PEC HPI irp2基因缺失株的構建及蛋白結構功能預測

劉超英，吳程華，高 洪，嚴玉霖，富國文，趙 汝(云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201)

耶爾森菌強毒力島(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)主要含有與攝鐵有關的毒力基因簇[1-3]。研究表明，耶爾森桿菌HPI不僅可以通過Ybt的鐵載體奪取宿主中的鐵元素進而加重機體的感染，而且可在耶爾森菌和E.coli之間水平傳播，與致病性E.coli的毒力進化有著密切的關系[4]。irp2基因是HPI中主要的功能基因，在鐵缺乏的條件下可表達高分子量蛋白(High Molecular Weight Protein 2，HMWP2)。高分子量鐵調節(jié)蛋白參與表達耶爾森桿菌素的陽性表型，被認為對鐵載體耶爾桿菌素的合成有著非常重要的作用。因此，致病性E.coli的irp2基因缺失株的構建對致病機制的研究至關重要。

大腸桿菌基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用其自身的RecA同源重組系統(tǒng)編碼的RecA和RecBCD蛋白介導DNA的同源重組。但因該系統(tǒng)存在重組效率低等較多缺點，目前主要采用更為簡單迅速的Red同源重組系統(tǒng)的方法進行基因敲除[5-6]。利用該方法構建致病性大腸桿菌(PathogenicE.coli，PEC)HPIirp2基因缺失株，不僅為HPI毒力致病機理研究提供技術基礎和理論依據(jù)，也為大腸桿菌病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 質粒pKD46、pKD4、pCP20購自優(yōu)寶生物，5株E.coli(A-E)分離株由實驗室分離鑒定保存。試劑及試劑盒主要包括離心柱型質粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、2×power Taq MasterMix、Competent Cell Preparation Kit、Phusion Flash High-Fidelity PCR MasterMix、FastDigest DpnI限制性內切酶等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取和irp2基因的檢測 利用細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取CVCC1565、E.coli(A-E)分離株培養(yǎng)液的DNA，產物保存在-20 ℃，作為PCR模版?zhèn)溆谩８鶕?jù)irp2基因序列(GenBank登錄號：L18881.1)的保守區(qū)域設計上下游引物，irp2-F(5'-3')：TTCCTTCAGCATCGCCTGTTA，irp2-R(5'-3')：CAAGCCCGACATACTCAATCT，由華大基因公司合成。以提取的DNA為模版，irp2-F/R為引物，進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸5 min。擴增結束后，經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在紫外燈下觀察結果，拍照。選擇E.coli(E)為試驗對象，送碩擎公司進行irp2基因測序。

1.2.2 Red同源重組引物的設計 根據(jù)pKD 4序列GENEBANK(AY048743.1)設計引物擴增兩側帶有FRT位點的卡那霉素抗性基因，在上下游引物5'端加入50 bp和45 bp的irp2基因的同源重組臂，同源重組引物為Q1/Q2(劃線部分為同源臂)；根據(jù)pKD 46序列(GenBank登錄號：AY048746.1)設計pKD46質粒鑒定引物bet-F/R；根據(jù)pCP 20序列(GenBank登錄號：HB393402.1)設計pCP 20質粒鑒定引物FLP-F/R；敲除鑒定引物為A1、A2、B1、B2，引物由華大基因合成。引物序列見表1：

表1 同源重組所用引物Tab 1 Primers of homologous recombination

1.2.3irp2缺失株的構建 以質粒pKD 4為模板，Q1、Q2為引物進行PCR反應，制備打靶DNA片段。制作E.coli(E)細胞感受態(tài)，將pKD 46質粒轉化后用特異性鑒定引物bet-F/R鑒定pKD 46陽性菌株，轉化成功的菌株命名為E.coli(E)/pKD 46。過夜培養(yǎng)后制備E.coli(E)/pKD 46電轉化感受態(tài)細胞并進行電轉化，完成后取100 μL菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度為50 μg/mL)上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后使用鑒定引物A1、A2和B1、B2挑選卡那霉素抗性重組子(圖1)。挑選含有Kan+和Amp+雙抗性的陽性轉化株通過FLP重組酶刪除FRT位點之間的抗性序列。用鑒定引物A1、B2對卡那霉素消失的克隆進行鑒定。鑒定正確的菌種命名為E.coli(E)/Δirp2。

圖1 PCR鑒定引物所在位置Fig 1 Scheme of priming sites

1.2.4 HMWP2蛋白結構及功能預測 利用測序得到的irp2基因序列，通過ExPASy開發(fā)的在線工具Protparam分析HMWP2的理論分子量和等電點(pI)；登陸http://www.predictprotein.org/，對HMWP2二級結構進行預測；使用ExPASy開發(fā)的在線工具ProtScale分析HMWP2的親疏水性；使用ExPASy開發(fā)的在線工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋區(qū)，最優(yōu)拓撲結構顯示有9個跨膜螺旋；使用ExPASy開發(fā)的在線工具SWISS-MODEL，與已知結構的PDB數(shù)據(jù)庫中的蛋白質序列進行比對，預測HMWP2的三級結構。

2 結果與分析

2.1E.coliirp2基因的PCR擴增E.coli(A-E)及陰性對照的PCR擴增結果如圖2(M為2000 bp的DNA Marker；1為陰性對照，無條帶；2-6為E.coli(A-E)irp2基因PCR擴增條帶，與預期產物大小一致)。

圖2 E.coli中HPI irp2基因的PCR檢測Fig 2 PCR amplification of HPI irp2 gene of E.coli

2.2 打靶DNA片段的制備和純化 用于替換irp2基因的打靶片段兩端的同源序列分別為45 bp和50 bp，片段中間部分為兩側帶有FRT位點的卡那霉素(Kan)抗性基因，有利于重組子的篩選。純化回收的產物在高保真酶PCR擴增后經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與目的片段的大小一致，見圖3(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為同源重組DNA片段)。

圖3 融合PCR構建的同源重組DNA片段Fig 3 DNA homologous recombination fragment builded by fusiohn PCR

2.3 質粒pKD 46轉化E.coli(E)后的提取驗證 將pKD 46轉化導入到E.coli(E)中，挑選單個菌落在Amp+ LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，提取質粒后進行電泳驗證，轉化的鑒定結果見圖4(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為鑒定結果)：

圖4 質粒pKD 46轉化的提取驗證Fig 4 Extraction and Verification of Plasmid pKD 46

2.4 電轉化后同源重組的鑒定 電轉化后irp2基因被Kan抗性基因片段替換后，如圖1所示，引物A1/A2、B1/B2和A1/B2分別用于擴增片段a、b、c。結果顯示，有3個片段的長度和預計的一樣(圖5)，說明Kmr基因已經(jīng)取代irp2基因，缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2構建成功，正確重組率為10%。

圖5 irp2基因敲除的PCR驗證Fig 5 Verification of irp2 knockout by PCR

2.5 質粒pCP 20轉化E.coli(E)/Kmr+/Δirp2后的提取驗證 將質粒pCP 20轉化導入缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2，涂布于含Kan+和Amp+雙抗性LB平板上，30℃培養(yǎng)篩選陽性轉化子，挑選單個菌落在Amp+ Kan+ LB液體培養(yǎng)基中進行擴增，提取質粒后進行電泳驗證，轉化的鑒定結果見圖6(M為2000 bp的DNA Marker，1-3為目的基因)。

圖6 質粒pCP 20轉化的提取驗證Fig 6 extraction and verification of plasmid pCP 20

2.6 卡那霉素抗性基因的消除鑒定 將成功轉化pCP 20的缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2接種于無抗性的LB液體培養(yǎng)基中，42 ℃下傳3～5代，再用卡那霉素抗性進行檢測，卡那霉素抗性在能夠穩(wěn)定遺傳的菌株中已經(jīng)消除，命名為E.coli(E)/Δirp2。用鑒定引物A1、B2進行驗證PCR和測序驗證，如圖7(M：DNA分子質量標準；1-3：目的基因)。

圖7 卡那霉素抗性基因消除后PCR鑒定Fig 7 PCR analysis after kanamycin resistance gene eliminated

2.7 HPIirp2基因表達的蛋白的預測分析

2.7.1 HMWP2分子量及等電點的預測分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具Protparam分析HMWP2的理論分子量和等電點(pI)分別為：228826.60 Da，5.85。

2.7.2 HMWP2 二級結構的預測分析 登陸http://www.predictprotein.org/，對HMWP2二級結構進行預測，二級結構中α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲所占的百分比分別為：43.5%、10.76%、46.19%，如圖8。

圖8 HMWP2二級結構預測Fig 8 Prediction of HMWP2's Secondary Structure

2.7.3 HMWP2親疏水性分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具ProtScale分析HMWP2的親疏水性。結果顯示總平均疏水指數(shù)為：-0.221，為疏水性蛋白，如圖9。

圖9 HMWP2疏水性預測Fig 9 Prediction of HMWP2's Hydrophobicity

2.7.4 HMWP2跨膜區(qū)分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋區(qū)，最優(yōu)拓撲結構顯示有9個跨膜螺旋，如圖10。

圖10 HMWP2跨膜螺旋預測Fig 10 Prediction of HMWP2's Transmembrane Helices

2.7.5 HMWP2三級結構的預測分析 使用ExPASy開發(fā)的在線工具SWISS-MODEL，與已知結構的PDB數(shù)據(jù)庫中的蛋白質序列進行比對，來預測HMWP2的三級結構，結果如圖11。

圖11 HMWP2三級結構預測Fig 11 Prediction of HMWP2's Tertiary Structure

3 討論與小結

1998年，Murphy[7]首次報道了將λ噬菌體的exo、bet、gam三個重組功能基因在質粒上進行表達，從而利用λ噬菌體的Red功能在E.coli染色體上進行基因替換。與RecA同源重組體系相比，由于Red重組發(fā)生在細胞內，E.coli的復制和修復系統(tǒng)保證了克隆的子代分子完全忠實于親代分子[8]。Red同源重組系統(tǒng)是由λ噬菌體的分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質的exo、bet、gam三個基因組成的。Exo蛋白是一種單亞基分子量為24 kD的核酸外切酶，它的活性形式是一種環(huán)狀的三聚物分子，中間有一個一端能容納雙鏈DNA(dsDNA)，另一端能容納單鏈DNA(ssDNA)的中空通道[9]。Exo蛋白可以結合在dsDNA的末端，從雙鏈DNA從5'端向3'端降解，從而產生3'端突出。Beta蛋白是一種單亞基分子量為25.8 kD的退火蛋白，它可以通過自發(fā)地形成環(huán)狀結構而結合到由Exo降解產生的ssDNA的3'突出端，從而促進ssDNA末端與互補鏈之間的退火，同時Beta蛋白還能防止單鏈核酸酶降解外源線性DNA[10]。Gam蛋白是Exo和Beta的輔助蛋白，功能是防止外源DNA片段被降解掉[11]。

目前用的最多的Red重組質粒是Datsenko[12]構建的具有高效重組能力的的低拷貝質粒pKD 46。pKD 46在30℃培養(yǎng)時能夠正常地復制，當溫度高于37 ℃時質粒自動丟失，它含有溫敏型的復制起點oriR101和受ParaB啟動子調控的exo、bet、gam基因[13]，這三個基因攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標記，在L-阿拉伯糖的誘導下表達。pKD 4在Red同源重組系統(tǒng)中作為抗性標記使用，它含有卡那霉素抗性基因，以及在抗性基因的兩側有FRT位點。pCP 20同時含有氨芐青霉素和氯霉素抗性，且含有溫敏型的復制起點。pCP 20上還含有一個能產生與FRT位點結合的翻轉酶重組酶(Flipase Recombination Enzyme，F(xiàn)LP)的基因，從而使FRT位點發(fā)生自身同源重組，消除一個FRT位點和抗性基因。FLP重組酶可以在42 ℃時誘導表達，同時質粒逐漸丟失[12,14]。

HPI是耶爾森菌的一個基因組，含有11個基因的功能核心區(qū)，攜帶的基因與鐵載體—耶爾森桿菌素的合成、調節(jié)和轉運有關。其中，irp2基因為HPI的標志基因，與攝鐵功能相關，該基因表達的HMWP2蛋白對Ybt的合成具有重要作用，被認為是Ybt陽性表型表達所必需。預測結果表明，HMWP2蛋白在pH為5.85時溶解度最小，易于析出。其中α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲所占的百分比分別為43.5%、10.76%和46.19%，HMWP2蛋白為疏水性跨膜蛋白。這些性質可能與該蛋白的攝鐵轉運相關。irp2作為鐵調節(jié)基因，僅在致病性耶爾森菌中表達，編碼的分子量為228 KD的HMWP2蛋白可參與Ybt的合成，誘導鼠疫菌素受體和Ybt表達，與耶爾森菌的鐵攝取能力有關。試驗利用Red同源重組的方法對irp2基因進行了敲除，并通過測序，對irp2基因表達的HMWP2蛋白進行了結構及功能預測，不僅為研究irp2基因在PEC致病機制中的作用及Red重組系統(tǒng)研究HPI的其他基因奠定了基礎，也為制備腸道感染病疫苗和粘膜免疫佐劑等提供了更多的理論依據(jù)。

[1] Russell C B,Thaler D S,Dahlquist F W. Chromosomal transformation of Escherichia coli recD strains with linearized plasmids[J]. Journal of Bacteriology,1989,171(5): 2609-2613.

[2] Hamilton C M,Aldea M,Washburn B K,etal. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli[J]. Journal of Bacteriology,1989,171(9): 4617-4622.

[3] Link A J,Phillips D,Church G M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: Application to open reading frame characterization[J]. Journal of Bacteriology,1997,179(20): 6228-6237.

[4] Rakin A, Schubert, Guilvout I,etal. Local hopping of IS3 elements into the A+T-rich part of the high-pathogenicity island in Yersinia enterocolitica 1B, O:8[J]. Fems Microbiol Lett,2000,182(2): 225-229.

[5] 呂沈聰，趙穎穎，鐘衛(wèi)鴻. RED同源重組在大腸桿菌基因敲除中的應用[J]. 化學與生物工程，2013，30(6):1-6.

Lv S C, Zhao Y Y, Zhong W H. Application of RED homologous recombination in gene knockout ofE.coli[J]. Chemistry & Bioengineering, 2013, 30(6): 1-6.

[6] 孫 旭，周長林，方宏清. Red同源重組在大腸桿菌基因組修飾中的應用[J]. 生物技術通訊，2011，(6)：873-878.

Sun X, Zhou C L, Fang H Q. Application of RED mediated recombination inE.coligenome modification[J]. Letters in Biotechnology, 2011, (6): 873-878.

[7] Murphy K C. Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli[J]. J Bacteriol,1998,180(8): 2063-2071.

[8] Muyrers J P,Zhang Y,Stewart A F. Techniques:Recombinogenic engineering-new options for cloning and manipulating DNA[J]. Trends Biochem Sci,2001,26(5): 325-331.

[9] Kovall R,Matthews B W. Toroidal structure of lambda-exonuclease [J]. Science,1997,277 (5333): 1824～1827.

[10] Smith C E,Bell C E. Domain Structure of the Redβ Single-Strand Annealing Protein: the C-terminal Domain is Required for Fine-Tuning DNA-binding Properties, Interaction with the Exonuclease Partner, and Recombination in vivo[J]. J Mol Biol,2016,428(3): 561-578.

[11] Yu D, Ellis HM, Lee E,etal. An efficitent recombination system for chomosome enjineerinig inEscherichiacoli[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11): 5978.

[12] Datsenko K A,Wanner B L. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12): 6640-6645.

[13] 張穗生，郭 媛，韋廷宗，等. Red重組系統(tǒng)介導下大腸桿菌改造體系的優(yōu)化[J]. 廣西科學，2010，17(2)：160-163.

Zhang H S, Guo Y, Wei Y Z,etal. Optimizing the conditions for Redmediated recombinogenic engineering ofE.coli[J]. Guangxi Sciences, 2010, 17(2): 160-163.

[14] Yuan L Z, Rouviere P E, Larossa R A,etal. Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production inE.coli[J]. Metab Eng,2006,8(1): 79-90.