核桃青皮活性成分及分離純化的研究進(jìn)展

鄭渝川，王 超，程建偉，王智鵬，楊 凌*

(1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；2.榮縣林業(yè)局，四川 自貢 43100；3.四川師范大學(xué)，四川 成都 610068)

核桃屬于被子植物門雙子葉植物綱胡桃科核桃屬植物，原產(chǎn)于歐洲東南部、北美及東亞地區(qū)，是古老的堅(jiān)果之一[1]。核桃屬共有21個(gè)種，我國(guó)產(chǎn)5種：核桃楸(J.mandshuricaMaxim)、野核桃(J.cathayensisDode)、鐵核桃(J.sigillataDoda)、河北核桃(J.hopeiensisHu)、胡桃(J.regiaL.)和一個(gè)變種[1～2]。青皮是核桃果的外果皮，成熟的核桃青皮呈黑綠色，有不均勻的黑色斑點(diǎn)，內(nèi)表面為黃白色，沒有特殊氣味，味苦澀[3]。核桃青皮中有豐富的多酚類物質(zhì)對(duì)人體有益，能有效減少氧化應(yīng)激和抑制大分子氧化并降低疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4～5]，Stampar 等人鑒定了核桃青皮中13種多酚類物質(zhì)，分別是：綠原酸，咖啡酸，阿魏酸，芥子酸，沒食子酸，鞣花酸，原兒茶酸，丁香酸，香草酸，兒茶素，表兒茶素，楊梅酮和胡桃醌[6]。在德國(guó)、法國(guó)民間曾使用青核桃酒替代嗎啡作為止痛藥[7]；國(guó)內(nèi)報(bào)道，青核桃酒能用于治療胃病、腹痛及癌癥[8～9]。目前我國(guó)核桃青皮大部分丟棄，部分農(nóng)民誤將其作為肥料埋入泥土，產(chǎn)生了嚴(yán)重的酚類感化作用，對(duì)植物生長(zhǎng)和土壤活性造成破壞[10]。利用青皮中豐富的多酚資源極具前景和意義，不僅能防止環(huán)境污染，還可以增加果農(nóng)的收入。綜述了國(guó)內(nèi)外對(duì)核桃青皮多酚成分、含量以及加工利用的研究現(xiàn)狀，為核桃青皮多酚類的提取和加工應(yīng)用提供全面的認(rèn)識(shí)。

1 核桃青皮中多酚的種類

多酚類是多羥基酚類化合物的總稱，廣泛存在于蔬菜、瓜果、豆類、茶葉等植物中。多酚在一些植物中有呈色作用，并能促進(jìn)機(jī)體健康，當(dāng)前被稱為第七營(yíng)養(yǎng)素。多酚的種類和功能見表1。核桃青皮中的多酚主要分為單寧類、萘醌類、黃烷酮類和酚酸類，生理功能有一定的共性：抗菌、抗腫瘤和抗氧化。

表1核桃青皮中多酚的種類及生理功能

Tab. 1 The types and physiological function of polyphenol in walnut green husk

2 核桃青皮提取物的功能和作用

2.1 抗細(xì)菌

Oliveira研究了核桃青皮提取液的抗菌活性，研究結(jié)果表明提取液對(duì)蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有高抗菌活性，對(duì)銅綠假單胞菌有中等抗菌活性[20]。Keskin等人研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有抑制作用，該研究數(shù)據(jù)表明核桃青皮提取液能抑制大多數(shù)食源性細(xì)菌，Keskin等人還使用GC-MS測(cè)定了提取液揮發(fā)性產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取液中環(huán)氧乙烷占比83.67%，環(huán)氧乙烷是有毒的致癌物，因此核桃青皮作為天然抗菌劑還需進(jìn)一步研究[21]。此外，萃取物中酚類的濃度對(duì)抗菌活性影響較小，可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)成分不同[22]。

2.2 抗真菌

核桃青皮提取液有一定的抗真菌活性，Yigit等人報(bào)道核桃青皮水和甲醇提取物對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶假絲酵母和高加索乳念珠菌有較好的抑制作用[23]。利用未成熟的核桃青皮汁液治療皮癬，其效果好于市售抗真菌藥，同時(shí)，胡桃醌的最小抑菌濃度大于市售抗真菌藥十一烯酸鋅和硫化硒，因此使用核桃青皮提取物治療真菌感染安全性可能更高[24]。

2.3 抗氧化

酚類化合物具有氧化還原的性質(zhì)，可以作為還原劑、自由基清除劑、單線態(tài)氧淬滅劑等[25]。植物中，總酚含量與抗氧化活性有正相關(guān)性[26]。Rahimipanah等人評(píng)價(jià)了核桃青提取物對(duì)向日葵油抗氧化的能力，認(rèn)為核桃青皮提取物是優(yōu)秀的抗氧化劑并能作為食品添加劑，抗氧化成分主要是多酚類物質(zhì)[27]。

2.4 抗癌

很多研究表明，核桃青皮提取物具有抗腫瘤和癌細(xì)胞的活性。核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)白血病細(xì)胞K562有較強(qiáng)的抑制活性，并發(fā)現(xiàn)核桃青皮中有抗K562細(xì)胞的單體物質(zhì)[28]。Alshatwi等人研究了核桃青皮提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的影響，結(jié)果顯示核桃青皮提取物能通過抑制該細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。Carvalho等人使用了核桃葉、青皮提取液抑制了人腎癌細(xì)胞(A-498，769-P)和結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)的生長(zhǎng)活性，但統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明核桃提取物對(duì)癌細(xì)胞的抑制能力與其總多酚含量無(wú)相關(guān)性，表明提取物中特定化學(xué)物或一類化學(xué)物可能是抗癌癥細(xì)胞增殖的主要因素[25]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：青龍衣粉針劑對(duì)小鼠H22腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，并隨計(jì)量的增加而加強(qiáng)[30]。

2.5 其他

核桃青皮中有抗病毒次生活性物質(zhì)，其提取液能抑制浸染心葉煙的煙草花葉病毒[31]。核桃青皮醇提物也是很好的殺蟲劑，對(duì)栗葉螨[32]、枸杞蚜蟲[33]和蘿卜蚜蟲[34]觸殺率很高，對(duì)植物無(wú)毒無(wú)害、易降解、無(wú)殘留。

3 影響核桃青皮的分離純化的因素

3.1 樣本性質(zhì)

不同品種、年份、樹齡以及不同的青皮預(yù)處理方法都會(huì)影響核桃青皮多酚活性物質(zhì)的提取率。核桃采摘的月份不同，核桃青皮中有效化學(xué)成分含量不同，其不同月份青皮中有效成分提取率為8月份>7月份>6月份[35]。不同品種核桃青皮活性成分含量不一，Jupanesti核桃青皮中胡桃醌的含量為42.78 mg/100 g，Vina核桃青皮中含量為20.56 mg/100 g[36]。核桃青皮原料收集后預(yù)處理方式對(duì)活性成分的影響較大，經(jīng)過曬干和烘干的核桃青皮其單寧大幅下降，陰干損失較小[12]；

3.2 提取溶劑

多酚類物質(zhì)易溶于極性大的溶劑，易溶于水、乙醇、丙酮，可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。不同的提取溶劑對(duì)其提取率和功能活性有較大影響。許多研究表明，乙醇是提取核桃青皮總多酚提取率最高的試劑，趙建國(guó)等人結(jié)果顯示50%乙醇提取率最高[37]，而王紅、李海洋等人認(rèn)為70%和85%乙醇提取率較高[35,38]。Fernández-agulló等人研究了溶劑對(duì)核桃青皮提取物抗菌和抗氧化性能的影響，核桃青皮經(jīng)冷凍干燥，使用5種萃取溶劑(水，甲醇，乙醇，50%甲醇、50%乙醇水溶液)，提取率按以下順序增加：乙醇<甲醇<50%甲醇<50%乙醇<水，提取率與溶劑的極性呈正比；提取物抗氧化性能按以下順序增加：水<乙醇<甲醇<50%甲醇<50%乙醇[39]。不同溶劑萃取山核桃外果皮，其萃取相的抑菌效果差異顯著，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最差，正丁醇相抑菌效果最好[40]。生產(chǎn)中需根據(jù)實(shí)際應(yīng)用目的，選擇合適的提取溶劑，總多酚含量與生物活性沒有絕對(duì)的相關(guān)性。

3.3 提取方法

提取試劑的pH值、溫度、時(shí)間、濃度、體積分?jǐn)?shù)以及原料預(yù)處理方法等都是影響提取率的因素，選擇最佳的提取方法需要考慮多因素的交互作用。使用一些輔助提取方法能提高提取效率和減少提取時(shí)間，例如添加螯合劑、超聲波、微波儀器等。趙建國(guó)等人以乙醇為提取溶劑，分別采用溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、六偏磷酸鈉(SHMP)輔助提取法提取核桃青皮多酚，結(jié)果顯示，采用SHMP 輔助微波提取法在70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比25∶1、SHMP添加量為0.6%條件下提取120 min，核桃青皮多酚的得率為4.01 mg·g-1，高于溶劑提取法73.4%[41]。添加EDTA也能提高多酚的提取率：料液比1∶17，EDTA添加量為0.3%，在45℃水浴提取90 min，提取率最高[37]。李海洋通過試驗(yàn)得出的核桃青皮多酚最優(yōu)提取工藝為：超聲輔助提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，時(shí)間為55 min，溫度為35℃，提取次數(shù)為3次，料液比為1∶100[35]。提取溶液中加入果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶也能提高核桃青皮中多酚的提取率，纖維素酶效果最佳[42]。提取方法的優(yōu)化應(yīng)綜合考慮以下幾點(diǎn)：提取成本、提取時(shí)間、提取率和環(huán)境污染。

3.4 純化方法

核桃青皮多酚類物質(zhì)的純化多使用大孔樹脂，張旭等人的研究結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂對(duì)鮮核桃青皮汁多酚的吸附性最好，解吸率最高。最佳條件為多酚質(zhì)量濃度2.0 mg·mL-1，pH值4.0，上樣體積1.6 BV，體積流量2.0 BV·h-1；以70%乙醇洗脫，體積流量2.0 Bv·h-1，體積2.10 BV。在此條件下，其純度由9.26%提高到52.29%[43]。翟梅枝研究了大孔樹脂分離純化核桃青皮總黃酮的工藝，最優(yōu)工藝是使用D101大孔樹脂吸附分離，上柱總黃酮與樹脂質(zhì)量比為1∶12，上樣液質(zhì)量濃度可在3.09 g·L-1～6.18 g·L-1范圍內(nèi)，pH值為5，6BV(1BV=23.7 mL)的水洗后用5BV的70%乙醇洗脫[44]。馬樂等人的試驗(yàn)表明：NKA-9 樹脂是分離純化核桃青皮多酚的最佳樹脂，吸附條件為上樣液多酚濃度0.574 mg·mL-1，pH值1.0，上樣速率1.3 mL·min-1，吸附率可達(dá)90.01%；洗脫條件為體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗脫劑，pH值3.0，洗脫速率0.43 mL·min-1，解吸率達(dá)87.9%[45]。

4 展望

至2015年底，四川省核桃種植面積達(dá)82.07萬(wàn)hm2，2015年全省產(chǎn)核桃干果40.8萬(wàn)t，年產(chǎn)量居全國(guó)第三[46]。不同核桃品種核桃青皮占整果比例約為40%～70%，而由鮮核桃整果加工核桃干果的得率約為20%，據(jù)此推算四川核桃青皮年產(chǎn)量約80萬(wàn)t～140萬(wàn)t，以核桃青皮干物質(zhì)為16%，經(jīng)分離純化的多酚提取物干基得率為4.01 mg·g-1計(jì)算[41]，將核桃青皮全部用于提取多酚，年產(chǎn)多酚提取物約512 t～912 t，產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益可觀。為了進(jìn)一步促進(jìn)核桃青皮加工和利用，對(duì)青皮多酚的活性成分、功能以及提取純化理論和應(yīng)用的下一步研究提出幾點(diǎn)展望：

(1)現(xiàn)有報(bào)道對(duì)有效成分和藥理作用不夠深入，難以作為應(yīng)用支撐，活性成分對(duì)某種功能(例如：抗癌)其成分、機(jī)理、相互作用、臨床試驗(yàn)還有待進(jìn)一步完善；

(2)總多酚的提取和純化報(bào)告較多，而對(duì)核桃青皮多酚單種有效成分的分離純化研究報(bào)道較少，例如 綠原素、咖啡酸、兒茶素等，單種有效成分的分離純化能提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和利用范圍；

(3)核桃青皮的純化研究均是提取液直接上樹脂，這樣會(huì)縮短樹脂的使用壽命，增加生產(chǎn)成本，在提取液經(jīng)過樹脂前是否需要以增加純度、去雜、提升樹脂使用壽命為目的的前處理還有待研究；

(4)核桃青皮中多酚提取物的相關(guān)產(chǎn)品的報(bào)道幾乎沒有，很大程度上限制了核桃青皮的開發(fā)及利用，未來需推動(dòng)核桃青皮多酚產(chǎn)品的研發(fā)、安全性評(píng)估、標(biāo)準(zhǔn)制定等工作；

(5)我國(guó)核桃產(chǎn)區(qū)分布廣且多在山區(qū)，核桃鮮果加工多為小規(guī)模人工處理，核桃青皮原料的收集和保存成為制約核桃青皮開發(fā)利用的決定性因素。因此，核桃青皮原料的收集和保存方式研究有待進(jìn)一步深入開展。

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