抗枇杷根腐病病菌的枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株生物學(xué)特性

魯海菊， 張曉永， 江 濤， 胡金碧， 田學(xué)軍

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199)

隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，大規(guī)模連片種植單一作物導(dǎo)致土壤連作障礙日漸突顯，土傳病害是導(dǎo)致土壤連作障礙的重要因素之一，而引入拮抗菌是生物防治連作障礙的措施之一[1]。木霉(Trichoderma)是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，曾成功防治辣椒白絹病和猝倒病[2]、黃瓜枯萎病[3]、辣椒疫病[4]等多種土傳病害。雖然野生型木霉菌株對(duì)植物病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，但在田間其防效會(huì)大幅度下降，其主要原因是木霉在根際土壤中定殖受到各種環(huán)境因素的影響，很難成功定殖。有學(xué)者曾用紫外線誘變方法獲得強(qiáng)根際能力的木霉菌株[5]。眾多學(xué)者研究表明，在植物體內(nèi)存在內(nèi)生木霉，在可可[6]、茶樹[7]、蘆竹[8]、南方紅豆杉[9]等植物中成功分離到內(nèi)生木霉。其中，在蘆竹和南方紅豆杉中分離的木霉分別對(duì)煙草赤星病和水稻紋枯病有很好的防治效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，從其他地方分離的木霉菌株也能在可可莖上定殖，與其形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌[10]。說(shuō)明不管是本地的內(nèi)生木霉還是從外界引入的木霉，均能與宿主形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌，對(duì)宿主有促生、抗病等作用[11]。內(nèi)生木霉受到寄主植物的良好保護(hù)，并能獲得足夠的碳、氮源供其自身生長(zhǎng)。因此，內(nèi)生木霉比其他腐生的木霉更易于發(fā)揮生防作用。筆者從枇杷主干韌皮部中分離到1株內(nèi)生木霉P3.9菌株，它對(duì)枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)[12]、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)[12]、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumsp.)[12]、萬(wàn)壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)[12]、石榴干腐病病菌[13]等均具有強(qiáng)烈的抑制作用，能成功定殖于枇杷主干及黃瓜根、莖、葉中，并具有固氮、抗化學(xué)農(nóng)藥、降解難溶性磷酸鹽、降解纖維素等多種功能[14]?？梢?，內(nèi)生木霉P3.9菌株具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。因此，對(duì)枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，可為進(jìn)一步開發(fā)其應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 筆者從枇杷主干韌皮部組織分離內(nèi)生真菌，經(jīng)枇杷根腐病菌對(duì)峙培養(yǎng)篩選，獲得抗枇杷根腐病病菌的木霉P3.9菌株(Trichodermasp.)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱PDA；配方為200 g馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(potato saccharose agar，簡(jiǎn)稱PSA；配方為200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、玉米瓊脂培養(yǎng)基(maize agar，簡(jiǎn)稱MA；配方為30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、小麥瓊脂培養(yǎng)基(wheat agar，簡(jiǎn)稱WA；配方為30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、枇杷瓊脂培養(yǎng)基(loquat agar，簡(jiǎn)稱LA；配方為200 g枇杷葉、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(carrot agar，簡(jiǎn)稱CA；配方為200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、查貝氏(Czapek’s)培養(yǎng)基(配方為2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g 蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 碳源(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)、氮源(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)。上述材料均購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 將內(nèi)生木霉P3.9菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為 5 mm 的菌絲塊，同時(shí)接種于PDA、PSA、MA、WA、CA、LA等6種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，5 d 后采用十字交叉法[15]測(cè)定其菌落直徑。

1.2.2 碳、氮源對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以查貝氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)和氮(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)替換蔗糖和硝酸鈉，菌株接種以及菌落直徑測(cè)量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.3 溫度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，菌株接種及菌落直徑測(cè)量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.4 pH值對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10，菌株接種以及菌落直徑測(cè)量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.5 光照對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光—暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)，菌株接種以及菌落直徑測(cè)量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.6 不同濕度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在50%、60%、70%、80%、90%、100%濕度條件下，28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)5 d，菌株接種以及菌落直徑測(cè)量同“1.2.1”節(jié)中的方法。

1.2.7 不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)內(nèi)生木霉P3.9孢子萌發(fā)的影響 用2%葡萄糖、2%蔗糖、2%蛋白胨、2%葡萄糖+1%蛋白胨、2%蔗糖+1%蛋白胨配制1×106個(gè)/mL P3.9菌株木霉孢子液，取0.2 mL涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng) 18 h 后觀察。

1.2.8 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度 用無(wú)菌水配制1×106個(gè)/mL木霉P3.9菌株孢子液，放入離心管中，在溫度為40、45、50、52、55 ℃條件下水浴10 min，在28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)18 h后觀察孢子的萌發(fā)情況。以上所有配制好的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性。內(nèi)生木霉P3.9菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落直徑與在其他培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落直徑相比差異極顯著，菌落直徑最大，說(shuō)明PDA培養(yǎng)基最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著，下表同。

2.2 不同碳源對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同碳源培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的碳源適應(yīng)性。相比較而言，蔗糖中的菌絲生長(zhǎng)菌落直徑與其他碳源差異極顯著，菌落直徑最小(除無(wú)碳源對(duì)照外)，說(shuō)明蔗糖不適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)，而其他6種供試碳源均適合其菌絲生長(zhǎng)。由圖1可知，D-果糖產(chǎn)孢量最多，因此D-果糖最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢。

表2 不同碳源對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 不同氮源對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株在不同氮源培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的氮源適應(yīng)性。在磷酸二氫銨中生長(zhǎng)的內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑與其他6種供試氮源相比，差異極顯著，菌落直徑最大，說(shuō)明磷酸二氫銨最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)。另外觀察可知，銨態(tài)氮適合內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢(圖2)。

表3 不同氮源對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同溫度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，在溫度為10～35 ℃之間，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長(zhǎng)，在15～30 ℃之間內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑分別與其他溫度處理差異極顯著，菌落直徑較大，說(shuō)明在15～30 ℃范圍內(nèi)最適合內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)。由圖3可知，與溫度為25、30 ℃處理相比，在28 ℃條件下內(nèi)生木霉P3.9菌株產(chǎn)孢量較多，適合產(chǎn)孢。

表4 不同溫度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 不同pH值對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5可知，在pH值為3～10時(shí)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長(zhǎng)，菌落直徑差異不顯著，均達(dá)到90.0 mm，具有較強(qiáng)的pH值適應(yīng)性。由圖4可以看出，pH值為10時(shí)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲直徑最大，產(chǎn)孢量最多。

表5 不同pH值對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.6 光照對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知，在光暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達(dá)到90.0 mm，說(shuō)明光照并不影響菌絲生長(zhǎng)。其中，光暗交替最適合其產(chǎn)孢(圖5)。

表6 光照對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.7 不同濕度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表7可知，在不同濕度下內(nèi)生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達(dá)到90.0 mm，說(shuō)明濕度不影響內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)。

表7 不同濕度對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.8 不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)的影響

由表8可知，與清水對(duì)照相比，不同配比的葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率影響差異極顯著，說(shuō)明內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)受葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液的影響，其中2%蛋白胨溶液極顯著促進(jìn)內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)，2%葡萄糖和2%蔗糖溶液則極顯著抑制孢子萌發(fā)。

表8 不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)的影響

2.9 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

由表9可知，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h，不同溫度水浴處理的內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率差異明顯，在52、55 ℃ 2種處理中，內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的萌發(fā)率為0，兩者間無(wú)顯著差異，因此選擇52 ℃作為內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度(圖6)。

表9 內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

3 結(jié)論與討論

生物學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株最適合的培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、碳源為D-果糖、氮源為磷酸二氫銨、溫度為28 ℃、pH值=10、光暗交替；2%蛋白胨溶液能極顯著提高內(nèi)生木霉P3.9菌株孢子萌發(fā)率，孢子致死溫度為 52 ℃，銨態(tài)氮適合產(chǎn)孢。D-果糖、葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖和D-甘露醇5種碳源之間對(duì)內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲生長(zhǎng)差異不顯著，但D-果糖產(chǎn)孢量最多，因此D-果糖為最適合碳源；在15～30 ℃范圍內(nèi)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均可以獲得正常生長(zhǎng)，但28 ℃適合產(chǎn)孢，因此產(chǎn)孢最佳溫度為 28 ℃；pH值在3～10范圍內(nèi)，內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲均可以正常生長(zhǎng)，但pH值=10適合產(chǎn)孢，因此pH值=10為最佳酸堿度；光照不影響菌絲生長(zhǎng)，但能促進(jìn)產(chǎn)孢，光暗交替產(chǎn)孢量最大，因此光暗交替最適合P3.9木霉菌株生長(zhǎng)。

在楊樹枝干上分離的T88木霉菌株最佳培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、碳源為果糖、溫度為30 ℃，光照有利于產(chǎn)孢[16]，銨是木霉菌最易利用的氮源[17]，與本研究結(jié)論基本一致。分離自菜園土中的綠色木霉HT-01菌株的最佳酸堿度為5[18]，與本研究結(jié)論不一致，導(dǎo)致該差異的原因可能是2個(gè)菌株之間小生境不一致，枇杷屬于堿性果樹，在其中生長(zhǎng)的木霉菌株長(zhǎng)期適應(yīng)堿性環(huán)境，因此偏堿性更適合其生長(zhǎng)。這也是內(nèi)生菌與寄主相互適應(yīng)、協(xié)調(diào)進(jìn)化[19]的又一個(gè)例證。1%葡萄糖溶液促進(jìn)木霉菌Tr 970菌株孢子萌發(fā)，致死溫度為55 ℃(15 min)[20]，與本研究結(jié)論不一致。在15～40 ℃范圍內(nèi)長(zhǎng)枝木霉TICC菌株能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，在35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快[21]，與本研究結(jié)論不一致。說(shuō)明不同木霉菌株生長(zhǎng)溫度范圍變化幅度較大，內(nèi)生木霉P3.9菌株生長(zhǎng)溫度范圍為15～30 ℃，在溫度為10、35 ℃條件下菌絲雖能生長(zhǎng)，但速度很慢，由此推測(cè)內(nèi)生木霉P3.9菌株只適合應(yīng)用在晝夜溫差及季節(jié)溫差不大的南方。

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