姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究

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缺血再灌注損傷(IRI)是目前臨床尚未解決的一個(gè)復(fù)雜問題，對(duì)心血管系統(tǒng)有害，是導(dǎo)致心臟衰竭，心臟手術(shù)和心肌梗死后發(fā)病率和死亡率高的主要原因[1-2]。IRI是指在病理損傷過程中，心肌細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)缺血，血液恢復(fù)供應(yīng)后，出現(xiàn)較灌注之前更嚴(yán)重的損傷，如出現(xiàn)心律失常、心肌梗死面積加大等，許多因素可導(dǎo)致IRI。西醫(yī)認(rèn)為心肌缺血再灌注損傷與Ca2+超載，細(xì)胞凋亡、壞死和自噬，能量代謝出現(xiàn)障礙，微血栓的形成及血小板的聚集，炎癥反應(yīng)等有關(guān)。中醫(yī)根據(jù)其病位及胸悶、胸痛等臨床表現(xiàn)，將該病歸屬于“胸痹”“心悸”等范疇。

姜黃素(Cur)1，7-雙(4-羥基-5-甲氧基苯基)-1，6庚二烯-3，5-二酮(二糠基甲烷)，是一類從姜黃根莖中分離出的天然產(chǎn)物(姜黃)，該草藥已廣泛應(yīng)用在中國和南亞[3-5]。姜黃是姜科植物，其根莖可入藥，氣香特異，味苦、辛，性溫，歸脾、肝經(jīng)；具有破血行氣、通經(jīng)止痛功能，用于胸脅刺痛、胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、癥瘕、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛[6]。姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面藥理作用。有研究顯示，Cur可減輕腦、腎、視網(wǎng)膜、肝臟和結(jié)腸的缺血再灌注損傷[7-10]。有相關(guān)研究報(bào)道，姜黃素后處理通過激活預(yù)存活信號(hào)通路減輕IR損傷[9，11]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)[12-15]在腫瘤、炎癥、卡路里限制而延長壽命及心肌肥厚等方面有相關(guān)研究，其對(duì)抗氧化應(yīng)激從而發(fā)揮保護(hù)作用，但姜黃素能否通過SIRT3保護(hù)心肌細(xì)胞IRI目前缺乏相關(guān)研究。本研究旨在探討姜黃素預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞IRI模型的保護(hù)作用及SIRT3所介導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 姜黃素、MTT(美國Sigma公司)；BCl-2，Bax，Sirt3，β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；3-TYP(由重慶大學(xué)IDRC創(chuàng)新藥物研究中心合成)；二抗(北京中山科技有限公司)；TUNEL試劑盒(德國Mannheim公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞的制備和模擬IR治療 使用先前報(bào)道的方法H9C2的原代培養(yǎng)物培養(yǎng)。將心肌細(xì)胞暴露于含有以下試劑的缺血緩沖液：NaCl 137 mmol/L，KCl 12 mmol/L，MgCl20.49 mmol/L，CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L和Hepes 4 mmol/L。該緩沖液補(bǔ)充有以下化合物：脫氧葡萄糖10 mmol/L，連二硫酸鈉0.75 mmol/L和乳酸鹽 20 mmol/L。緩沖液pH為6.5，并將細(xì)胞潮濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱(21%O2，5%CO2，37 ℃)中孵育1.5 h。在正常空氣和培養(yǎng)基條件下再灌注4 h。

1.2.2 選擇姜黃素濃度及細(xì)胞培養(yǎng)與處理 觀察Cur預(yù)處理是否減輕IRI心肌細(xì)胞，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、IR組、Cur(2.5 μmol、5 μmol、10 μmol)+IR組(n=8)。前期研究MTT結(jié)果表明，5 μmol和10 μmol Cur對(duì)細(xì)胞活力的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此選擇5 μmol Cur用于本研究。觀察Cur預(yù)處理后SIRT3對(duì)IRI心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，按隨機(jī)區(qū)組法分為IR組，Cur+IR組，3-TYP+IR組，Cur+3-TYP組+IR組。

H9C2在補(bǔ)充有10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，UT，USA)中，在37 ℃，5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)。在DMSO中制備姜黃素儲(chǔ)備溶液，并在實(shí)驗(yàn)之前立即用培養(yǎng)基稀釋。DMSO(0.01%)用作對(duì)照組，進(jìn)行處理后，獲取細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。

1.2.3 細(xì)胞存活率測定 通過MTT實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估H9C2心肌細(xì)胞活力。預(yù)處理的細(xì)胞用PBS洗滌后，加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶于無酚紅DMEM中的溶液，37 ℃孵育4 h。使用分光光度計(jì)(SpectraMax 190，Molecular Device，USA)在490 nm測定結(jié)果，細(xì)胞存活率通過光密度(OD)值表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒進(jìn)行TUNEL測定分析細(xì)胞凋亡。根據(jù)說明書使用雙染色技術(shù)，將H9C2在4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行TUNEL測定以染色凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核(綠色)，并使用4’6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色所有核(藍(lán)色)。凋亡指數(shù)表示為陽性染色的凋亡H9C2數(shù)目/H9C2總數(shù)×100%。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)SOD，GSH-Px和MDA濃度測定 使用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)SOD，GSH-Px和MDA活性。所有實(shí)驗(yàn)按說明書進(jìn)行。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 將H9C2樣品在含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.3)，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1%Triton X-100和1%蛋白酶的裂解緩沖液抑制劑混合物中。將12 000 g裂解物離心15 min，得到上清液轉(zhuǎn)移至新管中并在-70 ℃下儲(chǔ)存。使用Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，并通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水和吐溫20(TBST，pH 7.6)中封閉1 h，之后在4 ℃下針對(duì)SIRT3(1∶500稀釋)，BCl-2，Bax，SOD2和β-actin(1∶1 000稀釋)抗體中孵育過夜。印跡用TBST洗滌，之后在室溫下用合適的第二抗體(1∶5 000稀釋)探測90 min，并用TBST洗滌。通過化學(xué)發(fā)光檢測蛋白質(zhì)條帶并用Quantity One軟件包(West Berkeley，CA，USA)測定。對(duì)照組的結(jié)果定義為100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism-5統(tǒng)計(jì)軟件(La Jolla，CA，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。組間比較采用單因素方差分析(SPSS13.0)。所有組分析用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度姜黃素預(yù)處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響 與IR組比較，Cur(2.5 μmol、5 μmol、10 μmol)預(yù)處理顯著增加細(xì)胞存活率(P<0.01)；與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度Cur組組間比較，Cur(5 μmol、10 μmol)與Cur(2.5 μmol)組比較顯著增加細(xì)胞活力(P<0.01)。詳見圖1。

2.2 各組IRI后對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)和蛋白表達(dá)的影響 與IR組比較， Cur預(yù)處理顯著降低凋亡指數(shù)(P<0.01)；與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)，詳見圖2、圖3。與IR組比較，Cur預(yù)處理組BCl-2蛋白濃度升高(P<0.01)，BAX蛋白濃度減低(P<0.01)；BAX蛋白濃度增高(P<0.01)。與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組BCl-2蛋白濃度減低(P<0.01)，與IR組比較，Cur+IR組SIRT3蛋白濃度升高(P<0.01)，AcSOD蛋白濃度減低(P<0.01)。Cur+3-TYP+IR組、3-TYP+IR組SIRT3蛋白濃度降低(P<0.01)；與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組、3-TYP+IR組SIRT3蛋白濃度減低(P<0.01)；與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組AcSOD蛋白濃度增高(P<0.05)，3-TYP+IR組AcSOD蛋白濃度增高(P<0.01)。詳見圖4、圖5。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.05 ；與IR組比較，##P<0.01；與 Cur2.5 μmol組比較，&&P<0.01。

圖2 各組缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，**P<0.05 ；與IR組比較，##P<0.01；與Cur+IR組比較，&&P<0.01。

注：與IR組比較，**P<0.01；與Cur+IR組比較，##P<0.01。

注：與IR組比較，**P<0.01；與Cur+IR組比較，##P<0.01。

2.3 Cur和3-TYP預(yù)處理對(duì)IR損傷的心肌細(xì)胞氧化損傷指標(biāo)的影響 與IR組比較，Cur+IR組和Cur+3-TYP+IR組SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.01)；與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組和3-TYP+IR組SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與IR組比較，Cur+IR組MDA水平顯著降低(P<0.01)。與Cur+IR組比較，Cur+3-TYP+IR組和3-TYP+IR組MDA水平顯著增加(P<0.01)。詳見圖6。

注：與IR組比較，**P<0.01；與Cur+IR組比較，##P<0.01。

3 討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素在抗氧化過程中通過調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2-ARE)[16]、核因子-κB(NF-κB)[17]、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶/活性氧(ROS)[18]、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/內(nèi)皮細(xì)胞性一氧化氮合酶(eNOS)[19]和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[20]等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，激活相應(yīng)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)控功能基因的表達(dá)水平，增加或抑制多種蛋白表達(dá)，改善氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化作用，改善炎癥、癌癥、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病臨床癥狀，然而SIRT3信號(hào)通路是否對(duì)該過程有保護(hù)作用尚未確定。

SIRT3是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙酰化酶，是唯一與人類老化相關(guān)的Sirtuins家族成員，作為細(xì)胞內(nèi)多個(gè)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，SIRT3成為心血管疾病相關(guān)領(lǐng)域研究的新方向。在心血管系統(tǒng)基礎(chǔ)研究中，Qiu等[12]實(shí)驗(yàn)證明SIRT3通過激活A(yù)cSOD減少細(xì)胞ROS。Porter等[14]進(jìn)一步證實(shí)SIRT3敲除小鼠心臟在缺血再灌注損傷過程中，其功能修復(fù)能力減低和心肌梗死面積擴(kuò)大，SIRT3缺失可提高心肌缺血再灌注損傷的敏感性。Sundaresan等[21]發(fā)現(xiàn)，SIRT3通過激活MnSOD、Foxo3a水平減輕細(xì)胞ROS抑制心肌肥厚。SIRT3基因敲除小鼠對(duì)心肌肥厚和纖維化高度敏感，過表達(dá)SIRT3可拮抗應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌[22]。因此，本研究推測姜黃素在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷過程中可能是SIRT3通過激活A(yù)cSOD水平減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用的。

本研究結(jié)果顯示，Cur+IR組BCl-2的表達(dá)高于IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組；IR組BAX表達(dá)高于Cur+IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組，說明Cur促進(jìn)抗凋亡蛋白BCl-2表達(dá)，減少促凋亡蛋白Bax表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激指標(biāo)測定，Cur+IR組SOD、GSH-Px表達(dá)高于IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組；IR組MDA表達(dá)高于Cur+IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組，說明Cur通過抗氧化應(yīng)激損傷而保護(hù)心肌細(xì)胞。Cur+IR組SIRT3表達(dá)高于IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組，IR組AcSOD表達(dá)高于Cur+IR組、3-TYP+IR組、Cur+3-TYP+IR組，說明SIRT3通過上調(diào)AcSOD對(duì)損傷心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。因此推測姜黃素通過上調(diào)AcSOD促進(jìn)SIRT3表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)受損的心肌細(xì)胞。

綜上所述，本研究提示姜黃素預(yù)處理心肌細(xì)胞IRI模型，SIRT3表達(dá)水平增高，AcSOD表達(dá)水平、MDA、BAX表達(dá)水平降低，姜黃素通過促進(jìn)SIRT3表達(dá)抗氧化應(yīng)激損傷保護(hù)心肌細(xì)胞，可作為心臟手術(shù)和缺血性心臟病中心肌IRI治療的藥物，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

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