羥基蛋氨酸鋅對斷奶仔豬鎘損傷的修復(fù)作用

劉粉粉，倪姮佳*，黃 攀，吳 信，張 彬，張維軍，姚亞軍，印遇龍1，

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128； 2. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049; 4. 長沙興嘉生物工程股份有限公司，長沙 410001)

鎘(Cadmium，Cd)是自然界存在的天然成分，但是隨著在工業(yè)和生活中的應(yīng)用，其在水體和土壤中的含量逐漸增加，其廣泛的存在性、強蓄積性和臟器毒性已對人體和畜禽的健康形成了重大的安全隱患[1]。我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB13078-2001)規(guī)定豬、雞配合飼料中鎘濃度不得高于0.5 mg·kg-1。然而在鎘污染地區(qū)，部分飼料原料中的鎘含量遠(yuǎn)超這個數(shù)值[2]。腸道上皮細(xì)胞是鎘攻擊機體的第一道靶點，肝和腎是鎘中毒的主要靶點器官[3]。鎘可通過多種機制擾亂組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，首先通過破壞腸道上皮屏障和其緊密連接結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和功能損傷[4]。鎘的肝損傷主要是由于鎘通過與肝抗氧化酶中的金屬輔基發(fā)生競爭性替換，抑制這些酶的活性，造成肝自由基清除能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和氧化應(yīng)激[5]。腎鎘的蓄積會損傷腎的濾過和重吸收功能[6]。鋅和鎘屬于同族元素，二者的化學(xué)性質(zhì)相似，均以二價陽離子形式存在于生物體內(nèi)。體內(nèi)必需金屬離子鋅離子的含量能夠影響鎘離子的生物學(xué)效應(yīng)[7]。但是飼料中的植酸類物質(zhì)易與鋅形成動物機體不能吸收的螯合物[8]，導(dǎo)致無機鋅的利用效率降低。羥基蛋氨酸螯(絡(luò))合鋅(Methionine hydroxy analog chelated zinc，MHZn)是以1個羥基蛋氨酸分子與1～2個鋅原子絡(luò)合而成的化合物。因為絡(luò)合物較穩(wěn)定，能避免腸腔中拮抗因子及其它影響因素對Zn的沉淀和吸附[9]，促使更多的Zn到達(dá)腸道的吸收位點，從而被機體高效吸收和利用。另外，MHZn可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為蛋氨酸[10]，研究表明蛋氨酸能預(yù)防和治療重金屬鎘對機體的傷害[11-12]。因此，MHZn不僅具有雙重營養(yǎng)的功效，其在緩解鎘毒性方面也具有潛在的價值。

本研究利用45日齡仔豬建立鎘暴露模型，研究MHZn對鎘暴露造成的組織損傷的保護作用及機制，為高效緩解或保護鎘暴露造成的機體損傷，以及高效利用微量元素提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無水氯化鎘(純度99.99%，阿拉丁試劑有限公司)、羥基蛋氨酸鋅(含鋅12%)由長沙興嘉生物工程股份有限公司提供。蘇木精、伊紅染料購自南京雨露實驗器材有限公司。所有的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 動物和日糧

試驗選用24頭45日齡的長×大閹公豬，具有相似的初始體重(13.22±1.36) kg，經(jīng)7 d的適應(yīng)飼養(yǎng)后，隨機分為4個處理組，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，單欄飼喂。4個試驗組分別為對照組(Con組)、含鎘日糧組(30 mg·kg-1，Cd組)、鎘(30 mg·kg-1)+ 低濃度羥基蛋氨酸鋅(100 mg·kg-1)日糧組(LMHZn組)、鎘(30 mg·kg-1)+ 高濃度羥基蛋氨酸鋅(200 mg·kg-1)日糧組(HMHZn組)。試驗期間自由采食和飲水，共30 d?；A(chǔ)日糧參照NRC配合而成，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 屠宰和樣品采集

試驗期間每天觀察豬生長情況，記錄飼料消耗情況，第31天清晨對豬進行空腹稱重, 計算仔豬平均日增重、日采食量、料重比，前腔靜脈采血5 mL，室溫靜置1～2 h，3 500 r·m-1離心10 min，取上清液1.5 mL置離心管內(nèi)，-80 ℃低溫冰箱保存待測。屠宰、采樣，稱量肝、腎、脾重量，計算仔豬臟器系數(shù)；取十二指腸、空腸、回腸、肝、腎部分組織迅速放入4%多聚甲醛溶液，搖勻，用于病理切片檢測。其余儲存于-20 ℃用于其他指標(biāo)的檢測。其中，料重比=平均日采食量(kg)/平均日增重(kg)；臟器系數(shù)=臟器重量(kg)/仔豬末重(kg)×100%。

表1 基礎(chǔ)日糧及營養(yǎng)水平

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet

%

1). 預(yù)混料為每千克飼糧提供：維生素A 17 809.4 IU；維生素D35 479.8 IU；維生素E 43.84 mg；維生素K310.96 mg；維生素B15.48 mg；維生素B213.70 mg;維生素B66.58 mg；維生素B1254.80 μg；煙酸/煙酰胺 54.80 mg；葉酸 2.74 mg；泛酸鈣 27.40 mg；生物素 328.79 μg；維生素C 109.60 mg；膽堿 1 643.94 mg；食鹽 2 959.09 mg；賴氨酸 5 476.79 mg；蛋氨酸 1 753.53 mg；蘇氨酸 2 191.92 mg；酸化劑1 973.73 mg；CuSO4·5H2O 328.79 mg; MnSO4·H2O 219.19 mg; ZnSO4·H2O 109.60 mg; 甘氨酸鐵 657.58 mg；1%碘21.92 mg；1%硒 21.92 mg；1%鈷 21.92 mg；肽生素 986.36 mg；統(tǒng)糠 6 970.30 mg；白糖 7 890.96 mg

1). Supplied per kilogram of finished feed: Vitamin A 17 809.4 IU; Vitamin D35 479.8 IU; Vitamin E 43.84 mg; Vitamin K310.96 mg; Vitamin B15.48 mg; Vitamin B213.70 mg; Vitamin B66.58 mg; Vitamin B1254.80 μg; Niacin/niacinamide 54.80 mg; Folic acid 2.74 mg; Calcium pantothenate 27.40 mg;Biotin 328.79 μg; Vitamin C 109.60 mg; Choline 1 643.94 mg; Salt 2 959.09 mg; Lysine 5 476.79 mg; Methionine 1 753.53 mg; Threonine 2 191.92 mg; Acidulant 1 973.73 mg;CuSO4·5H2O 328.79 mg; MnSO4·H2O 219.19 mg; ZnSO4·H2O 109.60 mg; Glycine iron 657.58 mg;1% iodine 21.92 mg;1% selenium 21.92 mg;1% cobalt 21.92 mg;Peptide raw 986.36 mg; Mixture of rice chaff and husk 6 970.30 mg; White sugar 7 890.96 mg

1.4 肝、腎、十二指腸、空腸、回腸組織切片的制作

將固定的組織樣經(jīng)水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后, 在室溫下切成5 μm的切片，蘇木精-伊紅染色，用正置熒光顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯)觀察病理變化，測量各腸段的絨毛高度、隱窩深度。參照陳恒燦等[13]的方法處理和觀察小腸形態(tài)學(xué)變化，肝和腎病理學(xué)變化觀察參照R.E.Dudley等[14]的方法。

1.5 肝、腎中微量元素測定

-20 ℃環(huán)境中取出仔豬肝、腎，切取 0.5 g左右大小的組織塊，濾紙吸去表面水分，電子天平準(zhǔn)確稱量重量后置于一錐形瓶中。向錐形瓶加入20 mL硝酸與高氯酸的混合液 (4∶1)，通風(fēng)櫥內(nèi)靜置過夜充分消化。低火緩慢加熱錐形瓶，直至瓶內(nèi)變透明，液體完全被蒸發(fā)。用 1%的硝酸溶液重新溶解錐形瓶內(nèi)剩余物，定容至 10 mL后可用于檢測。取少量的上樣液用電感耦合等離子光譜發(fā)生儀(720 ES，安捷倫)檢測其中各離子的含量。

1.6 血漿生化指標(biāo)測定

用全自動生化分析儀(cobas c311)進行血漿生化指標(biāo)的測定。測定內(nèi)容：白蛋白(Albumin，ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血肌酸酐(Creatinine，CREA)、血糖(Blood glucos，GLU)、磷(Phosphorus，P)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)、血氨(Blood ammonia，NH3L)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、總蛋白(Total protein，TP)、二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)， 差異顯著時采用Duncan氏法進行組間多重比較，P<0.05為差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬生長性能和臟器系數(shù)的影響

生長性能測定結(jié)果顯示(表2)，含鎘日糧顯著降低了仔豬的平均日增重(P<0.05)，提高了料重比(F/G)(P<0.05)。在含鎘日糧中添加MHZn時，仔豬日增重顯著升高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)，并與Con組無顯著差異(P>0.05)。

臟器系數(shù)檢測結(jié)果顯示(表2)，Cd組相較于Con組肝臟系數(shù)顯著增大(P<0.05)，當(dāng)MHZn添加量為200 mg·kg-1時，仔豬肝臟系數(shù)顯著低于Cd組(P<0.05)，且接近Con組水平(P>0.05)，各處理組間腎臟系數(shù)、脾臟系數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

表2 仔豬生長性能和臟器系數(shù)

Table 2 Growth performance and organ coefficients of piglets

項目Item對照組Con鎘Cd鎘+MHZn(低)LMHZn鎘+MHZn(高)HMHZn平均日增重/(kg·d-1)Averagedailygain0.67±0.08a0.54±0.05b0.64±0.05a0.64±0.05a平均日采食量/(kg·d-1)Averagedailyintake1.10±0.101.00±0.091.06±0.101.09±0.06料重比Feed-gainratio1.63±0.12a1.88±0.13b1.67±0.14a1.72±0.17a肝臟系數(shù)Livercoefficient2.35±0.17b2.73±0.13a2.56±0.13ab2.45±0.11b腎臟系數(shù)Kidneycoefficient0.45±0.060.41±0.020.43±0.030.45±0.03脾臟系數(shù)Spleencoefficient0.18±0.030.19±0.020.18±0.030.18±0.04

同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Different letters in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05), same letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05). The same as below

2.2 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬組織病理損傷的影響

腸道組織病理學(xué)分析結(jié)果(圖1B、1F、1J)顯示，鎘能致十二指腸、空腸損傷，而對回腸的損害作用較小。圖2也表明，相較于Con組，Cd組十二指腸和空腸的絨毛長度顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著增高(P<0.05)，絨毛長度/隱窩深度比顯著降低(P<0.05)。LMHZn和HMHZn組相較于Cd組,

圖1 仔豬十二指腸、空腸、回腸、肝、腎病理學(xué)分析(100×)Fig.1 Histopathologic analysis of duodenum, jejunum, ileum, liver and kidney in piglets (100×)

圖2 仔豬小腸絨毛長度、隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度Fig.2 Villus length, crypt depth and the ratio of villus height/crypt depth of the small intestine of piglets

十二指腸和空腸絨毛長度顯著升高(P<0.05)，空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)。HMHZn組相較于Con組，十二指腸絨毛長度、隱窩深度，空腸隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度比無顯著差異(P>0.05)。

圖1M～1P顯示，Cd組仔豬肝細(xì)胞腫脹，胞內(nèi)有空泡，并伴隨大范圍的顆粒變性和脂肪變性；在含鎘日糧中添加MHZn時，可有效緩解上述癥狀。圖1Q～1T顯示，Cd組仔豬的腎小管上皮細(xì)胞變性，細(xì)胞內(nèi)可見固縮核；部分腎小管上皮細(xì)胞脫落至管腔，并伴有淋巴細(xì)胞增生；隨著MHZn添加濃度的升高，上述癥狀逐漸減輕。

2.3 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬肝、腎中鎘及其他微量元素含量的影響

肝中鎘和微量元素含量檢測結(jié)果顯示(表3)，Cd組鎘、錳含量顯著高于Con組(P<0.05)，鐵含量顯著低于Con組。在含鎘日糧中添加MHZn時，與 Cd組相比，LMHZn組與HMHZn組鎘、錳含量顯著降低(P<0.05)。

腎中鎘和微量元素含量檢測結(jié)果顯示(表3)，Cd組鎘、銅、鋅含量顯著高于Con組(P<0.05)，鐵含量顯著低于Con組(P<0.05)。在含鎘日糧中添加MHZn，相較于Cd組HMHZn組鎘含量顯著降低(P<0.05)。

2.4 羥基蛋氨酸鋅對鎘中毒仔豬血漿生化指標(biāo)的影響

表4結(jié)果顯示，與Con組相比，Cd組血漿中ALB含量顯著降低(P<0.05)，TP含量呈下降趨勢(P>0.05)，DAO酶活呈上升趨勢(P>0.05)。與Cd組相比，LMHZn組和HMHZn組的ALB和TP有所回升，DAO酶活降低，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表3 仔豬肝、腎中鎘、銅、鐵、鎂、錳、鋅和鈣的含量

Table 3 Concentrations of cadmium, copper, iron, magnesium, manganese, zinc and calcium in liver and kidney of piglets

μg·g-1

3 討 論

仔豬鎘中毒會導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩，J. Du等[15]研究表明，(17.25±0.07) kg的仔豬日糧中添加30.49 mg·kg-1的 CdCl2，飼喂29 d，仔豬平均日采食量顯著降低，料重比顯著增高。C.Phillips等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，斷奶30 d的仔豬飼糧中以Cd(NO3)2·4H2O的形式添加2.50 mg·kg-1的鎘，3周后仔豬平均日增重，日采食量顯著降低。 本研究結(jié)果顯示，仔豬飼喂含鎘日糧后，平均日增重顯著降低(P<0.05)，料重比顯著升高(P<0.05)，表明鎘影響了仔豬的正常生長發(fā)育，這一結(jié)果與以往報道的一致[15-19]。在含鎘日糧中同時添加MHZn時，仔豬日增重顯著升高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)，并與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明MHZn可有效減少鎘對仔豬的生長抑制作用。

表4 仔豬血漿生化指標(biāo)的測定結(jié)果

Table 4 Analysis of plasma biochemical parameters of piglets

項目Item對照組Con鎘Cd鎘+MH-Zn(低)LMHZn鎘+MH-Zn(高)HMHZn白蛋白/(g·L-1)ALB38.10±2.23a32.03±4.08b34.68±3.06ab35.20±4.24ab谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)ALT55.03±8.4954.27±11.8353.72±13.6854.93±5.10谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)AST53.00±16.5784.00±61.1048.00±15.2455.67±10.29堿性磷酸酶/(U·L-1)ALP162.67±27.66191.83±33.27158.83±38.50186.00±35.03乳酸脫氫酶/(mmol·L-1)LDH713.67±163.70810.33±137.23790.00±124.76801.33±79.53血尿素氮/(mmol·L-1)BUN3.33±0.952.40±0.282.90±0.492.87±0.85血肌酸酐/(μmol·L-1)CREA77.50±9.5286.67±15.2487.00±4.6982.50±5.58血糖/(mmol·L-1)GLU3.90±0.804.08±1.524.67±1.044.12±1.54磷/(mmol·L-1)P3.61±0.203.39±0.383.59±0.193.47±0.19高密度脂蛋白/(mmol·L-1)HDL0.83±0.130.80±0.120.78±0.260.91±0.18低密度脂蛋白/(mmol·L-1)LDL1.15±0.131.15±0.191.21±0.211.23±0.26血氨/(μmol·L-1)NH3L264.60±98.84395.10±152.78303.03±72.23243.75±37.91免疫球蛋白M/(g·L-1)IgM0.67±0.120.76±0.120.81±0.170.67±0.21總蛋白/(g·L-1)TP59.77±1.63ab56.92±4.45b62.93±3.21a59.32±4.73ab二胺氧化酶/(U·mL-1)DAO2.12±0.34ab3.00±1.45a2.00±0.36ab1.86±0.75b

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，含鎘日糧導(dǎo)致仔豬十二指腸和空腸的絨毛長度降低，十二指腸、空腸的隱窩深度增高、絨毛隱窩比減小，這一結(jié)果表明，鎘導(dǎo)致十二指腸和空腸絨毛上皮細(xì)胞的壞死速度超過了更新速度，使得腸道屏障功能受損[20-21]。而MHZn可顯著提高小腸絨毛高度(P<0.05)，降低隱窩深度(P<0.05)，表明MHZn可有效降低鎘導(dǎo)致的腸道損傷，有助于維護腸道健康。MHZn的這一功效可能與其分子中的鋅密切相關(guān)。研究表明，鋅具有保護腸黏膜屏障的功能[22-23]，在鎘暴露條件下補充鋅可通過減少腸道鎘吸收來降低機體的鎘負(fù)荷[24]。

肝、腎是鎘蓄積的主要器官。鎘在肝和腎的過量蓄積會導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞的凋亡與壞死[25-26]。韓新艷等研究發(fā)現(xiàn)，體重27 kg左右杜長大生長豬飼料中添加10.0 mg·kg-1的鎘使肝系數(shù)顯著提高，腎系數(shù)無顯著性變化[27]，本研究結(jié)果與之相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，含鎘日糧在顯著提高仔豬肝鎘含量的同時，還導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，并伴隨大范圍的顆粒變性和脂肪變性等病理性損傷，表明肝已出現(xiàn)明顯的鎘損傷癥狀[14]。在含鎘日糧中添加200 mg·kg-1MHZn時，肝鎘含量顯著降低，并有效緩解了肝病理學(xué)損傷。同時，含鎘日糧組仔豬腎鎘含量顯著增加，并導(dǎo)致部分腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落，核固縮，淋巴細(xì)胞增生。而MHZn可有效緩解腎小管上皮細(xì)胞的變性和損傷，減少淋巴細(xì)胞的增生，表明MHZn可通過減少腎的鎘蓄積，進而減少腎的鎘損傷。因此MHZn能夠緩解肝腎的鎘損傷。

鎘作為二價金屬離子，與其他二價微量元素，如鋅、銅、鐵、鈣等的物理、化學(xué)性質(zhì)相似，因此鎘可與微量元素競爭二價金屬離子轉(zhuǎn)運載體，例如二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1)、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN1，鐵和鎘共用的轉(zhuǎn)運載體)和ZRT/IRT樣蛋白1(ZIP8)等[28]。由于鎘與部分轉(zhuǎn)運載體的親和力高于其它微量元素與轉(zhuǎn)運載體的親和力，會導(dǎo)致鎘被大量吸收，機體出現(xiàn)部分微量元素缺乏的情況[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，含鎘日糧在引起臟器鎘蓄積的同時，還導(dǎo)致了腎中銅、鋅，肝中錳等二價金屬離子的升高，這可能與鎘對二價金屬離子轉(zhuǎn)運載體的調(diào)控以及機體的代償機制有關(guān)。另一方面，含鎘日糧降低了肝、腎中鐵的含量，表明鎘的競爭導(dǎo)致機體對鐵的吸收受到抑制。當(dāng)含鎘日糧中添加MHZn(HMHZn組)時，仔豬肝、腎中的鎘蓄積顯著減少(P<0.05)，表明MHZn抑制了機體對鎘的吸收與蓄積，有助于減少鎘對機體的損傷。同時，由于鎘、鋅與其他微量元素的競爭關(guān)系[30]，鎘和MHZn的使用影響了其他微量元素的吸收和利用，那么同時添加多種氨基酸螯合微量元素是否更有助于減少鎘毒性、維持機體微量元素水平還有待進一步研究。

含鎘日糧降低了血漿白蛋白(ALB)和總蛋白(TP)的含量，而血漿ALB和TP的降低，與肝、腎功能異常和消化道疾病密切相關(guān)[31]，表明鎘影響了機體肝、腎和消化道的功能。在含鎘日糧中添加MHZn時，鎘對ALB和TP的影響有所緩解。二胺氧化酶(DAO)是存在于哺乳動物黏膜或絨毛上層細(xì)胞胞漿中一種活性較高的細(xì)胞內(nèi)酶，其活性和黏膜細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)。腸黏膜和外周血中DAO活性的高低可有效反映腸上皮細(xì)胞的完整性和成熟程度[32]。腸黏膜細(xì)胞受損時，DAO酶活升高。本研究發(fā)現(xiàn)，含鎘日糧導(dǎo)致仔豬DAO酶活升高，表明腸黏膜存在一定的損傷，而HMHZn組的DAO酶活顯著低于Cd組(P<0.05)，進一步表明MHZn有助于減少鎘對腸黏膜的損傷。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，日糧添加100和200 mg·kg-1的 MHZn可有效減少含鎘飼料對仔豬的影響，提高仔豬的生長性能，減少肝、腎中的鎘蓄積及鎘的致毒性，顯著降低鎘對小腸絨毛的損傷。

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