人參提取液體外抑制IHNV作用效果研究

茆安婷，尹玉偉，代 靜，郭曦堯，程 義，李 東，李月紅(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)，彈狀病毒科，諾拉彈狀病毒屬[1]，作為傳染性造血器官壞死病(infectious heamatopoietic necrosis，IHN)的病原體，是一種線性單鏈RNA病毒，最早在上世紀(jì)50年代在北美西部華盛頓及俄勒岡州于紅大馬哈魚(Oncorhynchus nerka)孵卵期的魚苗身上首次被發(fā)現(xiàn)[2]，并迅速蔓延到歐洲和亞洲，在全世界鮭鱒魚類中流行[3]。目前在對(duì)IHNV的防治措施主要有兩個(gè)方面，其一是抗病育種[4]，其二是通過(guò)對(duì)健康魚體進(jìn)行早期的免疫接種，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)從而達(dá)到預(yù)防病毒的作用。而這兩種方法存在一定的不確定性，同時(shí)對(duì)魚類自身的健康及相關(guān)食品安全存在一定的隱患，雖然目前尚未有相關(guān)報(bào)道表明IHNV會(huì)直接影響人類的健康，但隨著病毒變異、魚機(jī)體的藥物殘留導(dǎo)致的食品安全問題可能會(huì)對(duì)人類的健康造成影響，所以尋找新型藥物迫在眉睫，目前在我國(guó)漁業(yè)養(yǎng)殖中，綠色、無(wú)公害、無(wú)耐藥性的新抗病毒中獸藥將逐步成為市場(chǎng)的主導(dǎo)。為尋找抗傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)的有效藥物，有文獻(xiàn)表明，習(xí)欠云等人[5]發(fā)現(xiàn)人參多糖復(fù)合物對(duì)對(duì)蝦肝臟中SOD超氧化物歧化酶活力有明顯提高效果，對(duì)于血清中PO和LSZ有類似作用；同時(shí)人參皂甙Rb1在體外細(xì)胞試驗(yàn)中能夠滅活病毒[6]。為此試驗(yàn)選取人參提取液對(duì)IHNV進(jìn)行體外抑制方面的研究，為IHVN防治藥物的研發(fā)提供新的思路及參考。

1 材料與方法

1.1 材料 鯉魚腦細(xì)胞系(common carp brain, CCB)細(xì)胞培養(yǎng)液：M199固體培養(yǎng)基(北京Solarbio公司)溶解于蒸餾水中，0.22 μm過(guò)濾，加入10%體積胎牛血清和1%體積雙抗(青霉素-鏈霉素溶液100x，長(zhǎng)春晶美生物)，4 ℃保存。

CCB細(xì)胞維持液：M199固體培養(yǎng)基溶解于蒸餾水中，0.22 μm過(guò)濾，4 ℃保存。

噻唑藍(lán)溶液(MTT溶液)∶50 mg噻唑藍(lán)(長(zhǎng)春夢(mèng)怡美生物科技有限公司)溶解于10 mL蒸餾水中，0.22 μm過(guò)濾，4 ℃保存。

人參提取液：將中藥人參片(購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市百草大藥房，參照中國(guó)藥典2005版附錄IX進(jìn)行質(zhì)量鑒定)運(yùn)用水浴加熱法提取，再將提取得到的藥液通過(guò)水浴鍋濃縮得到浸膏，4 ℃保存[7-8]，使用時(shí)用蒸餾水溶解至飽和，0.22 μm過(guò)濾。

其他材料：上述常用試劑均為分析純，二甲基亞砜(DMSO)、胰酶消化液等購(gòu)自長(zhǎng)春夢(mèng)怡美生物科技有限公司。CCB細(xì)胞、IHNV為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒滴度測(cè)定 將CCB細(xì)胞接種于96孔板中，27 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h備用，將病毒懸液按照10-1-10-10做連續(xù)稀釋后按照100 μL/孔接種于長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)濃度做8孔重復(fù)，梯度降溫至15 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，記錄每孔細(xì)胞病變情況，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(ICID50)[9]。

1.2.2 RTCA[10]實(shí)時(shí)監(jiān)控不同濃度人參提取液對(duì)IHNV的抑制作用 將CCB細(xì)胞以400個(gè)/孔的濃度接種于16孔E-Plate細(xì)胞增殖板內(nèi)，5% CO2、27 ℃培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μL/孔病毒液感染CCB細(xì)胞，對(duì)照組加入無(wú)血清細(xì)胞維持液。5% CO2、15 ℃條件下孵育2 h后棄去病毒液，細(xì)胞維持液洗滌兩次后分別加入100 μL/孔2%、4%、8%人參提取液，每個(gè)濃度3孔重復(fù)，細(xì)胞對(duì)照加入無(wú)血清細(xì)胞維持液。將E-Plate細(xì)胞增殖板放回實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀內(nèi)，設(shè)置每間隔15 min監(jiān)測(cè)并記錄CI值，繼續(xù)監(jiān)測(cè)72 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用人參提取液均為本步驟篩選出抑制效果最佳的人參提取液濃度。

1.2.3 人參提取液對(duì)IHNV的直接滅活作用 將人參提取液與病毒按照1∶1體積混合，27 ℃環(huán)境下分別作用30 min、1 h、2 h、4 h和8 h，加入到長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，100 μL/孔，每時(shí)間點(diǎn)重復(fù)4孔[11]。梯度降溫至15 ℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)80%左右時(shí)，記錄各孔CPE情況，MTT法測(cè)490 nm處OD值，計(jì)算人參提取液對(duì)IHNV的抑制率。

1.2.4 人參提取液對(duì)IHNV復(fù)制的阻斷作用 將毒力100TCID50的病毒液100 μL/孔接入長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，梯度降溫至15 ℃。培養(yǎng)30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h，每時(shí)間點(diǎn)做4孔重復(fù)。達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后棄去病毒液，用細(xì)胞維持液洗滌2次。加入100 μL/孔的人參提取液，5%CO2，15 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)80%左右時(shí)，記錄各孔CPE情況，MTT法測(cè)490 nm處OD值，計(jì)算人參提取液對(duì)IHNV復(fù)制阻斷的抑制率，評(píng)估人參提取液對(duì)IHNV復(fù)制的阻斷作用。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴度測(cè)定結(jié)果 測(cè)定結(jié)果見表1。由公式計(jì)算可得，病毒TCID50=10-5.6，即當(dāng)稀釋度為10-5.6時(shí)，可使孔內(nèi)50%的細(xì)胞發(fā)生病變。

表1 病毒滴度測(cè)定結(jié)果Tab 1 Results of virus titer test

2.2 RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控不同濃度人參提取液對(duì)IHNV的抑制效果 由圖1可知，根據(jù)RTCA實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀檢測(cè)得到的細(xì)胞曲線，細(xì)胞接種24 h 期間各組細(xì)胞曲線均值穩(wěn)定上升，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，加樣前無(wú)明顯停滯或下降趨勢(shì)。加入病毒液后，細(xì)胞經(jīng)溫度和病毒的刺激增殖受到抑制，曲線驟降至同一水平。病毒吸附的4 h后細(xì)胞指數(shù)降低，顯示病毒開始明顯抑制CCB細(xì)胞生長(zhǎng)，而細(xì)胞對(duì)照組仍成穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。從人參提取液對(duì)IHNV的抑制效果上，4%人參提取液對(duì)IHNV的抑制效果最佳，后期與細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞指數(shù)接近。而8%人參提取液在前期促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，后期保護(hù)效果不佳。

圖1 不同濃度人參提取液對(duì)IHNV抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of ginseng extract with different concentrations on IHNV

2.3 人參提取液對(duì)IHNV的直接滅活作用結(jié)果 由表2可知，人參提取液對(duì)IHNV有直接滅活作用，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)抑制率最高達(dá)51.5%，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間抑制率結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。

表2 人參提取液對(duì)IHNV直接滅活抑制率結(jié)果Tab 2 Inhibitory effect of ginseng extract on direct inactivation of IHNV

抑制率結(jié)果一列數(shù)據(jù)右上角標(biāo)注相同字母表示結(jié)果差異不顯著(P>0.05)

the results of the inhibition rate are shown in the upper right corner of the data. The results of the same letter are not significant (P>0.05)

2.4 人參提取液阻斷IHNV復(fù)制結(jié)果 由表3可知，IHNV先作用30 min～16 h后加入的人參提取液對(duì)病毒均具有復(fù)制抑制作用，病毒先作用1～4 h期間，人參提取液抗病毒作用明顯，抑制率接近60%。實(shí)驗(yàn)期間人參提取液均表現(xiàn)出持續(xù)抑制作用，但30 min和16 h時(shí)抑制作用較其他時(shí)間點(diǎn)不明顯。

表3 人參提取液阻斷IHNV復(fù)制抑制率結(jié)果Tab 3 Ginseng extract was used to block IHNV replication inhibition rate

抑制率結(jié)果一列數(shù)據(jù)右上角標(biāo)注相同字母，表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注字母不相同表示差異顯著(P<0.05)

the result of inhibition rate is the same in the top right corner of the data, which means that the difference is not significant (P>0.05), and the letters are different, which means significant difference (P<0.05)

3 討論與小結(jié)

為了探討人參提取液體外抑制CCB細(xì)胞感染IHNV的能力，構(gòu)建體外CCB細(xì)胞模型，運(yùn)用RTCA技術(shù)和MTT法分別測(cè)得2%人參提取液、4%人參提取液和8%人參提取液對(duì)IHNV感染CCB細(xì)胞后抑制作用曲線，從阻斷病毒復(fù)制和殺滅病毒兩方面討論人參提取液作用效果。 研究表明，4%人參提取液對(duì)IHNV具有明顯抑制作用，能夠在一定時(shí)間內(nèi)保護(hù)細(xì)胞不受IHNV病毒的侵染，2 h時(shí)對(duì)病毒滅活抑制率最高達(dá)到51.5%，1～12 h內(nèi)對(duì)病毒復(fù)制有持續(xù)抑制作用，而8%人參提取液在前期促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，后期保護(hù)效果不佳，對(duì)比說(shuō)明人參提取液對(duì)IHNV的抑制不與劑量成依賴關(guān)系。

人參中含有Rg1、Rb1等30多種人參皂苷、α-人參烯等揮發(fā)油、人參酸等有機(jī)酸、人參黃酮苷等黃酮以及木脂素、甾醇、氨基酸、多糖等多種有益成分，其中人參皂苷及多糖等為主要有效成分[5]。而人參皂甙Rb1具有抗病毒的能力，在體外細(xì)胞試驗(yàn)中能夠滅活病毒，使N蛋白表達(dá)下降從而起到抑制病毒復(fù)制的作用[6]。

由于目前IHNV增殖、復(fù)制和與宿主間相互作用的研究匱乏，試驗(yàn)用RTCA實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記技術(shù)測(cè)得4%人參提取液對(duì)IHNV抑制作用明顯，較常見病毒CPE實(shí)驗(yàn)省時(shí)省力，結(jié)果精確，避免了由于病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制作用微弱導(dǎo)致空斑形成不明顯對(duì)試驗(yàn)造成的誤差，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)形成完整細(xì)胞效應(yīng)圖譜，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多項(xiàng)基于細(xì)胞的檢測(cè)，結(jié)果可信度較高[12-16]。MTT法在試驗(yàn)過(guò)程中需將細(xì)胞液吸出，此過(guò)程可能導(dǎo)致細(xì)胞的流失影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，故采用加大重復(fù)試驗(yàn)來(lái)避免誤差形成。而體外細(xì)胞試驗(yàn)具有操作方面、靈敏、不易受外界因素干擾的優(yōu)點(diǎn)。

通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)設(shè)定不同濃度的人參提取液作用于感染IHNV的CCB細(xì)胞，以探究人參提取液對(duì)IHNV的抑制作用及最適抑制濃度，為今后以人參作為防治IHNV的有效藥物奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為結(jié)合我國(guó)傳統(tǒng)中藥開發(fā)防治IHNV的新型藥物提供有效參考。

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