半滑舌鰨源美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種的分離鑒定

楊 楠，張志強(qiáng)，吳同壘，王洪彬，史秋梅，高桂生(河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066604)

美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)又稱(chēng)?；【?，是海洋革蘭氏陰性球桿菌，包括美人魚(yú)亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.Damsela；PDD)和殺魚(yú)亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.Piscicida;PDP)兩個(gè)亞種，在美國(guó)、日本、歐洲和我國(guó)的海水養(yǎng)殖中為常見(jiàn)的病原菌[1-2]。該菌是嗜鹽病原菌中的重要成員，是一種機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于海水及寄生于海產(chǎn)動(dòng)物中，沒(méi)有明顯的宿主特異性，能夠感染多種海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，造成大批死亡；比如雀鯛科魚(yú)[3]、卵形鯧鲹[4]、斑節(jié)對(duì)蝦[5]、鯡魚(yú)[6]等；也有報(bào)道稱(chēng)，該菌還能感染甲殼類(lèi)、軟體動(dòng)物、爬行動(dòng)物[7]。在海洋哺乳動(dòng)物中，1988年首次報(bào)道美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種從發(fā)病寬吻海豚體內(nèi)分離[6]?；疾◆~(yú)臨床表現(xiàn)為敗血癥，體表潰瘍，腮部、鰭部出血，斷尾；該菌發(fā)病迅速，死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)的造成重大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)人而言，PDD是一種人魚(yú)共患病病原菌，機(jī)會(huì)性感染暴露于鹽水或半咸水域和海洋活動(dòng)過(guò)程中造成的傷口，可能會(huì)演變?yōu)閴乃佬越钅ぱ咨踔林旅黐8]。

2016年5月，秦皇島市昌黎縣某海水養(yǎng)殖基地，大批舌鰨突然死亡，死亡率高達(dá)25%。病魚(yú)食欲不振，不喜活動(dòng)，脫離魚(yú)群，體表潰瘍，腮鰭部出血，有的甚至斷尾；剖檢可見(jiàn)腸道充血，腹水嚴(yán)重，肝臟腫脹充血，腎臟微黃。研究從病魚(yú)體內(nèi)分離出優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行PCR鑒定、生化特性鑒定，最終確定分離菌是美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種。

1 材 料

1.1 病料樣品 河北秦皇島市昌黎縣某海水養(yǎng)殖基地病死舌鰨魚(yú)，體重在420～780 g之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；血瓊脂平板(兔血)購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；藥敏片，購(gòu)自杭州微生物試劑公司；2×Es Taq MasterMix，購(gòu)自康為世紀(jì)公司； 16S rDNA所用引物，均由北京生工生物工程有限公司合成；克隆菌株DH5α為實(shí)驗(yàn)室保存；ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)，由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)；ID32E鑒定試劑條購(gòu)自北京威泰科生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用舌鰨魚(yú)購(gòu)自某水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，體重約200 g/尾；清潔級(jí)BALB/c小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前均在實(shí)驗(yàn)室自由采食1周，以適應(yīng)環(huán)境。

2 方 法

2.1 細(xì)菌分離與鑒定

2.1.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 無(wú)菌采集心血接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，30 ℃培養(yǎng)12 h，平板上長(zhǎng)出均一菌落，挑取單菌落于血液瓊脂上進(jìn)行菌落形態(tài)和溶血性觀察；對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌染色特性及形態(tài)；選取優(yōu)勢(shì)菌落接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，劃線于兩個(gè)兔血瓊脂平板上，分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察分離菌株是否于37 ℃生長(zhǎng)。

2.1.2 分離菌株的16S rDNA 基因序列分析 抽提分離菌株基因組并以其為模板進(jìn)行PCR，引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。50 μL PCR體系：2×Taq PCR Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 22 μL，模板1 μL?；厥漳康幕蚱?，與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；挑單菌落PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒并送測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)拼接后，在NCBI上Blast工作區(qū)上進(jìn)行序列比對(duì)，下載同源性高的菌株序列以及相關(guān)菌種的16SrRNA序列，進(jìn)行同源性分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.1.3 生化鑒定 采用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)：將分離菌株接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，刮取菌落接種生理鹽水，調(diào)整菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋?將菌液加入ID32E生化鑒定試紙條樣品孔中，40 μL/孔，并在厭氧培養(yǎng)的孔中加入一滴礦物油，置于濕盒中，30 ℃培養(yǎng)24 h；次日在吲哚實(shí)驗(yàn)孔加入一滴James染液，將試紙條置于ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行鑒定。

2.2 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)及分離菌LD50檢測(cè)

2.3.1 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將純培養(yǎng)分離菌接種于LB培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)10 h，用生理鹽水洗滌，調(diào)整菌液為1.0×108CFU/mL。選取12只健康舌鰨魚(yú)，隨機(jī)分成3組，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組，每組4尾。實(shí)驗(yàn)組每尾腹腔注射0.2 mL菌液，對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水，連續(xù)觀察4 d，記錄試驗(yàn)舌鰨魚(yú)發(fā)病死亡情況，并對(duì)病死魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2.3.2 分離菌對(duì)舌鰨魚(yú)的LD50檢測(cè) 選取健康舌鰨魚(yú)60尾，隨機(jī)分成6組，5組為實(shí)驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，每組10尾。用滅菌生理鹽水稀釋菌液至1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102CFU/mL五個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度，實(shí)驗(yàn)組每尾腹腔注射0.2 mL菌液，對(duì)照組每尾腹腔注射等體積的生理鹽水。攻毒后72 h觀察患病及死亡情況，用寇氏改良法計(jì)算LD50，并對(duì)病死魚(yú)進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離鑒定。

2.3.3 分離菌對(duì)BALB/c小鼠的LD50檢測(cè) 選取健康BALB/c小鼠60只，分組處理同2.3.2。用滅菌生理鹽水稀釋菌液至1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL五個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.1 mL菌液，對(duì)照組注射等體積生理鹽水；其余操作同2.3.2。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)菌分離與鑒定

3.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢 從半滑舌鰨中分離出一株細(xì)菌，在兔血平板長(zhǎng)出半透明，圓形光滑、中間較隆起、邊緣整齊中等大小菌落，呈現(xiàn)典型的β型溶血(圖1)，為革蘭氏染色陰性的球桿菌(圖2)。

圖1 分離菌血瓊脂培養(yǎng)Fig 1 Blood agar medium

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig 2 Gram staining

3.1.2 分離菌株的16S rDNA基因序列分析 以抽提分離菌株基因組為模板，16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于1500 bp(圖3)出現(xiàn)目的條帶。分離菌株16S rDNA基因序列與GenBank上公布的美人魚(yú)發(fā)光桿菌參考株高度同源，證實(shí)其確為美人魚(yú)發(fā)光桿菌。利用Lasergene軟件上的MegAlin分區(qū)對(duì)分離菌與美人魚(yú)發(fā)光桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33539、CECT5064 等參考菌株進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示(圖4、圖5)，分離菌株與美人魚(yú)發(fā)光桿菌處于同一分支，進(jìn)一步說(shuō)明分離菌株為美人魚(yú)發(fā)光桿菌。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：從心血中分離菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2000 Marke；1:PCR products of positive strains from the heart blood圖3 分離菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 3 PCR result of 16S r DNA gene from Isolated bacteria

圖4 分離菌株16S rDNA同源性比較Fig 4 Homology comparison of nucleotide sequences of 16 S rDNA gene

圖5 分離菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 5 Phylogenetic analysis based on sequences 16 S rDNA gene

3.1.3 分離菌生化鑒定結(jié)果 對(duì)分離菌株進(jìn)行生化特性鑒定證實(shí)其為美人魚(yú)發(fā)光桿菌，進(jìn)一步檢測(cè)分離菌株七葉苷發(fā)酵陽(yáng)性，37℃生長(zhǎng)良好，證實(shí)其為美人魚(yú)亞種。

表1 分離菌株主要生化指標(biāo)Tab 1 Main phenotypic traits of the isolate

“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性。

"+"positive;"-"negative.

3.2 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)共計(jì)使用21種藥物，結(jié)果顯示，分離菌對(duì)恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、乙酰甲喹敏感；對(duì)頭孢拉定、多西環(huán)素中敏；對(duì)大觀霉素、慶大霉素、林可霉素、二甲氧嘧啶、新諾明、替米考星、間甲氧嘧啶、青霉素、鏈霉素、土霉素、氨芐青霉素、新霉素、頭孢曲松、卡那霉素、阿米卡星不敏感。

3.3 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn)及LD50檢測(cè)

3.3.1 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組舌鰨魚(yú)在接種分離菌12 h后出現(xiàn)死亡，36 h全部死亡；對(duì)照組無(wú)死亡。實(shí)驗(yàn)組舌鰨魚(yú)腮部有出血癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫脹，腸粘膜出血，這與最初分離菌的癥狀相符。從死亡舌鰨魚(yú)內(nèi)臟分離細(xì)菌培養(yǎng)，按照上述方法鏡檢、PCR試驗(yàn)、生化鑒定，確定該病菌與養(yǎng)殖場(chǎng)病死舌鰨魚(yú)體內(nèi)分離的細(xì)菌一致，均為美人魚(yú)發(fā)光桿菌。

3.3.2 分離菌對(duì)舌鰨魚(yú)的LD50檢測(cè) 5個(gè)試驗(yàn)梯度中，第1組舌鰨魚(yú)在攻毒16 h后出現(xiàn)死亡，第1、2組舌鰨魚(yú)48 h內(nèi)全部死亡，連續(xù)觀察一周，第5組和對(duì)照組無(wú)死亡。根據(jù)表2數(shù)據(jù)，利用寇氏改良法計(jì)算出PDD對(duì)舌鰨魚(yú)的LD50=3.1×104CFU/mL。

3.3.3 分離菌對(duì)BALB/c小鼠的LD50檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)1組小鼠在接種病菌5 h后出現(xiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)1、2組小鼠在16 h內(nèi)全部死亡；對(duì)照組沒(méi)有死亡，連續(xù)觀察一周。根據(jù)表3數(shù)據(jù)，利用寇氏改良法計(jì)算出PDD對(duì)BALB/c小鼠的LD50=5.0×105CFU/mL。

表2 分離菌半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Median lethal dose of isolated bacteria

表3 分離菌半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果Tab 3 Median lethal dose of isolated bacteria

4 討論與小結(jié)

美人魚(yú)發(fā)光桿菌包含美人魚(yú)殺魚(yú)亞種和美人魚(yú)亞種兩個(gè)亞種，其中美人魚(yú)亞種以前被稱(chēng)為美人魚(yú)弧菌，具有某些弧菌特性，研究發(fā)現(xiàn)美人魚(yú)亞種細(xì)菌條件致病，感染宿主范圍廣泛，能夠感染多種魚(yú)類(lèi)，亦可感染包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。PDD感染魚(yú)類(lèi)主要引起細(xì)菌性敗血癥，死亡率較高。研究PDD分離自秦皇島某養(yǎng)殖基地病死舌鰨內(nèi)臟，病魚(yú)外觀表現(xiàn)與病理變化與PDD感染相似。

美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種最早從患有皮膚潰爛病的雀鯛魚(yú)[3]中發(fā)現(xiàn)，此后陸續(xù)從大菱鲆、海鯉、石斑魚(yú)、鯊魚(yú)以中分離得到[9]，但從半滑舌鰨魚(yú)種分離該菌尚屬首次。PDD感染致病的資料較少，對(duì)于其致病的報(bào)道多集中于國(guó)外，但其造成危害較大，尤其近年來(lái)該菌所致感染在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室已多次從冀東沿海地區(qū)分離出該菌，應(yīng)重視其潛在威脅。除此之外，對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種進(jìn)行研究的意義在于其具有的公共衛(wèi)生學(xué)價(jià)值，PDD能夠感染人已被證實(shí)，食源性途徑和傷口是人類(lèi)感染的主要方式[10]。研究中所分離的菌株能夠在37 ℃生長(zhǎng)良好，同時(shí)對(duì)舌鰨魚(yú)和小鼠均具有較強(qiáng)的致病性(半數(shù)致死量分別為3.1×104CFU/mL和5.0×105CFU/mL)，揭示了其對(duì)人類(lèi)健康的潛在威脅。

目前，對(duì)于水產(chǎn)細(xì)菌病原的防治多以抗生素和化學(xué)藥物為主，其能夠?qū)?xì)菌性病原有一定的治療效果，但其所造成的抗生素殘留、水體污染以及誘導(dǎo)細(xì)菌多重耐藥情況不容忽視。對(duì)江蘇沿海地區(qū)水體細(xì)菌進(jìn)行耐藥情況調(diào)查結(jié)果表明，江蘇省沿海地區(qū)分離的部分水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌出現(xiàn)多重耐藥，二重、三重、四重、五重耐藥率分別為 22.3%、13.5%、10.9%、6.6%，某些菌株甚至達(dá)到十一重耐藥[11]；上海地區(qū)分離菌株多重耐藥率為100%，海南地區(qū)分離菌株多重耐藥率為77.5%[12]。由此可見(jiàn)，海水弧菌的多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，各地區(qū)病原菌所耐藥物并不一致，存在地區(qū)差異。在水產(chǎn)上耐藥嚴(yán)重的病原菌有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌[13]、愛(ài)德華氏菌等[14]，其多重耐藥的情況已引起人們重視。若抗生素繼續(xù)不科學(xué)、不合理使用，可能會(huì)使耐藥菌演變?yōu)槌?jí)細(xì)菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅。通過(guò)長(zhǎng)期對(duì)冀東地區(qū)水產(chǎn)病原進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所分離的部分菌株亦呈現(xiàn)明顯的多重耐藥情況。對(duì)研究分離的美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)多種抗生素不敏感，反映出本地水產(chǎn)細(xì)菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，可進(jìn)一步檢測(cè)分離菌株的耐藥基因，為該病的防控提供參考。

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