基于耐缺氧能力檢測(cè)的心腦寧膠囊質(zhì)量控制方法研究

郭婷+董永喜+何峰+黃家宇+董莉

[摘要] 目的 建立可用于心腦寧膠囊質(zhì)量控制的生物活性測(cè)定方法。方法 該次研究地點(diǎn)為貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，于2016年9月—2017年4月選擇健康昆明KM小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常組、鹽酸異丙腎上腺素模型組、鹽酸川芎嗪陽(yáng)性藥組以及心腦寧膠囊高、中、低劑量組。皮下注射鹽酸異丙腎上腺素 建立心肌缺氧模型（正常組注射生理鹽水）后，小鼠分別給予藥物鹽酸川芎嗪以及不同劑量的心腦寧膠囊，測(cè)定存活時(shí)間。并測(cè)定12批心腦寧膠囊的生物活性。結(jié)果 與模型組比較，心腦寧膠囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg劑量給藥3 d后，可顯著增加缺氧小鼠的存活時(shí)間（P<0.05） ，分別增加21.42%、25.31%；且12批樣品均具有較好的生物活性，使小鼠存活時(shí)間增加24.74%以上（P<0.05）。結(jié)論 基于耐缺氧能力的心腦寧膠囊生物活性測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠，能有效控制心腦寧膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 心腦寧膠囊；耐缺氧能力；生物活性測(cè)定；質(zhì)量控制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）12（b）-0012-04

[Abstract] Objective To establish the measurement method of biology activity of quality control of xinnaonign capsules. Methods 10 healthy Kunming KM mice in 6 group in our hospital from September 2016 to April 2017 were selected， including the normal group， isoproterenol hydrochloride mode group， and Ligustrazine Hydrochloride positive drug group and high-dose， moderate-dose and low-dose xinnaoning capsules group， and the mice was respectively given the ligustrazine hydrochloride and different doses of xinnaoning capsules after establishing the myocardial anoxia modes （injection of normal saline in the normal group）， and the survival time was measured， and the biology activities of 12 batches of xinnaoning capsules was measured. Results The administration of xinnaoning capsules of 0.68 g/kg and 1.35 g/kg for three days can obviously increase the survival time of hypoxia mice compared with that in the mode group（P<0.05）， and the increase values were respectively 21.42% and 25.31%， and 12 batches of samples had better biology activity， thus increasing the survival time of mice by more than 24.74%（P<0.05）. Conclusion The xinnaoning capsule based on the hypoxia-resistance ability test is accurate and reliable， which can effectively control the internal quality of xinnaoning capsules.

[Key words] Xinnaoning capsules； Hypoxia tolerance； Biochemical activity measurement； Quality control

心腦寧膠囊是治療心血管疾病的常用中藥復(fù)方制劑，由銀杏葉、小葉黃楊等配伍組成的，主要用于治療氣滯血瘀的胸痹，頭痛，眩暈，癥見(jiàn)：胸悶刺痛，心悸不寧，頭暈?zāi)垦５?，以及冠心病、腦動(dòng)脈硬化見(jiàn)上述癥狀者[1-3]。臨床療效顯著，受到廣大醫(yī)生和患者的歡迎。心腦寧膠囊在2015 年版《中國(guó)藥典》一部中的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要采用理化分析方法，對(duì)總黃酮醇苷和丹酚酸B進(jìn)行含量測(cè)定，難以全面反映制劑的生物活性。中藥的生物活性是直接測(cè)定藥物有效性，是中藥質(zhì)量控制中現(xiàn)有理化測(cè)定方法所不能替代的，近年來(lái)成為了中藥質(zhì)量控制的熱點(diǎn)[4-5]。目前心腦寧膠囊的質(zhì)量控制以薄層色譜定性鑒別和含量測(cè)定為主[6-7]，缺乏以生物活性為指導(dǎo)的質(zhì)量控制方法，因此該實(shí)驗(yàn)于2016年9月—2017年4月選擇健康KM小鼠60只選擇小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)對(duì)心腦寧膠囊進(jìn)行生物活性測(cè)定方法的研究，建立其生物活性測(cè)定方法以控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 試劑與試藥

心腦寧膠囊（批號(hào)20141012），鈉石灰（批號(hào)2015 0618），鹽酸異丙腎上腺素注射液（ISO，批號(hào)20151102），注射用鹽酸川芎嗪（批號(hào)13090529）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康KM小鼠，18～22 g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)SCXK（黔）2012-0001）。endprint

1.3 心腦寧膠囊對(duì)小鼠常壓耐缺氧能力限值劑量的研究

小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g。隨即分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組、ISO模型組（15 mg/kg）、鹽酸川芎嗪組（40 mg/kg）、心腦寧膠囊高、中、低劑量組（1.35、0.68、0.34 g/kg），小鼠每天上午9：00灌胃給藥3 d，末次給藥后1 h，各組小鼠以15 mg/kg ISO皮下注射（正常組注射生理鹽水）， 20 min后，分測(cè)定小鼠存活時(shí)間并計(jì)算其增加率[8]。

1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取心腦寧膠囊以1.35 g/kg劑量給藥，按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行6次平行測(cè)定試驗(yàn)，計(jì)算小鼠存活時(shí)間增加率。

1.5 中間精密度

1.5.1 不同實(shí)驗(yàn)人員 對(duì)6 名實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行編號(hào)，稱(chēng)取心腦寧膠囊6份均以1.35 g/kg劑量給藥，按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算小鼠存活時(shí)間增加率。

1.5.2 不同工作日（日間精密度） 稱(chēng)取心腦寧膠囊6份均以1.35 g/kg劑量給藥，于第1天、第2天……第6天分別給藥，按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算小鼠存活時(shí)間增加率。

1.6 不同批次心腦寧膠囊生物活性的測(cè)定

分別取不同批號(hào)的12批心腦寧膠囊（1.35 g/kg），按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算小鼠存活時(shí)間增加率。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 限值劑量研究

表1結(jié)果表明，與正常組比較，ISO模型組小鼠的存活時(shí)間顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，心腦寧膠囊以劑量0.68 g/kg、1.35 g/kg給藥3 d可明顯增加小鼠的存活時(shí)間（P<0.05），分別增加21.42%、25.31%。為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和重復(fù)性，后期實(shí)驗(yàn)中選用1.35g/kg劑量作為限值劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同一樣品平行測(cè)定6次的結(jié)果，與模型組比較，心腦寧膠囊（1.35 g/kg）均可顯著增加小鼠的存活時(shí)間（P<0.05），增加率為22.71%～29.46%，表明重復(fù)性較好，見(jiàn)表2。

2.3 中間精密度

2.3.1 不同實(shí)驗(yàn)人員 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同的6 名實(shí)驗(yàn)人員以1.35 g/kg心腦寧膠囊給藥3 d后進(jìn)行測(cè)定，與模型組比較，心腦寧膠囊均可顯著增加小鼠的存活時(shí)間（P<0.05），增加率為25.35%～31.08%，表明不同實(shí)驗(yàn)人員之間的中間精密度良好，見(jiàn)表3。

2.3.2 不同工作日（日間精密度） 按1.3項(xiàng)下方法，于第1天、第2天……第6天分別給藥心腦寧膠囊后進(jìn)行測(cè)定，與模型組比較，6次試驗(yàn)均可顯著增加小鼠的存活時(shí)間（P<0.05），增加率為22.39%～30.04%，表明方法的日間精密度良好。見(jiàn)表4。

2.4 不同批次心腦寧膠囊的生物活性測(cè)定

不同批號(hào)的12批樣品測(cè)定結(jié)果，與模型組比較，心腦寧膠囊均可顯著增加小鼠的存活時(shí)間（P<0.05），使小鼠存活時(shí)間增加24.74%以上，表明該方法適用性較好，見(jiàn)表5、表6。

3 討論

由于中藥成分復(fù)雜、來(lái)源多區(qū)域、有效成分不明確等特點(diǎn)，以薄層色譜鑒別、含量測(cè)定以及和指紋圖譜為主的現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)就無(wú)法控制其藥效，具有一定的局限性[9]。因此要保證中藥藥效，應(yīng)增加以有效性為目的的質(zhì)量控制方法，以達(dá)到中藥質(zhì)量可控的目的[10-11]。而以直接測(cè)定藥物的有效性的生物活性測(cè)定法，體現(xiàn)了在中藥質(zhì)量控制中的優(yōu)勢(shì)，2010年版和2015年版《中國(guó)藥典》也已經(jīng)增加了《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》，充分體現(xiàn)了生物活性測(cè)定已經(jīng)成為了中藥質(zhì)量控制中的作用[11-14]。芮菁等[15]以30 mL/kg的劑量采用小鼠體內(nèi)血栓形成、大鼠血小板聚集、小鼠急性腦缺血試驗(yàn)建立了燈盞細(xì)辛注射液生物活性的測(cè)定方法，潘善慶等[16]以10 mL/kg的劑量采用CCl4肝損傷小鼠建立了立肝炎靈注射液生物活性的測(cè)定方法。

鹽酸異丙腎上腺素注射液是兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)，為β受體激動(dòng)劑，使心肌耗氧量明顯；而其誘導(dǎo)的心肌缺氧模型由于其易于操作、穩(wěn)定可靠，在心血管疾病研究中為經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。因此，本試驗(yàn)采用該經(jīng)典方法以復(fù)制小鼠心肌缺氧缺血模型[8]。

在實(shí)驗(yàn)中，選擇具有活血化瘀功能的川芎嗪作為陽(yáng)性藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，心腦寧膠囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg劑量給藥3 d后，可顯著增加缺氧小鼠的存活時(shí)間（P<0.05） ，分別增加21.42%、25.31%。并根據(jù)《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，且12批樣品均具有較好的生物活性，使小鼠存活時(shí)間增加24.74%以上（P<0.05），結(jié)果表明該法操作簡(jiǎn)單靈敏度高、重復(fù)性好，可用于心腦寧膠囊質(zhì)量控制的生物活性測(cè)定。

隨著研究的深入，如今已應(yīng)用生物活性測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，如采用部分凝血酶時(shí)間法測(cè)定水蛭的抗凝活性[17]、抑菌圈檢測(cè)法測(cè)定扶正消積膠囊的抗菌效價(jià)[18]、管碟法測(cè)定雙黃連口服液的抗菌效價(jià)[19]。生物活性測(cè)定法作為對(duì)現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)補(bǔ)充完善，將會(huì)有更多的研究報(bào)道以使其得到更好的推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2017-09-14）endprint