嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的分離鑒定及單質(zhì)硫氧化特性

李靜泉， 姜 燕， 許繼飛， 趙 吉

(內(nèi)蒙古大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

煤炭燃燒過程中釋放的二氧化硫是造成大氣污染的主要原因之一，對生態(tài)環(huán)境和人體健康危害嚴(yán)重。煤炭微生物脫硫因其效率高、成本低、二次污染小等特點[1-2]越來越受到研究者的關(guān)注。嗜酸氧化硫硫桿菌為化能自養(yǎng)型細(xì)菌，廣泛存在于酸性礦山廢水和礦區(qū)土壤等環(huán)境中，是脫硫微生物的主要代表之一，不僅能應(yīng)用于硫的氧化脫除，還能應(yīng)用于污泥淋濾去除重金屬、生物處理降低鹽堿地pH值、尾礦冶金等領(lǐng)域[3-6]。高效脫硫菌株是微生物脫硫應(yīng)用于環(huán)保領(lǐng)域的關(guān)鍵。因此，分離和篩選高效脫硫菌株是一項基礎(chǔ)且非常重要的研究工作。

胡瑜等從高硫煤矸石山酸性廢水中分離得到的嗜酸氧化硫硫桿菌CMTT-32對單質(zhì)硫的氧化率在第11天時達(dá)到 65.6%，日產(chǎn)硫酸的量最高達(dá)3 g/L[7]。楊期勇等分離篩選得到1株嗜酸氧化硫硫桿菌JJU-1，其培養(yǎng)基的pH值在第6天時約下降至1.0，在第9天時約下降至0.7，且研究發(fā)現(xiàn)硫粉投加量對菌株JJU-1的氧化產(chǎn)酸量有影響[8]。呂早生等從礦山土樣中分離得到1株嗜酸氧化硫硫桿菌HY-01，在培養(yǎng)180 h后其培養(yǎng)基的pH值約下降至1.0，對應(yīng)的D600 nm略大于1.0，但菌株HY-01不能利用Na2S2O3[9]。嗜酸氧化硫硫桿菌QH-1在1周內(nèi)可將培養(yǎng)基的pH值降到1.0以下，生長穩(wěn)定期時培養(yǎng)基的pH值為0.6，同時試驗發(fā)現(xiàn)菌株 QH-1 對Zn2+、Cu2+有一定的耐受性，而對Mo2+的耐受性較差[10]。嗜酸氧化硫硫桿菌TS6在培養(yǎng)基初始pH值為2～6的條件下能夠在3～4 d內(nèi)將pH值約降至1.0，而當(dāng)初始pH值為8時則難使pH值明顯下降，且菌株TS6對Cr3+、Cu2+、Zn2+、Ni2+具有耐受性[11]。

本試驗從高硫煤礦儲煤區(qū)的土壤中分離篩選出1株高效脫硫菌，并研究該菌株的單質(zhì)硫氧化曲線，及培養(yǎng)基中單質(zhì)硫初始量和金屬離子對單質(zhì)硫氧化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品采集 土壤樣品，采自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏海市烏達(dá)煤礦儲煤區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 Waksman培養(yǎng)基：0.200 g(NH4)2SO4，3.000 g K2HPO4·3H2O，0.500 g MgSO4·7H2O，0.126 g CaCl2·2H2O，10.000 g S0，1 000 mL蒸餾水，按試驗需要用HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。S0先經(jīng)紫外照射滅菌再與高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基的其余部分進(jìn)行混合。用于菌株的液體培養(yǎng)。

Starky-Na2S2O3-瓊脂培養(yǎng)基：2.000 g(NH4)2SO4，0.500 g MgSO4·7H2O，0.250 g CaCl2·2H2O，3.000 g KH2PO4，0.001 g FeSO4·7H2O，10.000 g 400 g/L Na2S2O3，20.000 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。濃度為400 g/L的Na2S2O3母液先經(jīng)過濾除菌再與高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基其余部分在50～60 ℃進(jìn)行混合。用于菌株的平板固體培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株富集培養(yǎng)與分離 取5 g土壤樣品加入盛有 100 mL Waksman培養(yǎng)基(pH值為2.0)的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)過程中如有化能自養(yǎng)菌的生長則培養(yǎng)基將變?yōu)闇啙岬娜榘咨?。? mL培養(yǎng)液加入1瓶新的盛有100 mL Waksman培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d，連續(xù)富集培養(yǎng)6代。將最后1次的富集液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-3、10-4、10-5稀釋液各100 μL加到Starky-Na2S2O3-瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取形態(tài)不同的菌落于裝有20 mL Waksman培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，在 30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，驗證單質(zhì)硫氧化功能。同時通過固體平板劃線法進(jìn)行驗證，直到分離得到純的具有脫硫功能的菌株。

1.2.2 菌株鑒定 在Starky-Na2S2O3-瓊脂培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下對菌株個體進(jìn)行觀察。菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增所用引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，29次循環(huán)；72 ℃ 10 min。基因測序結(jié)果通過Blast、MEGA 4.1進(jìn)行分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 嗜酸氧化硫硫桿菌的單質(zhì)硫氧化特性研究

1.2.3.1 種子液的準(zhǔn)備 將菌液按3%(體積比)的接種量接入盛有初始pH值為2.0的Waksman培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)8 d，靜置沉淀3 min以去除培養(yǎng)液中的單質(zhì)硫，吸取上層菌液作為種子液。

1.2.3.2 嗜酸氧化硫硫桿菌的單質(zhì)硫氧化曲線 Waksman培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為2.3，按3%(體積比)的接種量向盛有20 mL Waksman培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中接種種子液，種子液的D600 nm為0.22。在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)，每2 d測定1次培養(yǎng)液的SO42-濃度、pH值、D600 nm。每組試驗設(shè)3個重復(fù)。

在混凝土灌注之前，要保證混凝土隔水栓與初灌料斗以及相關(guān)工作人員到位。安排專業(yè)工作人員檢測并評估坍落指數(shù)，以保證能夠與施工標(biāo)準(zhǔn)要求相適應(yīng)。

1.2.3.3 單質(zhì)硫不同初始量對嗜酸氧化硫硫桿菌單質(zhì)硫氧化效率的影響 將Waksman培養(yǎng)基中單質(zhì)硫的初始量分別設(shè)為0.1%、2%、3%(質(zhì)量體積比)，培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)為2.0。按3%(體積比)的接種量向盛有20 mL Waksman培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中接種種子液，種子液的D600 nm為0.22。在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)，每2 d測定1次培養(yǎng)液的SO42-濃度、pH值。每組試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.4 不同金屬離子對嗜酸氧化硫硫桿菌單質(zhì)硫氧化效率的影響 選用的金屬離子分別為Fe3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、K+，向初始pH值為2.0的Waksman培養(yǎng)基中加入各金屬離子，使培養(yǎng)基中該金屬離子的濃度均增加1 mmol/L，同時設(shè)置在Waksman培養(yǎng)基中不添加金屬離子作為對照。

接種量均為3%(體積比)，種子液的D600 nm為0.27，培養(yǎng)條件為 30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)第7天時取樣測定SO42-濃度、pH值。每組試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.5 單質(zhì)硫氧化率的計算 根據(jù)各取樣點的樣品與培養(yǎng)基中初始SO42-濃度之差和培養(yǎng)基中初始加入單質(zhì)硫的量來計算單質(zhì)硫氧化率。

式中：r為單質(zhì)硫氧化率；C2為各取樣點樣品中SO42-濃度的平均值，mg/L；C1為培養(yǎng)基中初始SO42-濃度的平均值，mg/L；m為20 mL培養(yǎng)基中單質(zhì)硫的初始量，mg。

1.2.4 取樣方法和檢測儀器

在取樣測定SO42-濃度、pH值時，將菌液在5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，隨后抽濾，使溶液澄清，用pH計測定pH值，用離子色譜儀測定SO42-濃度。

1.2.4.2 檢測儀器 離子色譜儀(881 Compact IC pro-Anion)，購自瑞士萬通中國有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1810)，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pH計(ST2100)，購自奧豪斯儀器(常州)有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫硫菌株的分離、鑒定

從土壤樣品中分離篩選出1株高效脫硫菌株，革蘭氏染色呈陰性，桿狀菌，菌落透明，在Starky-Na2S2O3-瓊脂培養(yǎng)基上形成云霧狀氧化圈，能夠在初始pH值為2.0的Waksman培養(yǎng)基中生長且最終pH值低于1.0。由圖1可知，菌株DS1的16S rRNA基因序列與模式菌株AcidithiobacillusthiooxidansDSM 14887、A.albertensisDSM 14366的16S rRNA基因序列相似性最高，均為99%。因此，將菌株DS1命名為嗜酸氧化硫硫桿菌DS1(A.thiooxidansDS1)[12]。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的16S rRNA基因序列GenBank登錄號為KX618878。

2.2 嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的單質(zhì)硫氧化曲線

由圖2可知，在單質(zhì)硫初始量為1%的Waksman培養(yǎng)基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d時，培養(yǎng)基中SO42-的平均濃度分別為448.4、3 656.9、13 326.7、14 820.8、15 327.1、20 237.8、21 926.4、22 125.1 mg/L，培養(yǎng)基的pH值平均值分別為 2.22、1.58、1.06、0.84、0.83、0.72、0.71、0.64，培養(yǎng)基的D600 nm平均值分別為0.008、0.022、0.135、0.136、0.189、0.194、0.147、0.120。而未接菌的培養(yǎng)基中SO42-濃度和pH值基本保持不變。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質(zhì)硫氧化率分別為10.70%、42.93%、47.91%、49.60%、65.96%、71.59%、72.26%。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在12 d時單質(zhì)硫氧化率達(dá)到 71.59%，SO42-濃度為21 926.4 mg/L；之后增長緩慢，14 d時單質(zhì)硫氧化率為72.26%，SO42-濃度為 22 125.1 mg/L。培養(yǎng)基的pH值由0 d時的2.22在14 d時降到 0.64。在硫氧化過程中，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的生長量在8、10 d時較高，其D600 nm分別為0.189、0.194?？梢娛人嵫趸蛄驐U菌DS1的單個個體對單質(zhì)硫具有高效的氧化能力。

2.3 單質(zhì)硫不同初始量對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質(zhì)硫效率的影響

由圖3-a可知，在單質(zhì)硫初始量為0.1%的Waksman培養(yǎng)基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d時，培養(yǎng)基中SO42-濃度的平均值分別為998.1、1 089.5、1 300.0、1 558.9、2 235.9、2 769.7、3 483.0、3 739.9 mg/L，培養(yǎng)基的pH值平均值分別為1.67、1.57、1.49、1.27、1.25、1.15、1.00、0.96。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質(zhì)硫氧化率分別為3.05%、10.06%、18.69%、41.26%、59.05%、82.83%、91.39%。

由圖3-b可知，在單質(zhì)硫初始量為2%的Waksman培養(yǎng)基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d 時，培養(yǎng)基中SO42-濃度的平均值分別為576.5、3 804.1、13 051.8、15 584.5、32 475.5、43 855.4、46 046.7、46 016.4 mg/L，培養(yǎng)基的pH值平均值分別為 1.71、1.02、0.57、0.54、0.30、0.21、0.15、0.15。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質(zhì)硫氧化率分別為5.38%、20.79%、25.01%、53.17%、72.13%、75.78%、75.73%。

由圖3-c可知，在單質(zhì)硫初始量為3%的Waksman培養(yǎng)基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d 時，培養(yǎng)基中SO42-濃度的平均值分別為762.4、3 148.1、11 701.3、25 446.7、30 593.1、41 523.6、49 677.2、52 815.4 mg/L，培養(yǎng)基的pH值平均值分別為 1.68、1.00、0.55、0.39、0.31、0.16、0.09、0.06。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質(zhì)硫氧化率分別為2.65%、12.15%、27.43%、33.15%、45.29%、54.35%、57.84%。

綜合來看，14 d時嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在單質(zhì)硫初始量為0.1%條件下的單質(zhì)硫氧化率為91.39%，在單質(zhì)硫初始量為2%條件下的單質(zhì)硫氧化率為75.73%，在單質(zhì)硫初始量為3%條件下的單質(zhì)硫氧化率為57.84%，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對單質(zhì)硫的氧化率隨著單質(zhì)硫初始量的增加而降低。可見，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對低含量單質(zhì)硫(單質(zhì)硫初始量為0.1%)具有較高的單質(zhì)硫氧化率，而對高含量單質(zhì)硫(單質(zhì)硫初始量為3%)也有不錯的氧化效果，14 d時單質(zhì)硫氧化率接近60%。同時，培養(yǎng)液的pH值在單質(zhì)硫初始量為2%的條件下在14 d時下降至0.15，在單質(zhì)硫初始量為3%的條件下在14 d時下降至0.06，說明嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

2.4 添加不同金屬離子對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質(zhì)硫效率的影響

由圖4可知，分別向Waksman培養(yǎng)基中添加不同種類金屬離子，培養(yǎng)7 d時測得添加Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+培養(yǎng)基中SO42-濃度的平均值分別為 18 272.7、2 150.8、18 470.7、17 406.8、17 307.8、15 817.9、15 061.0、15 273.2、15 602.9 mg/L，而未在培養(yǎng)基中添加金屬離子的對照組試驗中SO42-濃度為13 987.3 mg/L。由圖5可知，添加Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+培養(yǎng)基中pH值平均值分別為0.42、1.17、0.39、0.42、0.43、0.44、0.44、0.46、0.44，而未向培養(yǎng)基中添加金屬離子的對照組試驗中培養(yǎng)基的pH值平均值為0.47。試驗結(jié)果顯示，除Co2+對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質(zhì)硫具有明顯的抑制作用外，F(xiàn)e3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+均對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質(zhì)硫有促進(jìn)作用，其中，Cu2+、Fe3+的促進(jìn)作用較強(qiáng)，Ni2+、Zn2+的促進(jìn)作用次之，K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+的促進(jìn)作用相對較弱。可見嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對金屬離子具有較強(qiáng)的耐受能力。

3 討論與結(jié)論

嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有高效的脫硫能力，單質(zhì)硫初始量為0.1%，在14 d時其單質(zhì)硫氧化率可達(dá)91.39%，對低含量單質(zhì)硫氧化徹底；單質(zhì)硫初始量為1%、2%，在14 d時其單質(zhì)硫氧化率均高于70%，可見嗜酸氧化硫硫桿菌DS1能夠在單質(zhì)硫含量較廣的范圍內(nèi)保持高效的氧化能力，并且在 14 d 時培養(yǎng)基中SO42-濃度分別高于22 000、46 000 mg/L；單質(zhì)硫初始量為3%時其單質(zhì)硫氧化率約為60%，培養(yǎng)基中SO42-濃度最終約為53 000 mg/L。培養(yǎng)液pH值的降低體現(xiàn)了脫硫微生物的產(chǎn)酸能力，同時也體現(xiàn)了菌株的脫硫能力。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，在單質(zhì)硫初始量為2%、3%的條件下其培養(yǎng)液pH值在14 d時分別下降至0.15、0.06。在已報道的脫硫微生物中，嗜酸氧化硫硫桿菌CMTT-32在11 d時對單質(zhì)硫的氧化率達(dá)65.6%，pH值降到0.8左右，20 d時培養(yǎng)液中SO42-濃度達(dá)到22 760 mg/L[7]；嗜酸氧化硫硫桿菌JJU-1隨著培養(yǎng)基中單質(zhì)硫初始量的增加，其培養(yǎng)液的pH值下降速度變快，產(chǎn)酸效果較好，與菌株DS1的情況一致，但培養(yǎng)8 d后其培養(yǎng)液的pH值降到0.7左右[8]；嗜酸氧化硫硫桿菌Tt-1在單質(zhì)硫氧化過程中培養(yǎng)8 d后其培養(yǎng)液的pH值降到1.0左右[13]；嗜酸氧化亞鐵硫桿菌T1在氧化單質(zhì)硫為硫酸根過程中，培養(yǎng)144 h后其培養(yǎng)基的pH值由初始的 2.42 最終降為1.66[14]；與之相比，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有更強(qiáng)的單質(zhì)硫氧化和產(chǎn)酸能力。此外，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對金屬離子的耐受性試驗結(jié)果表明，其對Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+等多種金屬離子具有耐受能力，在生物冶金、污泥淋濾去除重金屬等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

嗜酸氧化硫硫桿菌氧化單質(zhì)硫生成硫酸根的過程為先由單質(zhì)硫氧化生成亞硫酸根，再由亞硫酸根進(jìn)一步氧化生成硫酸根，同嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化單質(zhì)硫的過程相同[15]。而亞硫酸根離子作為單質(zhì)硫氧化的中間代謝產(chǎn)物能夠強(qiáng)烈抑制離子氧化酶的活性，不同的脫硫菌對亞硫酸根的敏感程度不同從而會影響其脫硫效率[16]。而且嗜酸氧化硫硫桿菌的不同菌株的基因組之間可能存在特異性以適應(yīng)其生存的環(huán)境[17]。因此，對于具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的嗜酸氧化硫硫桿菌DS1，其基因組信息值得被挖掘。另外，雖然菌株DS1的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，但在Waksman培養(yǎng)基中的生長量偏低，須改善其生長條件提高其生長量。嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌均在生物脫硫、生物冶金、生物浸磷、污泥淋濾去除重金屬等方面具有應(yīng)用價值[18-22]，因此，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1與嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的混合使用具有研究價值。

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