羊布魯氏菌病4種血清學(xué)檢測方法的臨床應(yīng)用比較

藺旭光，史量全，李佳怡，郭雙，張榮榮，白皓丞，李天旭，劉鍇

1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 通遼市園林管理局，內(nèi)蒙古 通遼 028000

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患病，該病不僅造成飼養(yǎng)動物發(fā)病，如牛、豬、羊，還會感染水牛、麋鹿等野生動物發(fā)病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。該菌為革蘭陰性桿菌，多為光滑型菌株，兼性細(xì)胞內(nèi)寄生[2]?；疾游锟赏ㄟ^血液、空氣等傳播途徑感染人發(fā)病，多數(shù)患病癥狀為全身酸痛無力、發(fā)燒，嚴(yán)重者還會導(dǎo)致不育，且治愈性較小，患病者終身攜帶。目前還沒有人用布魯氏菌病的特效疫苗，但已經(jīng)有動物用疫苗且有良好的預(yù)防效果，如牛用S2和RB51，羊用M5，豬用S2等。動物感染布魯氏菌病會導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及木乃伊胎，公畜睪丸和附睪增大影響繁殖。流產(chǎn)的胎兒、胎衣和臍帶等含有大量的致病菌，如不及時消毒處理，會造成同群動物感染。已鑒定出6種對陸生動物致病的布魯氏菌，分別為B.melitensis、B.suis、B.abortus、B.canis、B.neotomae、B.ovis[3]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將布魯氏菌病劃分為B類動物檢疫病。目前布魯氏菌病還沒有得到良好的控制，近些年來內(nèi)蒙古許多地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)布魯氏菌病發(fā)病率較高且有上升的趨勢，給公共安全衛(wèi)生帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。早期的檢測預(yù)防是布魯氏菌病較為有效的控制方法。關(guān)于布魯氏菌病檢測的常規(guī)方法主要有試管凝集試驗(SAT)、玫瑰紅染色試驗(RBT)、虎紅平板凝集試驗(RBT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、補體結(jié)合試驗(CFT)、膠體金免疫層析法等。分子生物學(xué)方法包括PCR、多重PCR、毒力基因PCR檢測及16S rRNA基因測序[4]。日常布魯氏菌病檢測多通過兩種以上的方法確診。

熒光偏振分析(FPA)檢測動物布魯氏菌病是OIE指定檢測方法之一，Nielsen等[5]提出通過布魯氏菌OPS基因作為抗原標(biāo)記異硫氰酸熒光素檢測布魯氏菌病感染血清，首次建立布魯氏菌病FPA檢測方法。FPA操作方法簡單，儀器攜帶方便，成本較低，更適合田間操作[6]。本試驗采用FPA法、SAT法、RBT法及IELISA法對內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的2 727份羊樣本血清進行布魯氏菌病檢測，并比較檢測結(jié)果，對內(nèi)蒙古地區(qū)羊布魯氏菌病進行流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1羊血清樣本的處理 內(nèi)蒙古自治區(qū)各集約化養(yǎng)殖場及散戶養(yǎng)殖場隨機挑選采集羊血樣本共2 727份，每份羊血取1 mL置于離心機中3 000 rmp 10 min，棄沉淀取上清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑 布魯氏菌熒光偏振測定法抗體檢測試劑盒(哈爾濱平和生物技術(shù)有限公司)、間接ELISA試劑盒(IDEXX)、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所)。

1.3儀器 FLUPO熒光偏振檢測儀(Explorer Cases)、Bio-Rad酶標(biāo)儀、振蕩器、高速低溫離心機(Eppendorf)。

1.4方法

1.4.1IELISA 檢測 參照IDEXX Brucellosis Antibody Test Kit 說明書進行操作。SAT法和RBT法按照產(chǎn)品說明書操做。確定熒光偏振儀器檢測羊布魯氏菌病血清陽性的臨界值為75，高于判定為陽性，低于判定為陰性。試驗結(jié)果采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.4.2FPA檢測 先對熒光偏振儀進行環(huán)境(包括溫度、濕度)的矯正。儀器矯正完畢后再做試劑盒內(nèi)陰性及陽性血清為對照。將2 727份血清每100份分為一組，共28組。每份血清取10 μL置于硼硅玻璃試管內(nèi)，并與1 000 μL緩沖液震蕩混合均勻后，將試管置于熒光偏振儀上，按順序讀取血清與緩沖液的初始Blank int.值。再將每個試管內(nèi)加入10 μL布魯氏菌標(biāo)記抗原，震蕩混勻后室溫下孵育2 min，將試管再次置于熒光偏振儀上按照順序讀取sample int.值，顯示sample mp值為最終檢測值。

2 結(jié) 果

2.1不同方法檢測羊血清的試驗結(jié)果 IELISA、SAT、RBT及FPA四種方法分別對內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的羊血清進行檢測，其檢測的陽性率分別為7.59%、6.31%、6.20%及7.45%。IELISA與FPA檢測的結(jié)果通過單因素ANOVA分析，P=0.226>0.05，說明兩種方法對羊布魯氏桿菌檢測差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。SAT與RBT的陽性檢出數(shù)相近，通過單因素ANOVA分析，P=0.319>0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。IELISA分別與SAT、RBT的檢測結(jié)果通過單因素ANOVA分析，t值分別為1.270和1.383，且P<0.05得出IELISA與SAT、RBT差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同理FPA與SAT、RBT的t值分別為1.13和1.24，P<0.05。由此可見IELISA與FPA的樣品陽性檢出率總體比SAT和RBT高。

2.2FPA法檢測散戶與集約化養(yǎng)殖場的陽性率對比 FPA法檢測的2 727份血清樣本中，集約化養(yǎng)殖場血清樣本數(shù)為1 165，散戶樣本數(shù)為1 562份。其中集約化養(yǎng)殖檢出陽性樣本數(shù)56份，所占比例為4.80%；散戶檢出陽性樣本數(shù)為147份，所占比例為9.41%。集約化養(yǎng)殖場的陽性檢出率比散戶低。

3 討 論

3.1內(nèi)蒙古自治區(qū)羊布魯氏菌病檢出率及預(yù)防措施 養(yǎng)殖業(yè)是內(nèi)蒙古自治區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，布魯氏菌病的存在和流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展和人們?nèi)罕姷纳眢w健康。近些年來各個國家的發(fā)病率也在增長[7]。本試驗在內(nèi)蒙古自治區(qū)隨機采集的2 727份血清樣本中，散戶養(yǎng)殖發(fā)病率為9.41%，比集約化養(yǎng)殖場發(fā)病率高出近兩倍，可見集約化養(yǎng)殖場檢疫和防控的要求比散戶養(yǎng)殖嚴(yán)格。在養(yǎng)殖的日常維護中，保持舍內(nèi)衛(wèi)生，做好通風(fēng)消毒工作，定期給羊注射疫苗，如三聯(lián)四防等，定期做布魯氏菌病檢測工作，并及時淘汰撲殺患布魯氏菌病的羊，尸體要經(jīng)過嚴(yán)格的處理，防止羊群再次感染。工作人員及飼養(yǎng)人員也要做好自我防護工作，定期檢查身體，避免感染。

3.2FPA法與其他檢查方法的比較 布魯氏菌病的準(zhǔn)確、快速檢測是預(yù)防和控制該病的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法存在漏檢的弊端，有人為因素存在，且特異性與敏感性也不高，會不同程度影響診斷結(jié)果。目前國外多以FPA法和IELISA法對布魯氏菌進行檢測，且FPA法是OIE重要指定檢測方法之一。FPA法與IELISA的生物學(xué)反應(yīng)原理相似，IELISA的特異性與敏感性與FPA相近[8]。FPA法與IELISA法檢測2 727份血清結(jié)果的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。IELISA法雖有高敏感性高通量的優(yōu)點，但不能區(qū)分檢測疫苗抗體和野毒株抗體，且IELISA操作較為復(fù)雜，需要孵育等環(huán)節(jié)，耗時較長[9]。SAT及RBT法的特異性及敏感性遠(yuǎn)不如IELISA及FPA，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。SAT法主要檢測抗體IgM，在檢測時易被交叉反應(yīng)干擾，RBT法易受到時間、溫度及人為主觀因素的影響，所以在檢測時不準(zhǔn)確易誤診。分子生物學(xué)PCR檢測耗時較長，需要培養(yǎng)布魯氏菌后提取核酸，對實驗室要求較高，該過程耗時長容易感染操作人員，不適合大樣本檢測。

3.3FPA法的優(yōu)勢及展望 FPA法能區(qū)分疫苗抗體、野毒株抗體，操作簡單，方便，攜帶方便，耗時短，成本低，檢測迅速，避免二次抓捕，適合大樣本檢測及田間檢測等。通過調(diào)整FPA的閾值可以對不同動物進行檢測，是布魯氏菌病較為理想的檢測方法。雖然FPA方法在檢測中有很高的特異性及敏感性，但也不排除該方法有假陽性、假陰性的存在，所以在診斷時需要配合兩種以上的檢測方法確認(rèn)。未來隨著FPA法便捷性的提高、檢測費用的降低，該檢測方法有望成為檢測人員首選的檢測方法。

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