一種核受體,位于細(xì)胞膜表面,其對Wnt/β-catenin信號通路存在負(fù)調(diào)節(jié)作用[20]。miR-M4-5p對PRICKLE1的調(diào)控,可能進(jìn)一步影響Wnt/β-catenin,從而改變多種基因表達(dá),影響細(xì)胞的增殖和死亡。BCAT1編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶1,為支鏈氨基酸分解代謝過程中的關(guān)鍵酶,參與支鏈氨基酸的代謝過程,為組織細(xì)胞的生長代謝提供能量[21],miR-M4-5p對BCAT1的負(fù)向調(diào)控可能削弱宿主的體質(zhì)和免疫能力,從而有利于MDV對宿主的感染。TECPR1編碼的蛋白是一種有關(guān)選擇性自噬的膜融合相關(guān)蛋白,在自噬小體的成熟及促進(jìn)自噬小體與溶酶體融合方面起著重要的作用[22]。其可能參與MDV感染中對宿主的免疫抑制作用,從而有助于MDV在宿主體內(nèi)的感染和增殖，逃避宿主的免疫保護(hù)。DLRA試驗只是在體外驗證了miR-M4-5p與宿主候選靶基因的相互作用,接下來仍需要利用實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印記等實驗方法檢測miR-M4-5p在體內(nèi)是否對上述候選靶基因具有靶向調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步深入研究miR-M4-5p介導(dǎo)MDV感染及致瘤的分子機制奠定重要的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過hybrid-PCR建庫及序列相似性比對分析,構(gòu)建了miR-M4-5p的宿主候選靶基因cDNA文庫；成功構(gòu)建了29個候選靶基因的3′-UTR熒光素酶驗證載體和突變載體；經(jīng)過3輪DLRA分析表明PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1可與miR-M4-5p在體外相互作用，初步鑒定為miR-M4-5p的宿主靶基因。

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