柴黃口服液長期毒性試驗研究

劉 靜，劉 欣，魏麗娟，宋婷婷，瞿紅穎，賈 興，耿智霞，魏占勇*，史萬玉(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊，050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊 050041；.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定，071000)

柴黃口服液臨床上主要用于預(yù)防高溫、高濕引起的家禽發(fā)熱、精神不振、食少[1]。為了考察柴黃口服液臨床上長時間應(yīng)用的安全性，對該制劑進(jìn)行了長期毒性試驗研究[2]。試驗通過將柴黃口服液在一定時間內(nèi)高劑量給試驗動物反復(fù)飲喂，觀察動物出現(xiàn)損害的靶組織或靶器官及劑量效應(yīng)關(guān)系，了解試驗動物對柴黃口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評價柴黃口服液能否安全應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)，以保證用藥安全。

1 材 料

1.1 試驗動物 4周齡清潔級Wistar大鼠160只，雌雄各半，體重60±10 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心(合格證編號1411023；1606022)。大鼠購入后觀察飼養(yǎng)一周，投入試驗。

1.2 藥物及試劑 柴黃口服液：河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中試產(chǎn)品(含量：每mL相當(dāng)于柴胡0.5 g、黃芩0.5 g，制法：以上二味，黃芩加水煎煮二次，每次1 h，合并煎液，濾過，濾液加硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，靜置，濾取沉淀，用乙醇適量洗滌后干燥，備用；柴胡用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油；蒸餾后的水溶液與藥液加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.16～1.24(60 ℃)，加入乙醇使含醇量達(dá)60%，攪勻，冷藏24 h，濾過，濾液回收乙醇，得相對密度為1.14～1.16(60 ℃)的濃縮液；加入上述黃芩提取物，調(diào)節(jié)pH值至5.6～5.8，加水至約900 mL，冷藏48 h，加入柴胡揮發(fā)油，濾過，加入蔗糖150 g，苯甲酸鈉3 g，加水調(diào)至1000 mL，攪勻，灌裝，即得。批號：151121)門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(產(chǎn)品批號1400823)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(產(chǎn)品批號140318)、尿素氮試劑盒(產(chǎn)品批號140818)、肌酐試劑盒(產(chǎn)品批號140625)、血清白蛋白測定試劑盒(產(chǎn)品批號151203)、總蛋白測定試劑盒(產(chǎn)品批號160211)、總膽固醇測定試劑盒(產(chǎn)品批號151203)、血糖測定試劑盒(產(chǎn)品批號160521)、甘油三酯試劑盒(產(chǎn)品批號151203)等購于北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1.3 儀器 BC-2800Vet獸用全自動血液細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；A-6半自動生化分析儀：北京松上技術(shù)有限公司；721型分光光度計，上海第三分析儀器廠制造；OLYMPUS生物顯微鏡：日本制造；KD-202輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；電子天平 型號：Precisa 92SM-202A。

2 方 法

2.1 試驗動物及給藥方法選擇 由于新獸藥在臨床實際應(yīng)用中，需要在雞的飲水中連續(xù)添加超過1周，所以將試驗的給藥周期定為90 d；給藥方法理應(yīng)灌胃給藥，但考慮到長達(dá)90 d的灌胃難以確保不對大鼠食道及胃造成損傷，同時巨大的應(yīng)激也會影響試驗結(jié)果。經(jīng)前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，在不顯著影響大鼠飲水量的前提下，柴黃口服液在大鼠飲水中最大可以加到8%(即80 mL/L)，故最后確定以飲水方式給藥，最大劑量定為80 mL/L(即臨床推薦劑量的80倍)。

2.2 試驗分組 體重75±10 g Wistar大鼠160只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組(3個劑量藥物組及對照組)，每組40只，雌雄各20只，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

2.3 試驗劑量及給藥方式 依據(jù)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》獸藥90 h喂養(yǎng)試驗指導(dǎo)原則要求，試驗設(shè)置高、中、低三個劑量以及一個空白對照組，其中高劑量為推薦臨床用藥量(即1 mL/L飲水)的80倍，即在飲水中加80 mL/L柴黃口服液；中劑量為推薦臨床用藥量的40倍，即在飲水中加40 mL/L柴黃口服液；低劑量為推薦臨床用藥量的20倍，即在飲水中加20 mL/L柴黃口服液。給藥周期為90 d，將藥物混于飲水中自由飲用，采食不限[3]。

2.4 觀察指標(biāo)與測定方法

2.4.1 臨床表現(xiàn) 每天觀察各組大鼠的活動、采食、飲水及發(fā)病情況。包括被毛是否貼身或稀疏豎散，是否神態(tài)萎靡、蜷縮不動、過度興奮、躁動驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常。出現(xiàn)中毒反應(yīng)的大鼠取出單籠飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死大鼠時在1 h內(nèi)尸檢。

2.4.2 體重及飼料利用率 分別于給藥30 d和90 d末對各組大鼠進(jìn)行稱重，比較其體重變化情況。同時全程記錄各組飼料消耗量，計算各組飼料利用率[4]。

2.4.3 血液學(xué)檢查 于給藥30 d和90 d末，每組隨機(jī)選取20只大鼠(雌雄各半)摘眼球采血，用全自動血液細(xì)胞分析儀測定白細(xì)胞計數(shù)及分類、紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量測定。

2.4.4 血液生化學(xué)檢查 于給藥30 d和90 d末，每組隨機(jī)選取20只大鼠(雌雄各半)摘眼球取血，分離血清，用試劑盒測定AST、ALT、BUN、CRE、 ALB、TP、CHOL、GLU、TG等血液生化指標(biāo)[5]。

2.4.5 臟器指數(shù) 上述于30 d和90 d末摘除眼球取血的大鼠，在取血前先稱重，取血后剖檢，稱量心、肝、脾、腎、肺的重量，計算各臟器指數(shù)。稱量前用濾紙吸干表面水分。

臟器指數(shù)=臟器濕重(g)/體重(g)×100

2.4.6 組織學(xué)檢查 對照組和高劑量組的試驗大鼠及尸檢異常的試驗大鼠要詳細(xì)檢查，其它劑量組的試驗大鼠在高劑量組檢查有異常時檢查。受檢的臟器為：心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢、睪丸[6-7]。

2.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析，采用多個試驗組和一個對照組間的兩兩比較方法統(tǒng)計。

3 結(jié) 果

3.1 臨床表現(xiàn)變化情況 在整個試驗過程觀察并記錄了高、中、低劑量試驗組和對照組大鼠的毛色潔凈度，四肢、眼和瞳孔、攝食、飲水，糞便以及皮膚有無過敏反應(yīng)。結(jié)果均未見異常。且整個試驗過程所有大鼠未出現(xiàn)死亡和中毒性臨床癥狀。

3.2 動物的體增重及飼料利用率測定結(jié)果 由表1結(jié)果可以看出，柴黃口服液以低(20 mL/L)、中(40 mL/L)、高(80 mL/L)劑量給大鼠飲水。各組于1～30 d及30～90 d期間，無論雌性大鼠還是雄性大鼠，各試驗組大鼠的平均增重和飼料利用率均與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 柴黃口服液對大鼠增重、耗料量及飼料利用率的影響Tab 1 The effect that Chai huang oral liquid is on the weight gain of rats、the feed consumption and on the feed conversion ratio(±SD)

同一列標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)；無不同字母代表差異不顯著(P>0.05)

The same column follow by the different small letter are significantly different (P<0.05). The same column follow by the same small letter are not significantly different (P>0.05).

3.3 大鼠主要臟器指數(shù)的測定結(jié)果 柴黃口服液以20 mL/L、40 mL/L、80 mL/L劑量加入大鼠飲水中飲喂，連續(xù)飲喂30 d和90 d后，分別捕殺受試鼠，稱量主要臟器，計算臟器指數(shù)，結(jié)果詳見表2。

表2 大鼠主要臟器指數(shù)測定結(jié)果Tab 2 Measured results of the main viscera index in rats(±SD)

同一列標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05) ；無不同字母代表差異不顯著(P>0.05)

The same column follow by the different small letter are significantly different (P<0.05). The same column follow by the same small letter are not significantly different (P>0.05).

由表2可知，飼養(yǎng)試驗開始30 d后各劑量組大鼠的主要臟器指數(shù)與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)，各劑量組之間也差異不顯著(P>0.05)。90 d后各劑量組大鼠的主要臟器指數(shù)與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)，各劑量組之間也差異不顯著(P>0.05)。說明長時期飼喂柴黃口服液對大鼠的主要臟器指數(shù)均無明顯不良影響。

3.4 試驗大鼠血液常規(guī)指標(biāo)結(jié)果 由表3可知，給藥一個月后各試驗組與對照組的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量以及白細(xì)胞分類均差異不顯著(P>0.05)，各試驗組之間的血常規(guī)指標(biāo)也均無顯著差異(P>0.05)。給藥三個月后各試驗組與對照組的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量以及白細(xì)胞分類均差異不顯著(P>0.05)，各試驗組之間的血常規(guī)指標(biāo)也均無顯著差異(P>0.05)。說明長期喂柴黃口服液對大鼠的血液學(xué)指標(biāo)無明顯不良影響。

3.5 試驗動物血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果 由表4、表5可以看出，在大鼠飲水中分別加入20 mL/L、40 mL/L、80 mL/L 的柴黃口服液，連續(xù)30 d和90 d后，試驗組的門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(CHOL)、血糖(GLU)和甘油三酯(TG)的含量均與對照組差異不顯著(P>0.05 )，且各試驗組各劑量水平之間差異也不顯著(P>0.05)，說明長期飼喂柴黃口服液對大鼠的肝腎等功能均無明顯不良影響。

表3 大鼠血液常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果Tab 3 Measured Results of routine blood test in rats

RBC：紅細(xì)胞總數(shù)，WBC：白細(xì)胞總數(shù)，Hb：血紅蛋白，Lymph(%)：淋巴細(xì)胞百分率，Mon(%)：單核細(xì)胞百分率，Gran(%)：中性粒細(xì)胞百分率。同一列標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05) ；無不同字母代表差異不顯著(P>0.05)

RBC:Total number of erythrocyte, WBC:Total number of leucocytes, Hb:Hemoglobin, Lymph(%): Lymphocyte percentage, Mon(%):Monocyte percentage, Gran(%). Neutrophilic granulocyte percentage. The same column follow by the different small letter are significantly different (P<0.05). The same column follow by the same small letter are not significantly different (P>0.05).

表4 大鼠30 d末血液生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab 4 Measured results of the blood biochemical indexes in rats on 30 d

AST：門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；BUN：血尿素氮；CRE：肌酐；ALB：血清白蛋白；TP：總蛋白；CHOL：總膽固醇；GLU：血糖；TG：甘油三酯。同一列標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05) ；無不同字母代表差異不顯著(P>0.05)

AST: Aspartate aminotransferase. ALT: alanine aminotransferase. BUN: blood urea nitrogen. CRE: creatinine. ALB: serum albumin. TP: total protein. CHOL: total cholesterol. GLU: blood glucose. TG: triglyceride. The same column follow by the different small letter are significantly different (P<0.05); the same column follow by the same small letter are not significantly different (P>0.05)

表5 大鼠90 d末血液生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab 5 Measured results of the blood biochemical indexes in rats on 90 d

同表4

3.6 各組大鼠剖檢變化觀察結(jié)果 試驗結(jié)束時對各組大鼠進(jìn)行捕殺剖檢，肉眼進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器的外形、體積、色澤是否正常，有無充血、出血、腫脹和壞死等異?，F(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各用藥組與不用藥對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均未見任何異常。表明，柴黃口服液即使連續(xù)90 d的給藥，也未見對大鼠主要臟器外觀形態(tài)造成明顯不良影響。

3.7 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 取高劑量組和不用藥對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢、睪丸等臟器以福爾馬林固定，石臘切片，鏡檢各臟器的組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組與不用藥對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢及睪丸組織學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，均未見明顯異常。

檢查結(jié)果表明，長期毒性試驗過程中，柴黃口服液對大鼠主要臟器的組織結(jié)構(gòu)均未造成明顯不良影響。

4 討論與小結(jié)

黃偉等[8]研究表明 ，長時間給予一定劑量的柴胡總皂苷醇洗脫精制品可造成對大鼠明顯的蓄積毒性，其毒性損傷部位以肝、腎損傷為主，經(jīng)過30 d恢復(fù)期觀察，其臟器損傷基本可恢復(fù)。給大鼠灌服不同劑量的柴胡總皂苷粗提物，各劑量組大鼠在藥后15 d肝毒性表現(xiàn)已非常明顯，21～30 d維持較高損傷水平，具體表現(xiàn)為隨給藥時間的延長，同一劑量的大鼠血清ALT，AST值升高顯著，肝/體比值增大，肝組織病理形態(tài)學(xué)的改變加重。劉芳等[9]研究報道，灌胃(0.19～0.42)mL/kg的柴胡揮發(fā)油均可導(dǎo)致大鼠肝毒性損傷，隨著給藥劑量增大，肝毒性損傷程度明顯增加。柴胡揮發(fā)油所致大鼠肝毒性在呈現(xiàn)一定的“量-效”關(guān)系的基礎(chǔ)上還呈現(xiàn)一定的“時-效”關(guān)系，給藥7 d高劑量組即可發(fā)生明顯的肝毒性，給藥15～21 d肝毒性表現(xiàn)明顯，并開始出現(xiàn)死亡，給藥30 d后大鼠死亡增加，并出現(xiàn)了其它一些繼發(fā)毒性。上述結(jié)果表明柴胡揮發(fā)油致大鼠肝毒性損傷的劑量范圍是(0.19～0.42)mL/kg，相當(dāng)于生藥量(92.6～204.7)g/kg。佟繼銘等[10]研究了大鼠長期口服黃芩莖葉總黃酮產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，結(jié)果，大鼠用藥90 d時2.0 g/kg總黃酮組大鼠RBC高于羧甲基纖維素鈉對照組，停藥14 d恢復(fù)正常。其它組大鼠的各項指標(biāo)均無異常改變，也未發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性毒性反應(yīng)，說明黃苓莖葉總黃酮毒性較低。

趙世萍等[11]研究了柴黃益腎方提取物(CYE)對大鼠的長期毒性，將大鼠隨機(jī)分為4個組，3個劑量組分別為8.8、4.4、2.2 g/kg，連續(xù)灌胃給予CYE6個月，對照組給予同體積生理鹽水。停藥后繼續(xù)觀察4周，測試大鼠體重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器指數(shù)及病理組織學(xué)變化。結(jié)果：高劑量組大鼠體重增長緩慢，3個劑量組與紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)與對照組比較小幅下降，尿素氮與對照組比較小幅上升，高中劑量組肝臟指數(shù)小幅上升，與對照組比較有顯著性差異，以上改變均在正常生理范圍之內(nèi)。說明，CYE在臨床推薦劑量下有一定的安全性。

試驗通過將柴黃口服液在一定時間內(nèi)高劑量給試驗動物反復(fù)飲喂，觀察動物出現(xiàn)損害的靶組織或靶器官及劑量效應(yīng)關(guān)系，并了解試驗動物對柴黃口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評價柴黃口服液能否安全應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)，以保證用藥安全。柴黃口服液的長期毒性試驗為期90 d，主要從一般指標(biāo)、增重及飼料利用、臟器指數(shù)、血液學(xué)常規(guī)、血液生化學(xué)檢查及組織病理學(xué)等六方面觀察該藥對大鼠的慢性毒性反應(yīng)。試驗結(jié)果顯示無論30 d末還是90 d末，受試藥物三個劑量組的上述各項指標(biāo)測定結(jié)果均與對照組無顯著差異(P>0.05)，該藥對試驗動物大鼠未見明顯毒性反應(yīng)，說明柴黃口服液無明顯毒性，在臨床上應(yīng)用是安全的。

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