辛伐他汀預(yù)處理保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷分析

楊藝敏+劉忠民

[摘要] 目的 研究辛伐他汀預(yù)處理保護(hù)大腦腦缺血再灌注損傷。方法 選擇2016年10月—2017年5月在該院觀察的30只健康的雄性大鼠作為該文的研究對(duì)象，將大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只大鼠，分別為辛伐他汀預(yù)處理組（A組）、模型加溶媒組（B組）和假手術(shù)組（C組），使用線栓法制作大鼠大腦動(dòng)脈缺血再灌注模型，并且進(jìn)行2 h的再灌注，24 h之后對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，并且將大鼠斷頭取腦，對(duì)大鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)、腦梗死體積和Fas表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 B組大鼠的腦梗死體積為（36.2±54.20）%，A組大鼠的腦梗死體積為（23.2±37.50）%，和B組相比，A組的腦梗死體積有明顯的縮小；B組的神經(jīng)功能缺損為（2.80±0.42）分，A組的神經(jīng)功能缺損為（1.62±0.23）分，A組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比B組的改善明顯，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A組、B組的Fas表達(dá)分別為（31.25±2.65）%、（65.25±4.25）%，A組和B組的凋亡細(xì)胞數(shù)量為（30.21±3.14）%、（44.26±4.12）%，以此表示A組腦組織Fas表達(dá)和凋亡的細(xì)胞數(shù)量比B組降低明顯，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 辛伐他汀能夠保護(hù)大鼠腦缺血再灌注的損傷，通過對(duì)腦組織Fas表達(dá)的抑制降低細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 辛伐他??；預(yù)處理；大鼠；腦缺血再灌注；損傷

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）12（b）-0045-03

[Abstract] Objective To study the simvastatin pretreatment in protecting the cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods 30 cases of healthy male rats observed in our department from October 2016 to May 2017 were selected as the research objects and randomly divided into three groups with 10 cases in each， including the simvastatin pretreatment group （A group）， model and solution medium group（B group） and sham-operation group （C group）， and the cerebral artery ischemia reperfusion model of rats was made by the suture-occluded method for two-hour reperfusion， and the nerve function was marked after 24 h， and the number of apoptotic cells， cerebral infarct volume and Fas expression of rats were measured. Results The cerebral infarct volume in the group A was obviously shortened compared with that in the group B， [（23.2±37.50）% vs （36.2±54.20）%]， and the nerve function defect in the group A was obviously improved compared with that in the group B， [（1.62±0.23）points vs （2.80±0.42）points]， and the difference was statically significant（P<0.05）， and the Fas expression in the group A and in the group B was respectively （31.25±2.65）% and （65.25±4.25）%， and the number of apoptotic cell in the group A and in the group B was respectively （30.21±3.14）% and （44.26±4.12）%， therefore， the Fas expression and number of apoptotic cells in the group A obviously decreased compared with those in the group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The simvastatin can protect the cerebral ischemia reperfusion injury in rats， and it can reduce the cell apoptosis by restraining the Fas expression of cerebral tissues.

[Key words] Simvastatin； Pretreatment； Rat； Cerebral ischemia reperfusion； Injury

腦血管病屬于導(dǎo)致人類死亡的三大疾病，全球每年都有五百萬人因?yàn)槟X血管病死亡，尤其是在工業(yè)化國家中，患病和死亡人群的都在65歲以上。我國也是腦卒中死亡率較高的國家， 每年都有上百萬人因?yàn)榇瞬∷劳?，部分幸存者也?huì)留下偏癱等一系列的后遺癥，從而喪失勞動(dòng)能力及生活能力。缺血性腦卒中占據(jù)了腦血管病的85%，所以就要重視腦梗死的防治，以此實(shí)現(xiàn)受損神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，這方面的研究一直以來都是醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。在現(xiàn)代溶栓技術(shù)不斷發(fā)展的過程中，血管再通能夠使腦組織重新得到血液，降低了神經(jīng)元的損傷，有效提高臨床療效。但是因?yàn)榫哂性诠嘧p傷，在血液供應(yīng)恢復(fù)的過程中細(xì)胞還是會(huì)走向死亡[2-3]。他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，在臨床中應(yīng)用能夠?qū)π难芗膊』颊哌M(jìn)行治療，在對(duì)他汀類藥物研究過程中表示，其不僅能夠降脂，還能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的作用，比如抗血栓、血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、降低炎性反應(yīng)等[4]。2016年10月—2017年5月該文擬使用大鼠腦缺血再灌注模型，觀察辛伐他汀預(yù)處理對(duì)腦血管再灌注損傷的保護(hù)作用。endprint

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

辛伐他汀片；氯化三苯基四氮銼粉劑（sigma）；Fas抗體；免疫組化染色試劑；顯色劑。該實(shí)驗(yàn)的主要儀器包括沈陽市龍首電子儀器有限公司的病理組織脫水機(jī)；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠的電熱恒溫培養(yǎng)箱；成都泰盟科技有限公司的醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)；唐辰電子提供的病理組織包埋機(jī)；OLYMPUS提供的光學(xué)顯微鏡。

1.2 動(dòng)物和分組

該文選擇30只健康雄性大鼠作為觀察對(duì)象，所有大鼠均為陜西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，大鼠的體重在250～300 g之間，將所有的大鼠隨機(jī)分為3組，分別為辛伐他汀預(yù)處理組（A組）、模型加溶媒組（B組）和假手術(shù)組（C組），每組10只大鼠。

1.3 給藥方式

使用生理鹽水將辛伐他汀藥物制作成為懸浮液，在大鼠手術(shù)之前10 d根據(jù)大鼠的體重20 mg/kg進(jìn)行灌胃，每天如此，為B組大鼠給予同樣體積的生理鹽水。

1.4 制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型

在大鼠連續(xù)灌胃10 d之后的第11天，使用線栓法制作大鼠大腦動(dòng)脈缺血再灌注模型，并且進(jìn)行2 h的再灌注，一共灌注24 h。使用水合氯醛10%腹腔灌注將大鼠進(jìn)行麻醉，將右頸總動(dòng)脈分離并且剪下一個(gè)小口，將0.215 mm直徑的尼龍繩頭端燒成光滑的杵桿樁插入到大鼠體內(nèi)，計(jì)算頸總動(dòng)脈分叉處的進(jìn)線深度，結(jié)果為（18.0±0.5）mm，直到大腦中的動(dòng)脈起始處能夠?qū)⒀┩耆淖钄?。再灌注的時(shí)候向外拉尼龍線，從而使大鼠頸內(nèi)及大腦中的動(dòng)脈血液供應(yīng)能夠恢復(fù)，如果大鼠的右眼出現(xiàn)Horner征、在提尾的時(shí)候大鼠左前肢內(nèi)收屈伸、爬行的時(shí)候向左側(cè)傾倒，或者爬行的時(shí)候根據(jù)逆時(shí)針的方向轉(zhuǎn)圈，就表示模型創(chuàng)建成功。C組大鼠不需要插入線栓，其他操作都和以上操作步驟相同[5]。

1.5 神經(jīng)功能的評(píng)定

根據(jù)前人研究方法在大鼠再灌注手術(shù)清醒時(shí)候?qū)Υ笫筮M(jìn)行神經(jīng)功能的評(píng)分：沒有明顯的神經(jīng)功能缺損為0分；不能夠伸展左側(cè)前肢為1分，行走時(shí)候向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，行走的時(shí)候向左側(cè)傾斜為3分；喪失意識(shí)，不能夠自己行走為4分。排除0分和2分大鼠。

1.6 制作標(biāo)本

在制作模型成功之后再灌注甲醛溶液4%對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌流固定之后斷頭取腦，自視交叉之后向前向后分別去取 2.5 mm左右的冠狀腦片，對(duì)其固定之后脫水透明，使用石蠟包埋，連續(xù)切片實(shí)現(xiàn)染色免疫組化。

1.7 功能的檢測(cè)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)根據(jù)試劑盒中的說明書實(shí)現(xiàn)，F(xiàn)as免疫陽性細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)為棕黃色或者棕褐色。通過光鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡，如果神經(jīng)元胞膜及胞質(zhì)具有棕黃色的顆粒，表示為陽性，在陽性細(xì)胞分布區(qū)隨意選擇五個(gè)不重復(fù)的高倍鏡視野，將每個(gè)視野中的陽性細(xì)胞數(shù)量作為 計(jì)算凋亡的指標(biāo)從而對(duì)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)算。

在手術(shù)24 h之后對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉斷頭取腦迅速將其放置到-20℃的冰箱中進(jìn)行保存10 min，將小腦、嗅球及低位腦干進(jìn)行去除，其他部分進(jìn)行冠狀位切片，從額極向后以2 mm進(jìn)行切片，一共5片，之后將腦片迅速放入到TTC溶液中避光，之后在37℃中進(jìn)行30 min的孵育，在孵育之后使用數(shù)碼相機(jī)照相，在計(jì)算機(jī)中輸入染色的結(jié)果，通過圖像處理軟件對(duì)各個(gè)腦片缺血側(cè)的面積及梗死區(qū)域體積進(jìn)行計(jì)算[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

該文數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料使用（x±s）表示，使用t進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死、神經(jīng)功能缺損的對(duì)比

表1為3組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損的對(duì)比，以此表示C組大鼠通過染色之后的腦片全紅，B組大鼠頂葉、右側(cè)額和紋狀體都有明顯的白色梗死灶，A組大鼠的腦梗死體積有明顯的縮小，并且神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況改善明顯，優(yōu)于其他兩組，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 3組大鼠辛伐他汀預(yù)處理與Fas表達(dá)

表2為3組大鼠辛伐他汀預(yù)處理和Fas表達(dá)的關(guān)系，以此表示A組大鼠比其他兩組的Fas表達(dá)具有明顯的增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且腦組織Fas表達(dá)和凋亡的細(xì)胞數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

缺血性卒中是因?yàn)槎喾N原因?qū)е碌哪X部血液供應(yīng)障礙，從而導(dǎo)致腦部組織出現(xiàn)不可逆的損害，以此導(dǎo)致出現(xiàn)腦組織缺血和缺血缺氧性壞死。在腦組織損傷之后應(yīng)該得到恢復(fù)，但是因?yàn)檠鳠o法超過再灌注時(shí)間窗，以此出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙，就是腦缺血再灌注損傷，從而擴(kuò)大梗死病灶。腦缺血再灌注損傷屬于較為復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中包括多個(gè)環(huán)節(jié)，比如酸中毒、能量障礙、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、凋亡基因激活等等，從而成為惡性循環(huán)，使細(xì)胞凋亡或者壞死。缺血性腦卒中屬于人們常見的腦血管疾病，其多發(fā)部位為大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域。該文使用大鼠實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈閉塞模型的主要原因是因?yàn)榇笫竽X血管解剖的特點(diǎn)和人類較為相似，都是通過頸內(nèi)動(dòng)脈及椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)構(gòu)成，并且其腦體積大小適中，具有良好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，便于組織生化的分析。目前，大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型得到了良好的發(fā)展，成為現(xiàn)代腦缺血損傷病理生理改變的研究和治療藥物篩選的有效手段[7]。

腦缺血再灌注之后，F(xiàn)as蛋白陽性細(xì)胞的數(shù)量不斷的增加，尤其是缺血周圍更加明顯，并且其分布較為廣泛，包括海馬神經(jīng)細(xì)胞、皮質(zhì)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如果Fas在胞膜及胞漿中表達(dá)，表示其導(dǎo)致出現(xiàn)腦缺血后細(xì)胞的凋亡。相關(guān)研究表示，兩組鼠在缺血24 h之后都會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象，但是Fas基因突變大鼠的腦梗死面積較小。Fas利用水解實(shí)現(xiàn)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白催化及調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)分離，對(duì)調(diào)節(jié)的功能造成影響，導(dǎo)致細(xì)胞骨架塌陷[8]。

在該文研究中，C組大鼠Fas表達(dá)較少，B組大鼠比C組要強(qiáng)，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且表達(dá)主要在缺血周圍。A組表達(dá)降低，和B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是比C組差異較大，這和王歡歡[8]的研究結(jié)果相一致，這是因?yàn)镕as通過水解能夠分離 細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白催化結(jié)構(gòu)。該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)A組凋亡細(xì)胞率降低，這有可能和Fas表達(dá)降低相關(guān)，以此降低腦梗死體積，對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行改善，以此保護(hù)大腦。辛伐他汀預(yù)處理能夠保護(hù)再灌注損傷，這和Fas降低和抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，辛伐他汀能夠保護(hù)大鼠腦缺血再灌注的損傷，通過對(duì)腦組織Fas表達(dá)的抑制降低細(xì)胞的凋亡，值得臨床推廣使用。

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（收稿日期：2017-09-15）endprint