耐多藥結(jié)核分枝桿菌的研究進(jìn)展

程 楓， 杭亞平， 熊國亮*

(1.江西省胸科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

1 Mtb(結(jié)核分枝桿菌,Mycobacterium tuberculosis)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)作為單一病因傳染病中病死率最高的疾病，一直是威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。長期以來，由于不合理的聯(lián)合用藥、管理不善、不規(guī)律用藥及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染[1-2]等，Mtb仍在全球流行。近年來，耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-Mtb)菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響治療周期及其效果，已成為新世紀(jì)TB控制的難題之一。據(jù)WHO報(bào)道，全球2014有新發(fā)TB病人960萬，190萬人死于TB，其中3.5%新發(fā)病例和20.5%經(jīng)治病例罹患耐多藥TB，約9%為泛耐藥TB。我國2012年TB發(fā)病率為78/10萬，患病率為108/10萬， TB已成為重點(diǎn)防治的傳染病之一，病情監(jiān)測(cè)覆蓋率100%，每年約有100萬例新發(fā)結(jié)核病患者。據(jù)2015年WHO估算，我國每年新發(fā)5.2萬例耐多藥結(jié)核病患者，是Mtb多重耐藥性最嚴(yán)重的國家之一。最近有報(bào)道，一種新的Mtb耐藥基因型“北京”的傳播，很大程度上造成我國耐多藥和泛耐藥Mtb的產(chǎn)生[3]，歐洲和非洲也有類似情況的存在[4]。2010年全國第五次TB流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示耐多藥率為6.8%[5]。因此，耐多藥Mtb的防治是當(dāng)今亟待解決的問題。

2 耐多藥Mtb的基本概念

耐多藥Mtb(multidrug resistantMycobacteriumtuberculosis, MDR-Mtb)是指經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥的Mtb。泛耐藥Mtb(extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosis，XDR-Mtb)則是經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)除同時(shí)對(duì)異煙肼、利福平及全部氟喹諾酮類藥物耐藥外，還對(duì)至少一種二線抗Mtb藥物(阿米卡星素、卡那霉素和卷曲霉)耐藥。Mtb的耐藥類型分為基因抗性和表型抗性兩類?；蚩剐灾饕憩F(xiàn)在增殖期菌株自發(fā)的染色體突變，突變頻率為10-6～10-8且互不相關(guān)，與其他細(xì)菌依賴調(diào)節(jié)基因(如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子)的耐藥方式不同。首先由于藥物的不規(guī)則供應(yīng)、不合理應(yīng)用及患者依從性差促進(jìn)基因突變率增加，使得臨床耐藥Mtb的產(chǎn)生，隨后參與單耐藥的不同突變基因播散并連續(xù)累積導(dǎo)致耐多藥/廣泛耐藥的發(fā)生。表型抗性是由于靜息菌株的表觀遺傳變異和蛋白修飾而形成的。Mtb的體內(nèi)耐藥性尤為復(fù)雜，有研究表明藥物的過度使用會(huì)引起外排作用增強(qiáng)，使得基因抗性和表型抗性相互促進(jìn)和重疊[6]。

3 Mtb的耐藥機(jī)制及其臨床表征

Mtb耐藥機(jī)制主要是katG、rpoB、pncA、embB、rpsL、inhA、gyrA等不同靶位基因相繼發(fā)生突變，部分是由堿基缺失或插入導(dǎo)致，具體表現(xiàn)為藥物失活(或者修飾)，藥物作用靶位突變致結(jié)合能力下降，細(xì)胞膜滲透性降低或主動(dòng)外排作用加強(qiáng)，抑制藥物作用活性形式的前體，過度生成抗菌藥物靶點(diǎn)等。

Mtb對(duì)常見一、二線藥物耐藥機(jī)制：①M(fèi)tb對(duì)異煙肼的耐藥最常見，但異煙肼單耐藥TB相對(duì)易治療。經(jīng)證實(shí)Mtb體外異煙肼耐藥發(fā)生率是10-5～10-6[7]，異煙肼的高水平耐藥通常由katG編碼的過氧化氫和過氧化物酶的缺失引起，最近有結(jié)果顯示katG啟動(dòng)子突變可造成異煙肼耐藥的產(chǎn)生[8]。②Mtb對(duì)利福平的體外耐藥發(fā)生率為10-7～10-8[7]，且預(yù)后差、易復(fù)發(fā)。96%耐利福平Mtb中發(fā)現(xiàn)rpoB第81堿基對(duì)的特定區(qū)域存在突變。Mtb對(duì)利福平的單耐藥少見，因此，利福平耐藥可作為雙重耐藥，即MDR-Mtb的標(biāo)志[9]。③諸多證據(jù)顯示氟喹諾酮類藥物在MDR-Mtb治療中起到關(guān)鍵作用，常提示MDR-Mtb治療預(yù)后差[10-11]。氟喹諾酮類耐藥決定區(qū)突變是Mtb對(duì)氟喹諾酮類耐藥的最重要機(jī)制[12]。氟喹諾酮類耐藥Mtb的流行非常嚴(yán)重，且在不同區(qū)域其突變基因差異明顯，各地區(qū)應(yīng)重視。④Mtb對(duì)吡嗪酰胺耐藥主要原因是pncA突變導(dǎo)致吡嗪酰胺酶活性喪失[7]。Mtb對(duì)乙胺丁醇的耐藥常由于embCAB操縱子的突變引起的，embB多見，同時(shí)發(fā)現(xiàn)embB與ubiA基因的共突變將導(dǎo)致乙胺丁醇的高水平耐藥[13]。Mtb對(duì)吡嗪酰胺/乙胺丁醇耐藥常提示預(yù)后不良，同時(shí)也會(huì)影響其他藥物的敏感性[14]。⑤Mtb對(duì)鏈霉素耐藥主要是由rpsL編碼的S12蛋白和rrs編碼的16S rRNA突變導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)rrs位置1400的突變與丁胺卡那霉素和卡那霉素的高度耐藥相關(guān)。紫霉素和卷曲霉素在結(jié)構(gòu)上相似，Mtb對(duì)兩者耐藥是由于rrs和tlyA(編碼rRNA修飾酶2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)突變所致，后者是其耐藥性產(chǎn)生的重要原因?？敲顾?、紫霉素、卷曲霉素和阿米卡星之間存在交叉耐藥[5]。⑥大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過抑制細(xì)菌50S核蛋白體合成及核肽鏈的延伸而發(fā)揮作用。此外，耐藥Mtb染色體上的erm編碼產(chǎn)生的酶將23S rRNA核蛋白體亞基的特異性腺嘌呤殘基N6位甲基化，改變核糖體構(gòu)象，降低Mtb與大環(huán)內(nèi)酯類的親和力[16]。⑦乙硫異煙胺是異煙酸的衍生物，現(xiàn)已證實(shí)Mtb的inhA突變與乙硫異煙胺和異煙肼耐藥有關(guān)[17]。⑧D-環(huán)絲氨酸已用于臨床，作用靶點(diǎn)不專一，D-丙氨酸連接酶已被確認(rèn)為抗結(jié)核藥物重要靶點(diǎn)[18]，近期臨床研究顯示Mtb對(duì)D-環(huán)絲氨酸的耐藥與ald和alr突變關(guān)系密切[19]。⑨對(duì)氨基水楊酸是臨床上常用于MDR-Mtb治療的重要藥物，folC基因突變使二氫葉酸合成酶活性降低，同時(shí)導(dǎo)致對(duì)氨基水楊酸無法在菌體內(nèi)被“活化”，從而引起Mtb對(duì)對(duì)氨基水楊酸發(fā)生耐藥[20]。

4 MDR-Mtb的治療

目前MDR-Mtb的治療包括化學(xué)治療、經(jīng)纖維支氣管鏡局部注藥治療、經(jīng)皮肺穿刺注藥介入治療、免疫治療[21]、外科治療、基因治療和中西醫(yī)結(jié)合治療，目前以化學(xué)治療為主。

4.1 化學(xué)治療

化學(xué)治療MDR-TB，治療周期會(huì)更長，總療程一般為9～30個(gè)月，使用的藥物種類也增加1倍以上，而治愈率降低50%～70%。2015年TB化學(xué)治療指南中指出，XDR-Mtb的總治療療程為30個(gè)月，莫西沙星、丙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、克拉霉素、阿莫西林-克拉維酸鉀、吡嗪酰胺強(qiáng)化12個(gè)月，繼續(xù)期18個(gè)月，每日使用強(qiáng)化期治療方案中除卷曲霉素之外的6種。如患者不能耐受丙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸可用對(duì)氨基水楊酸[22]。

4.2 經(jīng)纖維支氣管鏡局部注藥

經(jīng)纖維支氣管鏡局部注藥是治療MDR-Mtb的有效措施。采用靜脈及局部灌注高濃度抗Mtb藥物的方案提高局部藥物濃度，達(dá)到殺菌目的，療效顯著優(yōu)于常規(guī)劑量治療，毒副反應(yīng)輕，效果良好[22]。

4.3 經(jīng)皮肺穿刺注藥介入治療

經(jīng)皮肺穿刺注藥介入治療是近年來對(duì)MDR-Mtb治療的新嘗試。王小路等[23]研究證明，經(jīng)皮肺穿刺介入治療組痰轉(zhuǎn)陰率及空洞閉合率顯著增高，療效顯著、安全。

4.4 外科治療

外科治療適用于經(jīng)反復(fù)化療，病情遷延不愈，肺組織破壞嚴(yán)重，形成空洞或部分肺毀損的MDR-Mtb患者。由于其血運(yùn)少，病灶藥物濃度偏低，所以難以殺滅耐藥菌。目前治療MDR-TB比較理想的手術(shù)方式包括全肺切除術(shù)、解剖性肺葉切除術(shù)和復(fù)合肺切除術(shù)[24]。

4.5 基因治療

有研究證實(shí)RNAi靶向療法可以增強(qiáng)宿主抗Mtb能力或改善藥物對(duì)抗性菌株的效力，同時(shí)使副作用最小化[25]，其中的核心技術(shù)是將RNAi分子轉(zhuǎn)入靶向細(xì)胞，以非侵入性方式直接治療TB。

5 MDR-Mtb的新藥研發(fā)進(jìn)展

MDR-Mtb的治療迫切需要療效高、副作用小、療程短、可口服給藥的抗Mtb新藥。

5.1 貝達(dá)喹啉

貝達(dá)喹啉屬二芳基喹啉類化合物，自1964年利福平獲批以來，至今首個(gè)具有全新作用機(jī)制的抗Mtb藥物，可靶向作用于ATP合成酶的質(zhì)子泵，干擾能量的產(chǎn)生，對(duì)復(fù)制及非復(fù)制狀態(tài)的Mtb均有殺菌作用，且與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物無交叉耐藥[26]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)貝達(dá)喹啉能夠顯著縮短抗Mtb治療療程，Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率顯著高于安慰劑組，療效明顯且副作用小[27]。2015年貝達(dá)喹啉和德拉馬尼已經(jīng)被納入耐藥TB的化學(xué)治療指南，并被歸類于第5組[22]。

5.2 德拉馬尼

德拉馬尼屬硝基咪唑類，于2014年獲批為抗Mtb新藥，可通過抑制分枝菌酸的合成，進(jìn)而抑制Mtb細(xì)胞壁的合成。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率顯著高于安慰劑組[28]。在耐藥或因耐受性無法制定有效治療方案時(shí)，允許被作為聯(lián)合治療方案的組成部分用于成人MDR-Mtb患者。

5.3 利奈唑胺

利奈唑胺可以抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，于2000年成為首個(gè)獲FDA批準(zhǔn)的唑烷酮類藥。Lee等[29]在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)早期立即應(yīng)用利奈唑胺有利于結(jié)核患者痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰，可用于XDR-Mtb的治療。此外，短期加用利奈唑胺是治療危重TB患者安全有效的選擇。

5.4 SQ109

SQ109是從乙胺丁醇類似物篩選出最具抗菌潛力的新藥。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與異煙肼及利福平存在協(xié)同作用，同其他一線藥物聯(lián)合也未見拮抗作用。SQ109可能具有目前尚不清楚的獨(dú)特而重要的作用靶點(diǎn)、機(jī)制或活化途徑[30]。二環(huán)硝基咪唑類代表藥物PA-824具有半衰期長，體內(nèi)積蓄等優(yōu)點(diǎn)，體外試驗(yàn)證明其對(duì)耐藥菌株具有高度活性，未見與一、二線藥物交叉耐藥，并可用于非復(fù)制型Mtb，是治療潛伏期TB的候選藥物。另外一種硝基咪唑類衍生物OPC-67683也可用于MDR/XDR-Mtb的治療。這三種藥物雖然僅局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且作用機(jī)制尚不明確，但其展示出的應(yīng)用前景是毋庸置疑的，有望成為臨床新型的抗Mtb藥物[31]。

6 快速病原學(xué)診斷和耐藥檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

Mtb痰培養(yǎng)適用于TB的確診、耐藥監(jiān)測(cè)和藥敏試驗(yàn)，是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)過長，無法作為快速診斷手段。縮短病原學(xué)診斷和耐藥檢測(cè)的時(shí)間有助于早期制定治療方案，提高患者治愈率并降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

6.1 PCR診斷技術(shù)

基于PCR的分子診斷技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)Mtb菌群DNA及利福平耐藥突變，整個(gè)檢測(cè)過程需24 h。2010年WHO批準(zhǔn)GeneXpertMTB/Rif用于TB的病原學(xué)診斷和利福平耐藥檢測(cè)，耗時(shí)2 h。Genotype?RMTBDRplus是一種可同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥的MDR-TB快速分子診斷技術(shù)，整個(gè)過程5 h內(nèi)完成，這兩種技術(shù)均操作簡(jiǎn)單，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行。

6.2 線性探針技術(shù)(HAIN)

Mtb經(jīng)DNA提取、擴(kuò)增后直接與探針雜交，根據(jù)探針組顯色情況判定是否耐藥。黃玉平等[32]對(duì)459例TB涂陽患者痰標(biāo)本應(yīng)用HAIN快速檢測(cè)耐利福平、異煙肼菌株，發(fā)現(xiàn)其特異度高，24 h內(nèi)完成，是診斷MDR-Mtb的方法。但需要特殊設(shè)備及環(huán)境，且對(duì)操作技術(shù)和防污染措施要求嚴(yán)格，普及較困難。

6.3 血清蛋白指紋圖譜測(cè)定

方素芳等[33]應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)和蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血清蛋白，發(fā)現(xiàn)血清蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)快速、簡(jiǎn)便，標(biāo)本用量少，可成為一種新型快速檢測(cè)MDR-Mtb的方法。

6.4 蛋白組學(xué)技術(shù)

運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找Mtb潛伏感染蛋白標(biāo)志物，對(duì)獲得的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括GO分析、KEGG通路分析和BiNGO富集分析，以期這些標(biāo)志物有助于研究其發(fā)病機(jī)制[34]。

6.5 酸腺苷法

通過檢測(cè)含藥培養(yǎng)管中三磷酸腺苷的含量來監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長狀況，劉君等[35]發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷發(fā)光法具有簡(jiǎn)便、快速及準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，有助于MDR-Mtb患者的早期診斷和耐藥Mtb流行的控制，適合實(shí)驗(yàn)室開展。

6.6 基因組測(cè)序分析

以單核苷酸多態(tài)性構(gòu)建發(fā)育樹鑒定菌株型別和非相關(guān)型別，定位單核苷酸多態(tài)性所在的基因組區(qū)域，對(duì)型別相關(guān)的突變基因進(jìn)行KEGG通路的富集分析，對(duì)非型別相關(guān)的突變基因和間隔區(qū)判斷是否耐藥相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，解釋發(fā)生耐多藥和泛耐藥的基因組突變機(jī)制[36-37]。

6.7 床旁檢測(cè)

基于脂阿拉伯甘露聚糖的LF-LAM快速檢測(cè)策略推薦適應(yīng)征為考慮合并結(jié)核感染且CD4+≤50/μL的HIV陽性患者[38]。最近興起的芯片核酸擴(kuò)增(NAAT)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、BlaC熒光探針、免疫熒光微傳感器、便捷式核磁共振細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)等，研究人員嘗試篩選出MDR-Mtb標(biāo)志物，以利于減少檢測(cè)的成本且增加其臨床實(shí)用性。

7 展 望

耐藥Mtb的防治已是我國TB防治的重中之重，MDR/XDR-Mtb的出現(xiàn)和蔓延形勢(shì)嚴(yán)峻，且至今仍未得到有效控制。

面對(duì)挑戰(zhàn)，首先應(yīng)嚴(yán)格按“早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、全程”原則執(zhí)行TB治療方案，從源頭減少耐藥Mtb的產(chǎn)生。其次，應(yīng)加大力度扶持推進(jìn)快速病原學(xué)診斷、耐藥檢測(cè)技術(shù)及新型抗Mtb藥物的開發(fā)應(yīng)用推廣，注重加強(qiáng)MDR/XDR-Mtb的初步篩查，降低漏檢率。充分運(yùn)用現(xiàn)有的抗Mtb藥物，優(yōu)化二線藥物的藥代/效動(dòng)力學(xué)、實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，深度挖掘包括外排泵抑制劑在內(nèi)的增敏劑以加強(qiáng)常規(guī)及新型抗Mtb藥物效能。此外，加大對(duì)耐藥Mtb的播散途徑及預(yù)防策略的研究力度也有著重要意義。同時(shí)耐藥菌株的分子特征，以及患者免疫狀態(tài)和基因敏感性分析也將成為研究重點(diǎn)，為耐藥Mtb靶向治療提供依據(jù)。

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