HPLC法測(cè)定喹乙醇預(yù)混劑中喹乙醇的含量

周芷錦，包愛(ài)情，陸春波，林仙軍，陳曉林(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州311101)

喹乙醇是1965年由法國(guó)拜耳Bayer公司首先發(fā)現(xiàn)了它對(duì)動(dòng)物的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，于70年代開(kāi)發(fā)的生長(zhǎng)促進(jìn)劑[1]。由于喹乙醇較強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用，喹乙醇一度被廣泛使用。但研究表明喹乙醇有中度至顯著的蓄積毒性，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸作用，對(duì)人也有潛在的致畸形、致突變和致癌作用[2-3]，因此喹乙醇在美國(guó)和歐盟都被禁止用作飼料添加劑，《中國(guó)獸藥典獸藥使用指南》2010版[4]也明確規(guī)定喹乙醇及其制劑不得用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。農(nóng)業(yè)部第168號(hào)公告[5]中也作了嚴(yán)格規(guī)定，規(guī)定喹乙醇只能用于體重低于35千克的豬，禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。

目前喹乙醇的檢測(cè)方法有ELISA[6]、UPLC[7]、LC-MS/MS[8]，均應(yīng)用于飼料中喹乙醇及動(dòng)物性食品中喹乙醇?xì)埩袅康臋z測(cè)；吳寧鵬[9]等報(bào)道的獸藥中非法添加喹乙醇HPLC-PDA方法的建立則側(cè)重在獸藥中非法添加喹乙醇檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)，尚無(wú)使用高效液相色譜法測(cè)定喹乙醇預(yù)混劑中喹乙醇的含量的報(bào)道。

喹乙醇預(yù)混劑收錄于《中國(guó)獸藥典》2010版一部[10]，采用紫外分光光度法測(cè)定含量，紫外分光光度法具有便捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但專屬性不強(qiáng)，易受其他化合物影響。

因此，本文研究開(kāi)發(fā)了高效液相色潽法測(cè)定喹乙醇預(yù)混劑中喹乙醇含量的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能夠有效地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司； TU-1810紫外分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XS-205電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 乙腈、甲醇為色譜純，Merck KGaA 公司；其余試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q 超純水。喹乙醇對(duì)照品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0061103，含量：99.5%)；喹乙醇預(yù)混劑供試品(批號(hào)分別為20160101，20160102和20160103，規(guī)格均為5%)，由A廠生產(chǎn)；喹乙醇預(yù)混劑供試品(批號(hào)為201611182，規(guī)格為50%)，由B廠生產(chǎn)。喹乙醇預(yù)混劑供試品(批號(hào)為1630101，規(guī)格為50%)，由C廠生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)pH為6.0)-乙腈(92∶8，V∶V)；流速：1.0 mL/min；溫度：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取喹乙醇對(duì)照品約50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺12 mL，振搖約1 min，加入1 mol/L鹽酸溶液12 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(約500 μg/mL)。精密量取適量，用流動(dòng)相稀釋成50 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取喹乙醇預(yù)混劑適量(約相當(dāng)于50 mg喹乙醇)，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺12 mL，振搖約1 min，加入1 mol/L鹽酸溶液12 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例制備不含喹乙醇的陰性對(duì)照樣品，再按2.2.2方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行200～400 nm波長(zhǎng)掃描，記錄喹乙醇的光譜圖(圖1)；同時(shí)記錄對(duì)照品、樣品、陰性樣品的色譜圖(圖2)。該色譜條件下，喹乙醇峰型較好，理論塔板數(shù)大于10000。陰性樣品在混合對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰，表明處方中的其他輔料對(duì)測(cè)定結(jié)果并無(wú)干擾，滿足定量檢測(cè)需要。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密量取喹乙醇對(duì)照品貯備溶液(約500 μg/mL)適量，用流動(dòng)相稀釋成5、10、20、50、100 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，方程為：Y=60928X+8480(R2=1.0000)，線性范圍5～100 μg/mL。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)，喹乙醇濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 對(duì)照品光譜圖Fig 1 The spectrogram of olaquindox

圖2 對(duì)照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C)的色譜圖Fig 2 The chromatogram of the reference substances(A), the sample(B)and the negative sample(C)

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液(50 μg/mL)10 μL,按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果，喹乙醇峰面積的RSD為0.3%,表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)201611182)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算喹乙醇峰面積的RSD為0.6%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)201611182)，分別稱取6份，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中喹乙醇的含量。結(jié)果測(cè)得喹乙醇的含量分別為518.6、510.4、507.9、507.1、508.1、513.9 mg/g；RSD為0.9%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的喹乙醇預(yù)混劑(批號(hào)201611182，含量503.7 mg/g) 50 mg，各6份，置100 mL棕色量瓶中，按照80%，100%和120%三個(gè)水平，分別精密加入20 mg、25 mg、30 mg喹乙醇對(duì)照品，其余按2.2.2項(xiàng)同法處理后，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 Results of recovery tests (n=6)

2.4.6 耐用性 研究比較了Waters Symmetry(4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱和Aglinet XDB(4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱，結(jié)果表明兩者均完全滿足喹乙醇預(yù)混劑的含量測(cè)定；對(duì)流動(dòng)相pH值進(jìn)行了考察，將水相用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.7，6.0和6.3進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明pH微小變化基本不產(chǎn)生影響；對(duì)溫度進(jìn)行了考察，選擇25 ℃，30 ℃和35 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明溫度僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論板數(shù)均無(wú)顯著影響；對(duì)流動(dòng)相有機(jī)相比例進(jìn)行考察，調(diào)整有機(jī)相∶水相為91∶9，92∶8和93∶7(V∶V)，結(jié)果表明除出峰時(shí)間有微小變化外無(wú)顯著差異。綜上所述，建立的方法具有較好的耐用性。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的喹乙醇預(yù)混劑，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中喹乙醇的含量，并與《中國(guó)獸藥典》2010年版一部紫外方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。表中除批號(hào)為1630101的樣品外，其余幾批紫外分光光度法與液相法結(jié)果基本一致。而批號(hào)為1630101的樣品正是由于添加了喹烯酮，導(dǎo)致使用紫外分光光度法檢測(cè)時(shí)，喹烯酮與喹乙醇信號(hào)疊加，增強(qiáng)了響應(yīng)，該研究已經(jīng)由陸春波等人[11]發(fā)表論文做了專門的研究，在此不再贅述。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量/%,n=5)Tab 2 Results of content determination of samples (labelled amount/%, n=5)

3 討論與小結(jié)

3.1 方法條件優(yōu)化

3.1.1 波長(zhǎng)的選擇 在波長(zhǎng)選擇上，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器(DAD)在200～400 nm進(jìn)行了全掃描，結(jié)果顯示喹乙醇在261.5 nm和375.6 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收(圖1)，且261.5 nm波長(zhǎng)處響應(yīng)更大，因此采用262 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 提取溶劑的選擇 在提取溶劑上，因?yàn)猷掖荚诩状嫉瘸Ｓ萌軇┲腥芙庑圆睿贜,N-二甲基甲酰胺中溶解性較好，且部分喹乙醇預(yù)混劑中含碳酸鈣等輔料，因此沿用《中國(guó)獸藥典》2010年版一部，使用N,N-二甲基甲酰胺和1 mol/L鹽酸溶液提取樣品。

3.1.3 流動(dòng)相的選擇 比較了水-甲醇(90∶10)，水-乙腈(90∶10)，0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(90∶10)等流動(dòng)相，結(jié)果表明上述流動(dòng)相均導(dǎo)致喹乙醇峰峰形不夠尖銳，在優(yōu)化的流動(dòng)相下，喹乙醇峰峰形尖銳，理論板數(shù)高，因此選用研究?jī)?yōu)化的流動(dòng)相。

3.2 小結(jié) 研究建立了HPLC法測(cè)定喹乙醇預(yù)混劑中喹乙醇的方法。原標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度法測(cè)定，雖然具有簡(jiǎn)便高效的優(yōu)勢(shì)，但專屬性較差，易受其他化合物干擾，液相方法則較好地解決了該問(wèn)題。檢測(cè)到一批采用紫外方法測(cè)定合格而用試驗(yàn)方法測(cè)定不合格的樣品，充分說(shuō)明開(kāi)發(fā)液相方法的必要性。在合格樣品的測(cè)定上，建立的方法與原紫外分光光度法相比，結(jié)果基本一致，且方法專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能夠有效地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1] Linton A H, Hedges A J, Bennett P M. Monitoring for the development of antimicrobial resistance during the use of olaquindox as a feed additive on commercial pig farms[J]. The Journal of Applied Bacteriology, 1988, 64(4): 311-327.

[2] Chen Q, Tang S, Jin X, Zou J,etal. Investigation of the genotoxicity of guinocetone, carbadox and olaquindox in vitro using vero cells[J]. Food and Chemical Toxicology. 2009, 47(2): 328-334.

[3] Zou J J, Chen Q, Jin X,etal. Olaquindox induces apoptosis through the mitochondrial pathway in HepG2 cells[J]. Toxicology,2011,285(3): 104-113.

[4] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典獸藥使用指南 2010年版化學(xué)藥品卷[S].

Commission of Chineses Veterinary Pharmacopoeia. Guide to Utilization of Veterinary Drug in Veterinary Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2010, Chemical Medicine Volume.

[5] 農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部第168號(hào)公告[S].

Ministry of Agriculture. No.168 Bulletin of The Ministry of Agriculture of The Pepole's Republic of China[S].

[6] 何方洋, 郗日沫, 馮才偉, 等. 喹乙醇藥物ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2011, 43(6): 56-60.

He F Y, Xi R M, Feng C W,etal. Determination of olaquindox by ELISA[J]. Animal Busbandry & Veterinary Medicine, 2011, 43(6): 56-60.

[7] 劉 淳.超高效液相色譜測(cè)定豬肉中喹乙醇的殘留量[J]. 分析儀器, 2015, (2): 44-47.

Liu C. Determination of olaqunindox residue in pork by ultra high performance liquid chromatography[J]. Analytical Instrumentation, 2015, (2): 44-47.

[8] 易錫斌, 裘立群, 劉世琦, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定禽肉組織中鹽酸金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺、地塞米松、替米考星及喹乙醇代謝物的殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2015, 34(3): 346-351.

Yi X B, Qiu L Q, Liu S Q,etal. Simultaneous determination of amantadine hydrochloride, rimantadine hydrochloride, dexamethasone, tilmicosin and olaquindox metabolite residues in poultry tissues by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2015, 34(3): 346-351.

[9] 吳寧鵬, 王麗景, 李慧素, 等. 五種獸藥中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的HPLC-PDA：檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2014, 48(12): 43-49.

Wu N P, Wang L J, Li H S,etal. Determination of olaquindox and mequindox illegally added in five kinds of veterinary drug by HPLC-PDA[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2014, 48(12): 43-49.

[10] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典 2010年版一部[S].

Commission of Chineses Veterinary Pharmacopoeia. Veterinary Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2010 edition, Part1[S].

[11] 陸春波, 高三玉, 羅成江, 等. HPLC-DAD法檢測(cè)喹乙醇預(yù)混劑中違規(guī)添加喹烯酮的研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2017, 51(3): 61-64.

Lu C B, Gao S Y, Luo C J,etal. Determination of quinocetone into olaquindox premix by HPLC-DAD[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(3): 61-64.