老年晚期非小細(xì)胞肺癌外周血RRM1表達(dá)與吉西他濱療效及預(yù)后的相關(guān)性研究*

江波，朱穎，涂長(zhǎng)玲，何文杰，聶俊，楊承綱

[昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）1.干部醫(yī)療科，2.病理科，云南 昆明 650118]

無(wú)驅(qū)動(dòng)基因的晚期NSCLC的一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案目前仍然是鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的雙藥方案。既往臨床實(shí)踐提示：在化療方案及藥物劑量相同的情況下，不同個(gè)體對(duì)化療的敏感性差異很大，這種差異使依靠臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行化療面臨著極大的挑戰(zhàn)。老年人是個(gè)特殊群體，器官功能與藥物代謝和年輕人不同，臨床中有很多老年患者因化療療效的不確定性和毒副反應(yīng)的不可避免性而選擇放棄治療。DNA是許多抗腫瘤藥物的分子靶點(diǎn)，DNA的修復(fù)能力影響著化療藥物的療效，也和化療藥物的耐藥性相關(guān)。為了提高藥物的療效，減輕毒副反應(yīng)，可以通過(guò)對(duì)化療藥物相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平或多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，篩選出能夠從化療中獲益的老年人群，從而提高療效，減低毒副反應(yīng)?，F(xiàn)階段定量分析RRM1表達(dá)水平的研究主要針對(duì)來(lái)源于纖維支氣管鏡活檢或手術(shù)切除獲得的腫瘤組織，而對(duì)于老年晚期患者來(lái)說(shuō)，組織標(biāo)本無(wú)法再次獲取或者組織量較少的問(wèn)題尤為突出。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)老年晚期NSCLC患者外周血中RRM1的表達(dá)與吉西他濱化療藥物療效及預(yù)后的相關(guān)性，旨在尋找一種簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法進(jìn)行化療藥物的篩選。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

篩選云南省腫瘤醫(yī)院2013年9月-2015年12月收治且經(jīng)病理組織學(xué)診斷的晚期NSCLC患者40例，其中，男性32例，女性8例，男∶女為4∶1，年齡70～78歲，平均73歲，PS評(píng)分≤2分。病理類(lèi)型：鱗癌30例，均未行EGFR突變檢測(cè)；腺癌10例，其中6例EGFR野生型，4例EGFR突變未知型。Ⅲb期8例，Ⅳ期32例?；熐靶蠧T，彩超和全身骨骼核素掃描，常規(guī)檢查心、肺、肝、腎等功能?；煵捎眉魉麨I單藥的化療方案：吉西他濱1 000 mg/m2第1和8天，每21～28 d為1個(gè)周期；連續(xù)2～6個(gè)周期。病理組織分型按WHO組織學(xué)分類(lèi)（1998）標(biāo)準(zhǔn)，分期按1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制訂的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

外周血中RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒，熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技公司。PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)由北京BioRAD公司生產(chǎn)。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GeneBank的序列RRM1及管家基因β-actin進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。RRM1正向引物：5'-CCCTGACTATG CTATCCTGGC-3'，反向引物：5'-ACCATGGGAGAGTG TTTGCC-3'；管家基因正向引物：5'-AGCCTCGCCTTTG CCG-3'，反向引物：5'-CTCGTCGCCCACATAGGAAT-3'。引物由北京Invitrogen公司合成。

1.4 外周血中RNA的提取及cDNA的合成

在化療前和2個(gè)周期化療后分別抽取患者外周靜脈血4 ml置于EDTA抗凝管中，離心后棄去上層血漿，將細(xì)胞層移入離心管中。依據(jù)血液RNA提取試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行外周血中RNA的提取。依據(jù)cDNA合成試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行cDNA的合成反應(yīng)。

1.5 qRT-PCR

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品RRM1及管家基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋成6個(gè)濃度后，進(jìn)行SYBR qRT-PCR。反應(yīng)體系中加入Real Master Mix/SYBR Solution 22.5μl，正反向引物各 1μl，Rox reference dye 0.5μl，DNA 模板5μl，DEPC水20.5μl。反應(yīng)條件：聚合酶的活化20 s，95℃，PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.6 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

療效按WHO實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)判定分為：完全緩解（complete response，CR），部分緩解（partial response，PR），疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）， 疾 病進(jìn)展（progression disease，PD）。CR+PR為有效，CR+PR+SD為控制。無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）指自治療首日至病變進(jìn)展日；總生存期（overall suvvival，OS）為治療首日至死亡日或失訪日，均以月計(jì)。隨訪結(jié)止時(shí)間：2016年4月。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理前，治療前外周血RRM1的表達(dá)以其中位數(shù)為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。2個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法、Logrank法檢驗(yàn)及Cox多因素回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血RRM1及管家基因的電泳結(jié)果

以含有RRM1和管家基因的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，片段長(zhǎng)度正確，經(jīng)測(cè)序證實(shí)兩序列一致。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血中RRM1不同表達(dá)水平的電泳結(jié)果

2.2 外周血RRM1的表達(dá)水平

以管家基因β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算RRM1的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算方法：RRM1mRNA拷貝數(shù)/β-actin mRNA拷貝數(shù)，計(jì)算平均值。外周血中RRM1的中位表達(dá)水平為：26.7%（12.32%～55.86%）。

2.3 外周血RRM1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

外周血RRM1的表達(dá)水平以中位數(shù)26.7%為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。高表達(dá)組的表達(dá)水平為：（51.65%±4.21%）；低表達(dá)組的表達(dá)水平為：（15.33%±3.01%）。兩組與臨床特征的相關(guān)性見(jiàn)表1。

表1 外周血RRM1表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性

2.4 外周血RRM1表達(dá)與化療療效的關(guān)系

本組患者共接受單藥吉西他濱方案化療146周期，無(wú)CR患者，9例PR，總有效率（CR+PR）為22.5%，8例SD（20%），疾病控制率（CR+PR+SD）為42.5%，23例PD（57.5%）。RRM1低表達(dá)組有效率（RR）40%（8/20），RRM1 高表達(dá)組有效率 5%（1/20），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。RRM1低表達(dá)組疾病控制率（disease control rate，DCR）65%（13/20），RRM1高表達(dá)組疾病控制率20%（4/20），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），見(jiàn)表2。

表2 外周血RRM1表達(dá)水平與化療療效的關(guān)系 （n=20）

2.5 外周血RRM1表達(dá)與生存期的關(guān)系

本組病例中位總生存期（OS）為13.3個(gè)月，1年生存率為66.7%，2年生存率為4.6%。RRM1低表達(dá)組和高表達(dá)組，中位OS分別為14.8個(gè)月和11.6個(gè)月，1年生存率分別為76.7%和53.3%；2年生存率分別為9.3%和0%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），見(jiàn)圖1。OS與性別（男：13個(gè)月vs女：15個(gè)月，P=0.052）、病理類(lèi)型（鱗癌：14個(gè)月vs腺癌：14.5個(gè)月，P=0.139）、分期（ⅢB期：13.2個(gè)月vsⅣ期：14.5個(gè)月，P=0.148）均無(wú)相關(guān)性。

本組病例中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為3.7個(gè)月。RRM1低表達(dá)組和高表達(dá)組，中位PFS分別為4.4個(gè)月和3.2個(gè)月；經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 外周血RRM1表達(dá)水平與生存期的關(guān)系

2.6 晚期NSCLC預(yù)后的Cox多因素分析

將OS單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素分析時(shí)，Cox回歸分析顯示：RRM1表達(dá)是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后因素，見(jiàn)表3。

圖3 外周血RRM1表達(dá)水平與無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系

表3 Cox回歸變量分析

3 討論

已有研究[2-4]提示：吉西他濱用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，RRM1的表達(dá)水平增高會(huì)使腫瘤細(xì)胞的耐藥性增加。既然晚期NSCLC患者中RRM1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥的相關(guān)性已經(jīng)明確，RRM1的表達(dá)水平應(yīng)該可以成為篩選患者的一項(xiàng)指標(biāo)。多項(xiàng)Meta分析[5-7]提示：RRM1低表達(dá)的患者對(duì)吉西他濱化療更敏感，生存期也更長(zhǎng)；RRM1的表達(dá)可預(yù)測(cè)吉西他濱化療的療效。ZHANG等[8]的研究同時(shí)檢測(cè)了外周血中RRM1和ERCC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外周血RRM1低表達(dá)的患者比RRM1高表達(dá)的患者有更高的化療有效率和更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期；而外周血ERCC1的表達(dá)水平與吉西他濱和鉑類(lèi)化療的療效及生存期無(wú)相關(guān)性。從現(xiàn)有的標(biāo)本來(lái)看，外周血中的表達(dá)檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)便而且容易獲取，對(duì)于無(wú)法獲取組織及組織標(biāo)本量較少的老年患者來(lái)說(shuō)，外周血替代組織標(biāo)本檢測(cè)是可行的。

本研究以老年晚期NSCLC為研究對(duì)象，化療藥物選擇單藥吉西他濱，排除了鉑類(lèi)藥物的影響因素，使研究因素較為單一，因此能較好地反應(yīng)外周血RRM1的表達(dá)與吉西他濱療效間的關(guān)系。研究顯示：外周血RRM1的表達(dá)水平與老年晚期NSCLC患者的性別，病理類(lèi)型及分期均無(wú)相關(guān)性。外周血RRM1低表達(dá)的患者比RRM1高表達(dá)的老年患者有更高的化療有效率，疾病控制率和更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期，說(shuō)明老年晚期NSCLC外周血RRM1低表達(dá)的患者更能從吉西他濱的化療中獲益。而生存期與老年患者的性別，分期，病理類(lèi)型無(wú)明顯的相關(guān)性。多因素分析還顯示外周血RRM1的表達(dá)水平是老年晚期NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素。通過(guò)本項(xiàng)研究為晚期NSCLC無(wú)法再獲取組織標(biāo)本的老年患者如何選擇化療藥物提供了理論依據(jù)。

[1]JEMAL A,SIEGEL R,WARD E,et al.Cancer statistics,2009[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians,2009,59(4): 225-249.

[2]BEPLER G,WILLIAMS C,SCHELL M J,et al.Randomized international phase Ⅲ trial of ERCC1 and RRM1 expressionbased chemotherapy versus gemcitabine/carboplatin in advanced non–small-cell lung cancer[J].Journal of Clinical Oncology,2013,31(19): 2404-2412.

[3]ZHANG Y,LI X,CHEN Z,et al.Abstract 5537: Ubiquitination of RRM1 by Ring1B (RNF2) promotes its degradation and nuclear export[J].Cancer Research,2011,71(8 Supplement): 5537.

[4]BEPLER G,OLAUSSEN K A,VATAIRE A L,et al.ERCC1 and RRM1 in the international adjuvant lung trial by automated quantitatⅣe in situ analysis[J].American Journal of Pathology,2011,178(1): 69-78.

[5]ZENG C,FAN W,ZHANG X.RRM1 expression is associated with the outcome of gemcitabine-based treatment of non-small cell lung cancer patients-a short report[J].Cellular Oncology,2015,38(4):319-325.

[6]YAN ZHANG,XIN S U,YI SHI.Relationship between RRM1expression and therapeutic effects of gemcitabine for advanced non-small-cell lung cancer:a meta-analysis[J].Med J Chin Pla,2012,37(2): 135-140.

[7]GONG W,ZHANG X,WU J,et al.RRM1 expression and clinical outcome of gemcitabine-containing chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer: a meta-analysis[J].Lung Cancer,2012,75(3): 374-380.

[8]ZHANG G B,CHEN J,WANG L R,et al.RRM1 and ERCC1 expression in peripheral blood versus tumor,tissue in gemcitabine/carboplatin-treated advanced non-small,cell lung cancer[J].Cancer Chemotherapy & Pharmacology,2012,69(5): 1277-1287.