IL-38通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路抑制骨質(zhì)疏松的機制研究

劉珍星 張山鋒 楊鐘華

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢普愛醫(yī)院骨科，武漢 430034)

骨質(zhì)疏松是一種常見的骨科疾病，以骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、伴隨骨脆性增加、易發(fā)生骨折為主要特征的全身性代謝性骨病[1]。在成年脊椎動物的骨重建過程中，成骨細胞調(diào)控的骨形成和破骨細胞調(diào)控的骨吸收兩個過程持續(xù)不斷地交替發(fā)生，使得骨骼不斷更新，從而維持骨代謝穩(wěn)態(tài)，骨質(zhì)疏松患者的這種穩(wěn)態(tài)被破壞是導致發(fā)病的主要原因[2]。研究表明，骨質(zhì)疏松患者的骨髓基質(zhì)細胞增殖能力及分化成骨細胞的能力顯著降低[1,3]。PI3K/Akt信號通路作為調(diào)控成骨細胞和破骨細胞功能的信號通路網(wǎng)絡(luò)的中心，在正常生理刺激和病理狀態(tài)下對維持骨組織動態(tài)平衡具有重要作用[4]。PI3K/Akt信號通路對于破骨細胞的存活是至關(guān)重要的，而PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路在RANKL引起的破骨細胞形成和分化過程中扮演著非常重要的角色[4,5]。IL-38作為新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，其生物學功能尚未十分明確[6]。IL-38是IL-36的部分受體拮抗劑，它可作為IL-36的特異性受體[6]。IL-38可抑制Th17細胞產(chǎn)生IL-17和IL-22等炎癥介質(zhì)，也可抑制IL-36γ誘導產(chǎn)生IL-8，發(fā)揮抑制炎癥反應的作用[6,7]。本次研究探討骨質(zhì)疏松患者血清中IL-38的表達水平，同時通過骨質(zhì)疏松小鼠模型，探討IL-38抑制骨質(zhì)疏松的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 共納入2014年6月～2016年12月我院收治的138例骨質(zhì)疏松患者作為研究對象；所有患者中男性33例，女性105例；患者年齡55～72歲，平均(60.8±11.3)歲。另選取120例同期在我院骨科進行骨折手術(shù)的無骨質(zhì)疏松患者作為對照；對照組患者中男性27例，女性93例；患者年齡55～78歲，平均(58.7±18.3)歲。納入研究組的所有患者均符合骨質(zhì)疏松的診斷標準，即出現(xiàn)周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統(tǒng)受損等臨床表現(xiàn)；骨密度檢查顯示骨量降低骨峰值的2倍標準差(-2.0SD)，或下降25%。排除長期營養(yǎng)不良及低鈣飲食患者；排除長期臥床患者；排除伴有全身其他器官器質(zhì)性疾病患者；排除惡性腫瘤患者；排除近期及長期服用影響骨代謝藥物患者；排除并發(fā)其他代謝性疾病患者。納入研究的所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 主要試劑包括人IL-38 ELISA試劑盒(美國R&D Systems)，ALP檢測試劑盒(美國貝克曼公司)，p-PI3K、PI3K、p-NFATc1、NFATc1抗體(美國Abcam公司)，p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β抗體(美國Santa Cruz公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher)，CCK-8檢測試劑盒、SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。野生型與IL-38轉(zhuǎn)基因小鼠購自武漢大學實驗動物中心，MC3T3-E1細胞購自美國ATCC公司。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、Tecan酶標儀、流式細胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1小鼠模型 野生型與IL-38轉(zhuǎn)基因雌性小鼠各30只，使用前用鼠尾鑒定確認小鼠的基因類型。將各組小鼠隨機分為VOX組與Sham組，每組15只。術(shù)后8周分離各組小鼠的血清，測定血清鈣、磷及ALP水平；取各組小鼠的雙側(cè)股骨與脊柱，病理切片分析股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，骨密度儀檢測脊柱骨密度變化。

1.2.2BMSCs的體外培養(yǎng)與檢測 采用全骨髓法培養(yǎng)BMSCs[8]。分離細胞，置于37℃，0.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔3 d換液一次。當原代細胞集落處細胞密度達到密集狀態(tài)時，用0.25%的胰酶進行消化傳代。取各組第3代BMSCs，計數(shù)后調(diào)整濃度至4×104個/ml，培養(yǎng)基調(diào)整為1%FBS，鋪96孔板，每孔200 μl。每組細胞均設(shè)復孔，接種后第0～6天用CCK-8法檢測各組細胞450 nm波長處的吸光值，每次檢測3個復孔。另取各組第3代BMSCs，提取總蛋白，用Western blot檢測PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平變化。

1.2.3質(zhì)粒構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建pCMV-IL-38及pCMV-GFP質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000將構(gòu)建好的IL-38質(zhì)粒及GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細胞，轉(zhuǎn)染48 h后用流式細胞術(shù)檢測MC3T3-E1細胞的凋亡，Western blot檢測PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平變化。

2 結(jié)果

2.1患者的基本信息及血清IL-38水平 患者的基本信息與血清IL-38水平如表1所示。骨質(zhì)疏松患者(研究組)與對照組相比，性別、年齡等基本信息差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ELISA結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松患者血清IL-38濃度顯著低于對照組(P<0.001)。

表1患者基本信息及血清IL-38水平對比

Tab.1ComparisonofbasicdataandserumIL-38levelbetweendifferentgroups

ItemResearchgroup(n=138)Controlgroup(n=120)t/χ2valuePvalueAge(years)60 8±11 358 7±18 31 120 26Male[n(%)]33(23 9)27(22 5)0 070 79SerumIL?38(pg/ml)13 1±11 086 5±13 747 0<0 001

2.2骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立 術(shù)后8周野生型與IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠的血鈣和血磷水平均顯著高于Sham組(P<0.05)，ALP水平顯著低于Sham組(P<0.05)。另外，IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠的血鈣和血磷水平均顯著低于野生型OVX小鼠(P<0.05)，ALP則顯著高于野生型OVX小鼠(P<0.05)，見表2。小鼠的股骨病理切片及脊柱骨密度結(jié)果如圖1所示，野生型與IL-38轉(zhuǎn)基因小鼠OVX組均出現(xiàn)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞和骨密度下降，并且IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞和骨密度下降情況均較野生型OVX小鼠顯著減輕(P<0.05)。

2.3BMSCs的增殖及PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平檢測 細胞增殖檢測顯示IL-38轉(zhuǎn)基因小鼠OVX 組BMSCs的體外增殖能力顯著高于Sham組和野生型小鼠OVX組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，IL-38轉(zhuǎn)基因小鼠OVX組BMSCs細胞的PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著低于野生型OVX組(P<0.05)，GSK3β磷酸化水平顯著高于野生型OVX組(P<0.05)，見圖2。

2.4IL-38對MC3T3-E1的影響 如圖3所示，轉(zhuǎn)染IL-38后MC3T3-E1細胞的增殖能力顯著提高(P<0.05)；細胞凋亡顯著減少(P<0.05)；PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)；GSK3β磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。

表2小鼠模型血清學指標(n=15)

Tab.2Serologicaldetectionofmicemodel(n=15)

GroupBloodcalcium(mol/L)Bloodphosphorus(mol/L)ALP(U/L)WildtypeShamgroup2 09±0 052 81±0 1771 33±10 24WildtypeOVXgroup2 44±0 031)3 47±0 181)36 81±9 131)IL?38transgeneShamgroup2 07±0 032 88±0 1677 48±13 92IL?38transgeneOVXgroup2 26±0 021)2)3 01±0 171)2)47 11±7 271)2)

Note：1)Compared with Sham group，P<0.05；2)Compared with OVX group，P<0.05.

圖1 小鼠股骨病理切片及脊柱骨密度比較Fig.1 Comparison of pathological sections of femur and spine bone densityNote: **.P<0.01.

圖2 BMSCs的增殖及PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平比較Fig.2 Comparison of proliferation,phosphorylation level of PI3K,Akt,GSK3β and NFATc1 of BMSCsNote: **.P<0.01.

圖3 IL-38對小鼠成骨細胞MC3T3-E1的影響Fig.3 Influence of IL-38 on MC3T3-E1Note: **.P<0.01.

3 討論

骨質(zhì)疏松的主要特征為骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折等[1]。在成年脊椎動物的骨代謝過程中，骨形成和骨吸收是影響重建的一對最重要耦聯(lián)動態(tài)因素，兩個過程持續(xù)不斷地交替發(fā)生，使得骨骼不斷更新，從而維持骨代謝穩(wěn)態(tài)，因此這兩種細胞功能異常在骨質(zhì)疏松發(fā)病機理中扮演著重要角色[2]。一旦平衡被打破，骨吸收量超過形成量，則會發(fā)生骨質(zhì)疏松，即發(fā)生病理性重塑，骨組織微形態(tài)結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變[9]。本次研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組患者的血清IL-38水平顯著低于對照組，提示IL-38的缺失可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中扮演一定的角色。IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞和骨密度下降情況均較野生型OVX小鼠顯著減輕；體外培養(yǎng)的IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠BMSCs的增殖能力顯著高于野生型OVX組；轉(zhuǎn)染IL-38后MC3T3-E1細胞凋亡顯著減少。這些結(jié)果都說明IL-38可能在骨質(zhì)疏松小鼠模型的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

IL-38是IL-1家族的第10個成員，又被稱為IL-1F10，人的IL-38基因位于2號染色體2q13-14.1[6,7]。IL-38的一般特性與IL-1所有成員接近，廣泛表達于免疫組織(如脾、胸腺、扁桃體等)中，在皮膚和扁桃體B細胞中的表達尤為明顯，在心臟、胎盤等無免疫功能的組織中則表達不高[7,10]。IL-1家族細胞因子廣泛存在于炎性細胞內(nèi)，對調(diào)節(jié)所有真核生物的健康與疾病起著不可或缺的作用[11]。Ven de Veerdonk等[6]證明IL-38能與IL-36R特異性結(jié)合，高濃度IL-38比相同濃度的IL-36Ra與IL-36R的結(jié)合能力更強。IL-38與IL-36受體結(jié)合對免疫細胞產(chǎn)生的生物學作用與IL-36Ra和IL-36R受體結(jié)合對免疫細胞產(chǎn)生的生物學作用相似，推測IL-38也可能通過抑制IL-36(α、β、γ)與IL-36R的結(jié)合而發(fā)揮抗炎作用[6]。

PI3K/Akt信號通路是細胞增殖、轉(zhuǎn)移、黏附和死亡過程的重要調(diào)節(jié)者[4]。在正常生理條件下，PI3K/Akt信號通路可選擇性的影響成骨細胞和破骨細胞的生理功能，對維持骨組織動態(tài)平衡具有重要作用[4,5]。此外，PI3K/Akt信號通路對破骨細胞的存活也是至關(guān)重要的[12]。以PI3K/Akt為靶點有可能成為研究開發(fā)治療骨質(zhì)疏松癥的新途徑。破骨細胞的形成過程需要兩個關(guān)鍵性因子：RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)[13]。RANKL屬腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，能誘導破骨形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB、c-Fos等)的轉(zhuǎn)錄，是破骨細胞形成的主要調(diào)節(jié)者[14]。PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路在RANKL引起的破骨細胞形成和分化過程中扮演著非常重要的角色。本次研究結(jié)果顯示，IL-38轉(zhuǎn)基因OVX小鼠BMSCs的PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著低于野生型OVX組，GSK3β磷酸化水平顯著高于野生型OVX組。MC3T3-E1細胞轉(zhuǎn)染IL-38后PI3K、Akt與NFATc1的磷酸化水平均顯著降低，GSK3β的磷酸化水平顯著升高。因此，對PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路的調(diào)控可能是IL-38抑制骨質(zhì)疏松的一種潛在機制。

綜上所述，骨質(zhì)疏松患者的血清IL-38水平顯著降低，IL-38可能通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路促進BMSCs的增殖、抑制成骨細胞的凋亡，從而發(fā)揮抑制骨質(zhì)疏松的作用。

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