黃芪多糖對小鼠免疫功能的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

范文彤

[摘要]目的 考察黃芪多糖多次給藥（14～17 d）對小鼠體液、細(xì)胞和非特異性免疫功能的影響。方法 選取雄性昆明種小鼠作為研究對象，按體重隨機(jī)分為8組，分別為空白對照組（考慮到纖維素本身也是多糖，為了排除其作用，特設(shè)空白組對照，下同）、正常對照組、模型組、靈芝多糖1000 mg/kg、黃芪多糖125、250、500、1000 mg/kg劑量組，每組12只，每天早8：00禁食，下午14：00根據(jù)體重灌胃給藥，給藥量為0.4 ml/20 g，空白組不給藥或溶媒，正常和模型組給予同體積的0.5%的CMC，給藥2 h后按3 g/只動(dòng)物的量喂食。共給藥15 d，于給藥第10 天除空白和正常對照組外其余所有小鼠右側(cè)腋部均接種S180荷瘤細(xì)胞，于末次給藥24 h后小鼠眼眶取血，分離血清，將血清稀釋3倍后測定IgG沉淀環(huán)直徑，與標(biāo)準(zhǔn)IgG相對照，計(jì)算樣品中IgG的相對含量，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 黃芪多糖125、250、500和1000 mg/kg能明顯增加環(huán)磷酰胺和荷瘤所致免疫低下小鼠的血清IgG含量。黃芪多糖500 mg/kg和1000 mg/kg能明顯增加放射損傷的小鼠血清IgG含量；2，4-二硝基氟苯皮膚接觸致敏后，1周左右再次接觸可以引起T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，黃芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg可增加2，4-二硝基氟苯引起的正常小鼠的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，黃芪多糖125 mg/kg和500 mg/kg可增加2，4-二硝基氟苯引起的環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)；黃芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg能明顯恢復(fù)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的吞噬細(xì)胞功能，500 mg/kg可使小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α顯著增加。結(jié)論 黃芪多糖具有明顯增加體液免疫的功能，對T淋巴系免疫細(xì)胞的功能有一定的促進(jìn)作用，且能顯著提高小鼠的非特異性免疫功能。

[關(guān)鍵詞]黃芪多糖；非特異性免疫；體液免疫；環(huán)磷酰胺

[中圖分類號] R543.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（c）-0010-05

Experimental research on the pharmacological effects of astragalus polysaccharide on immune function in mice

FAN Wen-tong

Tianjin Huairen Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300385，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharide in multiple administrations on humoral，cellular，and nonspecific immune function in mice from day 14 to 17.Methods Male Kunming mice were selected as the subjects，and randomly divided into 8 groups：blank control group （taking into account that the cellulose itself also belongs to polysaccharide，and blank control group was set in order to exclude its impact），normal control group，model group，1000 mg/kg Ganodermalucidum polysaccharide group，and groups of Astragalus polysaccharide in doses of 125 mg/kg，250 mg/kg，500 mg/kg and 1000 mg/kg.There were 12 animals in each group.Each day，8：00 was for fasting，and 14：00 for intragastric administration based on the weight （0.4 ml/20 g）.There was no drug or menstruum in the blank control group.In the normal and model groups，same volume of 0.5% CMC was offered.After 2-hour medication，food was provided with 3 g each mouse.The medication was lasted for 15 days.In day 10 of administration，S180 tumor-bearing cells were inoculated to the right axilla in mice except blank and normal control groups.24 hour after medication，blood was collected from eye socket，and serum was separated.The serum was diluted in 3 times to determine the diameter of IgG precipitation ring.By reference of the standard IgG，the relative content of IgG in the sample was calculated.The experimental results were statistically analyzed.Results Astragalus polysaccharide in 125，250，500 mg/kg，and 1000 mg/kg could significantly increase the serum IgG content in the immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide and tumorbearing.Astragalus polysaccharide in 500 mg/kg and 1000 mg/kg greatly increased the content of serum IgG in irradiated mice.After skin allergy due to exposure to 2，4-dinitrofluorobenzene，the delayed allergic reaction mediated by T cells could be induced by repeated skin contact about one week.Astragalus polysaccharide in 250 mg/kg and 500 mg/kg could increase delayed allergic reaction in normal mice induced by 2，4-dinitrofluorobenzene.If in 125 mg/kg and 500 mg/kg， astragalus polysaccharidecould increase the delayed allergic reaction in immunosuppressive miceinduced by cyclophosphamide which was from 2，4-dinitrofluorobenzene.Astragalus polysaccharide in 250 mg/kg and 500 mg/kg could obviously restore the phagocytic function in immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide，and 500 mg/kg could markedly raise the carbon clearance index K and phagocytic index α in mice.Conclusion It is indicated that thatastragalus polysaccharide has the function of increasing humoral immunity，promotes the function of T-lymphocyte immune cells，and can significantly improve the nonspecific immune function in mice.endprint

[Key words]Astragaluspolysaccharide；Nonspecificimmunity；Humoralimmunity；Cyclophosphamide

黃芪，又名綿芪[1]。多年生草本，高50～100 cm。主根肥厚，木質(zhì)，常分枝，灰白色。莖直立，上部多分枝，有細(xì)棱，被白色柔毛。黃芪多糖是從黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖，淡黃色，粉末細(xì)膩，均勻無雜質(zhì)，具引濕性；其由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，同時(shí)具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等作用[2]。本研究考察了黃芪多糖多次給藥（14～17 d）對小鼠免疫功能的影響[3]，旨在為臨床研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1對象與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明種小鼠由天津藥物研究院動(dòng)物室繁殖，試驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施合格證為“津試驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施第013號”，由天津市試驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)頒發(fā)，符合一級標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物正常飼養(yǎng)3 d后供用。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑

1.2.1.1受試藥物 ①黃芪多糖為供試品：淡黃色粉末，由天津中新藥業(yè)集團(tuán)天津中新制藥廠提供，含量為70%，產(chǎn)品批號為050609。臨用前以0.9%的羧甲基纖維素（CMC）或5%聚維酮（PVP）配制成適當(dāng)濃度的混懸液。②靈芝多糖為陽性對照藥，市售品，陜西省昂盛醫(yī)藥生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號為20160307。

1.2.1.2試劑 ①環(huán)磷酰胺（Cy）：白色粉末，上海研生醫(yī)藥股份有限公司購入，產(chǎn)品批號為2016060。②抗小鼠IgG血清：中國藥品生物制品檢定所購入，產(chǎn)品批號為20160609。

1.2.1.3培養(yǎng)基 ①M(fèi)-H培養(yǎng)基（瓊脂）：pH為7.4±0.2，由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為20160619。②M-H培養(yǎng)基（肉湯）：pH為7.4±0.2，由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為20160620。

1.2.1.4菌種 ①綠膿假單胞菌：中國藥品生物制品檢定所購入，產(chǎn)品批號為20160725。②萄球菌（臨床菌）：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院購入，產(chǎn)品批號為20160725。③流感病毒（A/PR/8/34）：中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所流感室購入，產(chǎn)品批號為20160725。

1.2.2儀器

YSQG02型電熱式蒸汽消毒器（無錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司），TJ型潔凈工作臺(tái)（天津市凈化設(shè)備廠），HZQ-D水浴振蕩器（常州市國旺儀器制造有限公司）。

1.3試驗(yàn)分組及模型制備

1.3.1黃芪多糖對體液免疫功能的影響[4]

選取96只體重為18～22 g的雄性昆明種小鼠，按體重隨機(jī)分為8組，分別為空白對照組（考慮到纖維素本身也是多糖，為了排除其作用，特設(shè)空白組對照，下同）、正常對照組、模型組、靈芝多糖1000 mg/kg、黃芪多糖125、250、500和1000 mg/kg劑量組，每組12只，每天早8：00禁食，下午2：00根據(jù)體重灌胃給藥，給藥量為0.4 ml/20 g，空白組不給藥或溶媒，正常和模型組給予同體積的0.5%的CMC，給藥2 h后按3 g/只動(dòng)物的量喂食。

1.3.2黃芪多糖對細(xì)胞免疫、非特異性免疫功能的影響[5-7]

選取141只體重為20～24 g的雄性昆明種小鼠，依照體重分為7組，每組12～22只，分別為空白對照組、正常對照組、模型組（Cy模型）、陽性對照組（靈芝多糖1 g/kg）、黃芪多糖125、250、500 mg/kg劑量組。

選取72只體重為20～24 g的雄性昆明種小鼠，依照體重隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為空白對照組、正常對照組、陽性對照組（靈芝多糖1 g/kg）、黃芪多糖125、250、500 mg/kg劑量組。

選取129只體重為20～24 g的雄性昆明種小鼠，依照體重隨機(jī)分為6組，每組20～22只，分別為正常對照組、模型組（Cy模型）、陽性對照組（靈芝多糖1 g/kg）、黃芪多糖125、250、500 mg/kg劑量組。

選取60只體重為20～24 g的雄性昆明種小鼠，依照體重隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為正常對照組、陽性對照組（靈芝多糖1 g/kg）、黃芪多糖125、250、500 mg/kg劑量組。

各組小鼠灌胃給藥，1次/d，連續(xù)14 d，藥物用3%PVP溶解。每天早上8：30禁食，于下午2：30～3：00根據(jù)體重灌胃給藥，灌胃體積為0.4 ml/20 g，給藥后2 h，按3 g/只動(dòng)物進(jìn)食量給飼料?？瞻住⒄φ战M分別給予同體積的空白溶媒。

1.4觀測指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 IgG含量的影響

給藥15 d，于給藥第10天除空白和正常對照組外其余所有小鼠右側(cè)腋部均接種S180荷瘤細(xì)胞，于末次給藥24 h后小鼠眼眶取血，分離血清，將血清稀釋3倍測定IgG沉淀環(huán)的直徑，以標(biāo)準(zhǔn)IgG相對照，計(jì)算樣品中IgG的相對含量。

1.4.2對放射損傷小鼠血清IgG含量的影響

給藥17 d，于給藥第8天除空白和正常對照組外給于其余所有小鼠1次照射銫源，劑量為3.0 Gy，于末次給藥24 h后小鼠眼眶取血，分離血清，將血清稀釋3倍后測定IgG沉淀環(huán)的直徑，以標(biāo)準(zhǔn)IgG相對照，計(jì)算樣品中IgG的相對含量。

1.4.3對Cy所致免疫低下小鼠血清IgG含量的影響

給藥15 d，于給藥第6 天除空白和正常對照組外給于其余所有小鼠皮下1次注射Cy 100 mg/kg造模，末次給藥24 h后小鼠眼眶取血，分離血清，將血清稀釋3倍測定IgG沉淀環(huán)的直徑，以標(biāo)準(zhǔn)IgG相對照，計(jì)算樣品中IgG的相對含量。endprint

1.4.4 Cy所致免疫低下小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性過敏反應(yīng)（DTH）的影響[6]

第8天除空白對照組外，各組小鼠腹部去毛（面積約3×3 cm），用1% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）的丙酮-麻油溶液涂抹腹部致敏，每鼠50 μl，并在致敏后2 h腹腔注射Cy 80 mg/kg造免疫低下模型，次日加強(qiáng)致敏并注射1次同劑量的同劑量Cy，于第13天用1%DNFB丙酮-麻油溶液10 μl均勻涂抹在小鼠右耳部攻擊，攻擊后24 h將小鼠稱重，造成遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（DTH），隨后處死動(dòng)物，剪兩側(cè)耳殼，用打孔器打直徑6 mm的片，稱重測定，比較兩側(cè)耳片重量差值的差別。

1.4.5對正常小鼠DTH反應(yīng)的影響

用兩側(cè)耳片重量的差值作為腫脹度指標(biāo)，比較各組小鼠耳片腫脹度的差別，觀察黃芪多糖對正常小鼠DNFB所致DTH反應(yīng)的影響。

1.4.6對Cy[8]所致免疫低下小鼠碳粒廓清的影響

第8天除對照組外，腹腔注射Cy 80 mg/kg造免疫低下模型，次日再注射1次同劑量Cy，于第15天小鼠尾靜脈注射25%印度墨汁0.1 ml/10 g，分別于1 min（t1）和5 min（t2）取血20 μl，加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，振蕩混勻，680 nm波長比色測定，并取肝臟和脾臟加以稱重，計(jì)算各劑量組小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。碳廓清指數(shù)K=（LogOD1-LogOD2）/（t2-t1）；吞噬指數(shù)α=（K）1/3×體重/（肝和脾重）。

1.4.7對正常小鼠碳廓清的影響

第15天小鼠尾靜脈注射25%印度墨汁0.1 ml/10 g，分別于1 min（t1）和5 min（t2）取血20 μl，加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，振蕩混勻，680 nm波長比色。隨后處死動(dòng)物，取肝臟和脾臟加以稱重，計(jì)算各劑量組小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。碳廓清指數(shù)K=（LogOD1-LogOD2）/（t2-t1）；吞噬指數(shù)α=（K）1/3×體重/（肝和脾重）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。

2結(jié)果

2.1黃芪多糖對荷瘤小鼠血清Ig G含量的影響

正常對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Cy模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），小鼠灌胃黃芪多糖500、1000 mg/kg與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表1）。

2.2黃芪多糖對放射損傷小鼠血清IgG含量的影響

正常組對照與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Cy模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），小鼠灌胃黃芪多糖500、1000 mg/kg與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表2）。

2.3黃芪多糖對Cy所致免疫低下小鼠血清IgG含量的影響

正常對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Cy模型組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），小鼠灌胃黃芪多糖500、1000 mg/kg，與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表3）。

2.4黃芪多糖對Cy所致免疫低下小鼠DTH反應(yīng)的影響

正常對照組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Cy模型組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），小鼠灌胃黃芪多糖125、500 mg/kg，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表4）。

2.5黃芪多糖對DNFB致正常小鼠DTH反應(yīng)的影響

正常對照組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），小鼠灌胃黃芪多糖250、500 mg/kg，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且高于同劑量的靈芝多糖（表5）。

2.6黃芪多糖對Cy所致免疫低下小鼠碳粒廓清的影響

Cy模型組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），小鼠灌胃黃芪多糖250、500 mg/kg，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表6）。

2.7黃芪多糖對正常小鼠碳粒廓清的影響

陽性對照組（靈芝多糖）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），小鼠灌胃黃芪多糖500 mg/kg，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)（表7）。

3討論

多糖[10]類化合物作為免疫調(diào)節(jié)劑能在多途徑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]，本研究從體液免疫[12]、細(xì)胞免疫、非特異性免疫等方面研究了黃芪多糖對機(jī)體免疫功能[13]的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示， 正常對照組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），小鼠接種S180瘤細(xì)胞后IgG含量明顯低于空白對照組，體液免疫功能下降，小鼠灌胃黃芪多糖500 mg/kg和1000 mg/kg 15 d后能明顯增加荷S180瘤小鼠血清IgG的含量；小鼠經(jīng)放射損傷后，模型組動(dòng)物血清的IgG含量明顯低于正常對照組。小鼠灌胃黃芪多糖500、1000 mg/kg 17 d后能明顯升高放射損傷小鼠血清的IgG含量；小鼠皮下注射1次Cy后， IgG含量明顯低于正常對照組，小鼠經(jīng)口灌胃黃芪多糖125、250、500、1000 mg/kg 15 d后能明顯升高小鼠血清IgG的含量；與同劑量的靈芝多糖相比作用相當(dāng)，提示黃芪多糖具有明顯的增加體液免疫的功能。endprint

T細(xì)胞介導(dǎo)的DTH反應(yīng)，是反應(yīng)T細(xì)胞功能的指標(biāo)，在不致敏的情況下，DNFB對兩耳幾乎沒有影響，致敏后可以明顯引起耳腫脹，Cy 80 mg/kg可明顯抑制由DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)，黃芪多糖125、500 mg/kg使小鼠受抑制的DTH反應(yīng)明顯恢復(fù)；黃芪多糖灌胃給藥14 d，可增加DNFB所致的DTH反應(yīng)。其中250、500 mg/kg劑量組可顯著增加小鼠耳片腫脹度，提示黃芪多糖對T淋巴系免疫細(xì)胞的功能有一定的促進(jìn)作用。小鼠腹腔注射Cy 80 mg/kg×2次，可明顯抑制小鼠吞噬細(xì)胞的功能，碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)下降，黃芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg給藥14 d，能明顯恢復(fù)Cy所致免疫低下小鼠的吞噬細(xì)胞功能，其中250 mg/kg劑量組與靈芝多糖500 mg/kg劑量組藥效相近；黃芪多糖500 mg/kg可使正常小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α顯著增加，與陽性藥靈芝多糖的作用接近，提示黃芪多糖可顯著提高正常小鼠的非特異性免疫功能[14]。

黃芪多糖將作為免疫增強(qiáng)劑廣泛應(yīng)用于多種疾病術(shù)前術(shù)后的治療、免疫力低下引起的感染以及腫瘤放化療后的綜合治療，具有巨大的市場開發(fā)前景[15]。

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（收稿日期：2017-09-11 本文編輯：閆 佩）endprint