UPLC法測定血漿中維生素E的含量

朱江+何文姬+李翠蓮++郭貴唐++楊光能++張楨

[摘要]目的 臨床上建立一種快速、準(zhǔn)確測定兒童血漿中維生素E含量的方法。方法 取兒童血漿200 μl，按v/v為8∶2的比例加入甲醇和異丙醇140 μl，渦旋30 s，加入正己烷1 ml，渦旋1 min，在室溫條件下高速離心120 s（12 000×g），取離心后上清液700 μl，吹干，用100 μl甲醇復(fù)溶。色譜條件：采用Waters公司BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；取處理好的溶液5 μl進(jìn)樣，以0.3 ml/min的流速測定；甲醇-水（96∶4）為流動相；柱溫為30℃；檢測波長：291 nm。結(jié)果 血漿中維生素E色譜峰分離良好，無干擾線性回歸方程為：y=118296x+11644，r2= 0.9997，回收率在90%～120%。結(jié)論 本方法操作簡便，適用于兒童血漿中維生素E含量的快速監(jiān)測。

[關(guān)鍵詞]維生素E；超高液相色譜法；兒童；血漿

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（c）-0015-03

UPLC method in the determination of the content of Vitamin E in plasma

1.Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University in Yunnan Province，Kunming 650032，China；2.Kunming Children′s Hospital in Yunnan Province，Kunming 650034，China

[Abstract]Objective To establish a rapid and accurate method in the determination of the content of Vitamin E in children′s plasma clinically.Methods 200 μl children′s plasma was collected.140 μl methanol and isopropanol were added with the proportion of v/v，8：2，which were vortexed for 30 s.1 ml n-hexane was added and vortexed for 1 min.They were centrifuged at a high speed at room temperature for 120 s （12 000×g）.700 μl supernatant was collected after centrifuge，blown dry and redissolved by 100 μl methanol.Chromatographic condition：BEH C18 chromatographic column from Waters company was applied （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）.The prepared solution of 5 μl was taken as a sample，and determined with the flow rate of 0.3 mL/min.Methanol-water （96：4） was the mobile phase.The column temperature was 30℃.Under the condition，the determination wavelength was 291 nm.Results The chromatographic peak of vitamin E in plasma was separated favorably，and non-interference linear regression equation was y=118296x+11644，r2 = 0.9997.The recovery rate was 90%-120%.Conclusion The method is simple to operate，which is suitable for the rapid determination of Vitamin E content in children′s plasma.

[Key words]Vitamin E；Ultra high liquid chromatography；Children；Plasma

維生素在兒童的正常生長發(fā)育中必不可少，合理均衡地攝入維生素是兒童體格、智力正常發(fā)展的保證。維生素E發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)20年代，因為和人類的健康息息相關(guān)，一直受到廣大學(xué)者的關(guān)注，對其研究也越來越多。維生素E又稱生育酚（tocopherol）或抗不育維生素，為脂溶性維生素，金黃色或淡黃色黏稠油狀物，易溶于脂肪、乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于水，對熱、酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定，對氧敏感。維生素E能有效減少皺紋的產(chǎn)生、降低細(xì)胞耗氧量、抗動脈粥樣硬化、抑制脂質(zhì)過氧化及形成自由基、降低膽固醇、預(yù)防高血壓、防止血液凝固、預(yù)防治療甲狀腺疾病、改善血液循環(huán)、保護(hù)皮膚免受紫外線和污染的傷害、加速傷口愈合等作用[1-4]。同時研究提示維生素E具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、控制炎癥、基因表達(dá)和認(rèn)知能力的調(diào)控等作用[5-6]。人體自身不能合成維生素E，對兒童血漿中維生素E的濃度進(jìn)行測定不僅可以對兒童營養(yǎng)狀況進(jìn)行調(diào)查研究，也可以為臨床上合理補充維生素E提供相關(guān)依據(jù)。維生素 E 的測定方法有二階導(dǎo)數(shù)光譜法、HPLC法、氣相色譜法等，各種方法各有特點[7-15]。超高液相色譜（UPLC）是以超高速、超高靈敏度、超高分離度為特點的液相色譜。本研究參照高效液相色譜法，改用UPLC法測定，旨在建立一種快速、準(zhǔn)確測定兒童血漿中維生素E濃度的方法，現(xiàn)報道如下。endprint

1儀器及試劑

1.1儀器

Waters-ACQUITY-UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司），Sar-torius BT125D電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，MULTIFUGE X1R超高速離心機(jī)（美國Thermo公司），XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2試劑

對照品：維生素E（中國藥品生物制品檢定所，批號：100138-200603）；甲醇、乙腈：色譜純（美國Fisher公司）；水：自制超純水，水機(jī)（PURELAB ELGA公司，英國）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用Waters公司BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；取處理好的溶液5 μl進(jìn)樣（進(jìn)樣量），以0.3 ml/min的流速測定；甲醇-水（96∶4）為流動相；柱溫為30℃；選擇291 nm為檢測波長（維生素E）。

2.2樣品

儲備液的配制：精密稱定維生素E對照品5 mg，用甲醇稀釋到50 ml量瓶中，充分混勻既得維生素E的儲備液（1000 mg/L）。血樣預(yù)處理：取兒童血漿200 μl，按v/v為8：2的比例加入甲醇和異丙醇140 μl，渦旋30 s，加入正己烷1 ml，渦旋1 min，在室溫條件下高速離心120 s（12 000×g），取離心后上清液700 μl，吹干，用100 μl的甲醇溶液復(fù)溶。

2.3線性關(guān)系

取空白兒童血漿10份（每份200 μl），將不同濃度維生素E 50 μl加入空白血漿中，配成濃度為0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg/ml溶液，按“2.2”操作，按擬定色譜條件以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=118296x+11644，r2=0.9997，線性范圍為1～60 μg/ml。

2.4空白試驗

血漿按照“2.2”的處理方法和上述色譜條件進(jìn)行實驗，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對維生素E不造成干擾（圖1、圖2）。

2.5穩(wěn)定性試驗

2.5.1儲備液穩(wěn)定性試驗

取儲備液分別在1、3、5 d，配制標(biāo)準(zhǔn)使用液4 μg/ml，50 ug/ml直接進(jìn)樣測定，峰面積RSD為0.7%（4 μg/ml）、2.1%（50 μg/ml），表明儲備液至少在5 d穩(wěn)定。

2.5.2血樣穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按上述色譜條件，采用高中低濃度的維生素E標(biāo)本，在0、8、16、24 h進(jìn)行測定，得到的峰面積RSD分別為2.4%（高濃度組）、2.1%（中濃度組）、1.1%（低濃度組）。結(jié)果提示血漿中的維生素E在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗

取同一個批號的維生素E對照品精密稱定5 mg，按樣品測試條件進(jìn)行測定，求得維生素 E含量的RSD值為1.2%

2.7回收率試驗

在標(biāo)本中加入0.5～2倍的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品后，按血樣預(yù)處理的方法進(jìn)行處理，按照“2.1”的色譜條件測定，計算回收率，回收率在97.2%～110.0%，RSD值為0.63%（表1）。

2.8樣品測定結(jié)果

本實驗采用UPLC法測定300例健康兒童血漿中維生素E的含量，測得濃度范圍為16.31～32.23 μmol/L，平均值為（24.27±7.69） μmol/l。

3討論

維生素E易溶于正己烷而與水溶性成分分離，可達(dá)到提純的作用，本研究中使用少量異丙醇溶解、定容，增大了測定濃度。選擇吸收波長291 nm作為測定波長，靈敏度高，響應(yīng)值強(qiáng)，主峰周圍無其他雜峰干擾，專屬性強(qiáng)。本研究建立了UPLC測定兒童血漿中維生素E濃度的方法，結(jié)果提示本方法分離效果好、方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于兒童血漿中維生素E含量的測定，可為臨床補充維生素E提供依據(jù)。維生素 E 有著廣泛的藥物功能，尤其是其優(yōu)良的抗氧化性，在新生兒疾病的預(yù)防和治療方面具有積極作用和重要意義，也是新生兒正常生長發(fā)育所必需的物質(zhì)[16]。王曉燕等[16]總結(jié)了維生素E在兒科中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)維生素E作為體內(nèi)重要的抗氧化劑在治療新生兒缺血性腦病、貧血、新生兒硬腫、新生兒高膽紅素血癥和新生兒尿布皮炎等疾病中都有一定的效果?？诜S生素E后經(jīng)過被動擴(kuò)散進(jìn)人到小腸上皮細(xì)胞， 在人體內(nèi)吸收率存在差異，不同個體中的吸收率為20%～60% 不等；在這個過程中胰腺功能、膽汁酸鹽活性、脂肪的攝入量等因素都會影響其吸收率。

維生素E在體內(nèi)不能合成，必須從食物中獲得，目前普遍認(rèn)為成人維生素E的日需要量為15～20 mg，過量使用維生素E會導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降，同時還會影響其他維生素的吸收。近年來對維生素E的日補充劑量和毒副作用的研究引起了廣大學(xué)者的關(guān)注，梁世秀[17]研究了海參對維生素E的需要量以及維生素E對海參非特異免疫的影響，分別用不同劑量的維生素E喂養(yǎng)海參60 d，結(jié)果顯示100 mg/（kg·d）維生素E喂養(yǎng)組生長速率最快，體內(nèi)超氧化物歧化酶活性最高，因此適量補充維生素E有利于增加機(jī)體的免疫力。對于兒童維生素E的日補充劑量參照成人標(biāo)準(zhǔn)，但是由于兒童特殊的身體結(jié)構(gòu)和生理功能，筆者認(rèn)為維生素E的成人補充劑量不能完全反應(yīng)兒童維生素E的補充劑量，因此，應(yīng)該對不同年齡階段體內(nèi)維生素E的正常含量做出評價。不同年齡階段或者不同個體維生素E的日補充劑量也是今后的研究方向，特別是對早產(chǎn)兒和新生兒維生素 E 的治療劑量的研究也亟待解決。

[參考文獻(xiàn)]

[1]崔鳳杰，王宏媛，陳志蔚，等.從脫臭餾出物提取天然生育酚研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2012，（7）：9-11.endprint

[2]韓文祥.簡述維生素E的功能及其缺乏癥[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，（8）：110-111.

[3]孫小燕.維生素E的藥理研究和臨床新用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2010，（9）：230-231.

[4]崔旭海.維生素E的最新研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].食品工程，2009，（1）：8-10.

[5]倉寶成，宮璀璀，王莉，等.維生素E在體內(nèi)外具有抗氧化作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2016，36（1）：80-84.

[6]張冰潔，李艷麗，王志仁，等.維生素E對實驗性遲發(fā)性運動障礙的防治作用及可能機(jī)制[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2016，42（6）：347-351.

[7]何榮芬.高效液相色譜法測定白芷維生素E乳膏中維生素E的含量[J].中國藥業(yè)，2014，23（4）：40.

[8]彭云，吳美珠，劉燕，等.高效液相色譜法測定復(fù)方維E乳膏中維生素E的含量[J].今日藥學(xué)，2011，21（6）：340.

[9]何玉川，張亞茹.高效液相色譜法測定維生素E乳中維生素 E 的含量[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20（21）：64.

[10]黃家鶯，商軍，華賢輝.氣相色譜法測定維生素E注射液含量的不確定度評定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2014，12（6）：13-15.

[11]劉克海，呂慧，駱蔚燕，等.反相高效液相色譜法測定接骨木籽油中維生素E的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：55 -56，74.

[12]戚燕，王春艷，吳松.HPLC 法測定非諾貝特軟膠囊中維生素E的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15（5）：341-343.

[13]關(guān)晶，張建民，譚征. HPLC 測定醋酸地塞米松乳膏中維生素E的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（18）：102-104.

[14]陸松偉，虞慧華，陳方劍，等.用雙波長紫外分光光度法測定尿囊素維E乳膏中維生素E的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2015，15（5）：354-356.

[15]陳倩，胡朝英，張夢琪，等.用LC- MS/MS法測定人唾液中維生素E醋酸酯的濃度[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2016，16（3）：203-206.

[16]王曉燕，金春華.維生素E在新生兒的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（5）：953-956.

[17]梁世秀.海參腸肽對糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制的研究[D].青島大學(xué)， 2015.

（收稿日期：2017-10-30 本文編輯：閆 佩）endprint