IL-35在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織的表達(dá)與意義①

李 軍 陳力學(xué) 沈 晹 劉 歡 黃江菊

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400016)

慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis，CRS)是一種較為高發(fā)的局部慢性炎癥性疾病，據(jù)報(bào)道全球的患病率約5%～12%[1]，而我國略低約為2%～8%[2]，其治療方案主要是常規(guī)藥物加鼻內(nèi)鏡手術(shù)的綜合治療方式。當(dāng)前CRS基于鼻息肉的存在或不存在，臨床分為兩種亞型，各自具有典型的組織重塑特點(diǎn)及炎癥模式[1]。其中慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)臨床癥狀評分高且有更多的鼻部癥狀，復(fù)發(fā)率居高不下，成為耳鼻咽喉頭頸外科難治性疾病。但是對CRSwNP的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，仍有待更深一步的研究。

IL-35擁有IL-12家族較為典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是最新識(shí)別的家族成員，在T細(xì)胞活化、增殖及釋放細(xì)胞因子等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[3,4]。IL-35作為一種新型抑制性細(xì)胞因子，在多種疾病表達(dá)中均有顯著性改變，并參與了這些疾病的發(fā)生發(fā)展，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、病毒性乙型肝炎、哮喘和變應(yīng)性鼻炎等[5-10]。此外IL-35表達(dá)水平降低已被證實(shí)與呼吸道炎癥的發(fā)展有關(guān)[11,12]。而CRSwNP是鼻腔和鼻竇黏膜慢性炎癥性疾病，所以考慮IL-35與CRSwNP發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其免疫調(diào)節(jié)作用仍有待研究。因此，本研究中我們擬對CRSwNP患者的臨床手術(shù)標(biāo)本應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)等檢測技術(shù)，初步觀察IL-35在鼻息肉組織中的表達(dá)情況，為分析其在鼻息肉組織產(chǎn)生過程中發(fā)揮的作用提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對象和標(biāo)本 隨機(jī)選取2016年5月～2017 年4月在我科住院CRSwNP患者(診斷符合EPOS2012標(biāo)準(zhǔn))共51 例(CRSwNP組)，手術(shù)前均需電子鼻咽喉鏡及鼻竇 CT 檢查。統(tǒng)計(jì)國際上廣泛認(rèn)可的患者癥狀VAS 評分、電子鼻咽喉鏡檢查的Lanza-Kennedy評分及鼻竇CT檢查Lund-Mackay評分，并在術(shù)中留取部分鼻息肉組織。另選取10例同期因單純鼻中隔偏曲行手術(shù)治療患者的正常下鼻甲黏膜組織作為對照組。以上選取的患者均排除肝炎、結(jié)核等感染性疾病，且術(shù)前4周之內(nèi)均未使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素以及各類鼻局部噴劑。兩組對象臨床基本特點(diǎn)見表1。

1.2方法

1.2.1鼻息肉組織中總 RNA 的提取 采用Trizol法提取鼻息肉組織總RNA，具體步驟如下：(1)取100 mg鼻息肉組織于1 ml Trizol 中組織勻漿，立即靜置于冰上5 min后離心10 min(12 000 r/min,4℃)。(2)吸取上清液，加入氯仿200 μl，混勻，室溫靜置5 min后離心10 min(12 000 r/min,4℃)。(3)吸取上清液，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置15 min后離心15 min(12 000 r/min,4℃)。(4)棄上清液，加入75%的乙醇1 ml，漂洗沉淀后離心5 min(7 500 r/min,4℃)。(5)棄上清液，室溫干燥10 min，加DEPC水溶解RNA，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2IL-35 mRNA擴(kuò)增檢測 (1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:將模板RNA、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒內(nèi)的試劑解凍(TaKaRa公司產(chǎn)品)，并在使用前混勻；在200 μl EP管中加入：Oligo dT Primer終濃度為2.5 μmol/L，模板RNA 500 ng,5×PrimeScript Buffer含dNTP Mixture和 Mg2+，用無RNase的ddH2O補(bǔ)至最終體積為20 μl；輕輕混勻 37℃孵育15 min；65℃加熱10 min，逆轉(zhuǎn)錄完成，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?2)引物合成：由于IL-35的基因組成為EBI3及IL-12A，因此在Genbank查找人類EBI3 mRNA、IL-12A mRNA序列，引物的設(shè)計(jì)和檢測采用Primer 5.0軟件，以β-actin作為內(nèi)參。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并標(biāo)記熒光，引物名稱、序列及擴(kuò)增片段大小見表2。(3)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板1 μl,上游引物終濃度為0.5 μmol/L，下游引物終濃度為0.5 μmol/L，SYBR Green Mix 10 μl，用無RNase的ddH2O補(bǔ)至最終體積為20 μl； PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39個(gè)循環(huán)。

1.2.3ELISA 檢測鼻息肉組織中IL-35、IL-10和 IL-17蛋白的表達(dá) 取100 mg鼻息肉組織加入1 ml PBS緩沖液，并剪碎。置于冰浴中，用玻璃勻漿器碾碎后，將離心機(jī)設(shè)定為4℃，3 000 r/min，將其離心15 min，吸取上清液。采用ELISA法分別測定IL-35、IL-10和 IL-17水平(試劑盒為中國ColorfulGene公司產(chǎn)品)，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

表1對照組和CRSwNP組患者的臨床特點(diǎn)

Tab.1ClinicalcharacteristicsbetweencontrolgroupandCRSwNPgroup

IndexControlCRSwNPCase1051Age1)36 9±9 143 3±15 1Sex1)6M/4F30M/21FVASscore05 5±1 7Lund?Mackayscore011 7±3 8Lanza?Kennedyscore06 4±2 0

Note：Vs control group，1)P>0.05.

表2IL-35mRNA擴(kuò)增所需的引物序列

Tab.2IL-35mRNAamplificationrequiredforprimersequences

PrimersSequencesbpEBI3forward5?ACATCATCAAGCCCGACC?3144EBI3reverse5?CCTGACGCTTGTAACGGA?3IL?12Aforward5?TTGTGGCTACCCTGGTCCTC?3105IL?12Areverse5?GGTTTTGGGAGTGGTGAAGG?3β?Actinforward5?ACACTGTGCCCATCTACG?3153β?Actinreverse5?TGTCACGCACGATTTCC?3

2 結(jié)果

2.1鼻息肉組織中IL-35 mRNA的檢測 采用Real-time PCR技術(shù)，檢測EBI3 mRNA和IL-12A mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，較正常下鼻甲黏膜組織中表達(dá)相比，鼻息肉組織中EBI3 mRNA呈低表達(dá)水平(圖1A)P<0.05；而鼻息肉組織中IL-12A mRNA也呈低表達(dá)水平(圖1B)，P<0.05。

2.2CRSwNP患者鼻息肉組織中IL-35、IL-10和IL-17水平的ELISA檢測 采用 ELISA 方法檢測鼻息肉組織中IL-35、IL-17 和IL-10表達(dá)，結(jié)果見圖2。與正常下鼻甲黏膜組織中的表達(dá)相比，鼻息肉組織中IL-35表達(dá)略有降低(圖2A)，P<0.05；而IL-17 和IL-10表達(dá)顯著增高(圖2B、C)，P<0.05。

圖1 IL-35在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組織中的mRNA表達(dá)Fig.1 mRNA expression of IL-35 in normal nasal mucosa and chronic rhinosinusitis with nasal polypsNote: Vs control group，*.P<0.05.

圖2 IL-35，IL-17和IL-10在正常鼻黏膜組織和鼻息肉組織中的蛋白濃度Fig.2 Concentrate of IL-35,IL-17 and IL-10 in normal nasal mucosa and chronic rhinosinusitis with nasal polyps were detected by ELISANote: Vs control group，*.P<0.05.

3 討論

鼻息肉組織是鼻腔和鼻竇黏膜過度水腫繼而突出的炎性組織，常見于中鼻道和鼻竇黏膜。CRSwNP屬于慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重影響患者日常的生活質(zhì)量[13]。患者的癥狀VAS 評分、電子鼻咽喉鏡檢查的Lanza-Kennedy評分及鼻竇CT檢查Lund-Mackay評分是診斷CRSwNP的三個(gè)重要依據(jù)，可綜合客觀的評估疾病嚴(yán)重程度、病變的性質(zhì)和累及范圍，最終決定治療方案。鼻內(nèi)鏡手術(shù)可顯著改善大多數(shù)的CRSwNP患者鼻部癥狀VAS 評分，但有一部分患者術(shù)后息肉復(fù)發(fā)，且隨著術(shù)后時(shí)間的延長，復(fù)發(fā)患者也逐漸增多。一般而言，大約有15%～20%的患者需要接受再手術(shù)治療[14]。所以，研究CRSwNP的發(fā)病機(jī)制仍是提高防治效果的關(guān)鍵。目前對CRSwNP的研究主要集中在鼻腔解剖結(jié)構(gòu)異常、炎癥的持續(xù)性刺激以及鼻腔黏膜的應(yīng)激反應(yīng)等方面。目前普遍認(rèn)可的是炎癥對鼻黏膜的持續(xù)性刺激及細(xì)胞因子在鼻息肉的形成中發(fā)揮的作用。近年隨著免疫學(xué)的快速發(fā)展,細(xì)胞因子成為學(xué)者研究的主要方向,現(xiàn)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道鼻息肉組織中的多種細(xì)胞因子如IL-33、IL-9及IL-13等呈高表達(dá)。這說明,各種細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)和平衡在CRSwNP的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。如何利用免疫學(xué)前沿研究成果和臨床結(jié)合,尋找關(guān)鍵細(xì)胞因子作為特異性免疫治療的靶點(diǎn),將是研究的主要方向。但是目前仍存在較多需要繼續(xù)研究的問題。

IL-35是近期發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑制性細(xì)胞因子，由P35亞基(IL-12)和EBI3亞基(IL-27)組成，通過Treg細(xì)胞發(fā)揮的免疫抑制和調(diào)節(jié)作用[15]。IL-35主要由Treg細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可由活化的B細(xì)胞和部分活化的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌產(chǎn)生，通過激活Jak-STAT信號通路進(jìn)行信號傳導(dǎo)參與免疫調(diào)節(jié)的功能[16]。在慢性炎癥反應(yīng)階段,IL-35通過擴(kuò)增Treg細(xì)胞抑制Thl細(xì)胞增殖分化，降低自身組織炎癥損傷的程度[17]；還可以抑制Th17細(xì)胞的分化及其細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生，抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展[18]，也可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮積極的抗炎作用。這些機(jī)制說明IL-35在慢性炎癥性疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的抑制作用。T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中較為重要的組成部分，在CRSwNP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Th1和Th2與人體的免疫狀態(tài)緊密相關(guān)，而Th17和Treg對人體免疫功能也具有不可代替的調(diào)節(jié)功能，正常情況下在數(shù)量和功能方面保持相對平衡。我們早期在研究CRSwNP的患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg表達(dá)的失衡釋放各種炎癥介質(zhì)，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)及黏膜的損傷和重塑，在鼻息肉組織的形成中起著較為關(guān)鍵的作用[19]。IL-17是一種有較強(qiáng)促炎作用的細(xì)胞因子，由Th17細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生。在CRSwNP患者外周血中Th17細(xì)胞的比例增加，鼻息肉組織中IL-17和嗜酸性粒細(xì)胞均較正常下鼻甲黏膜組織呈高表達(dá)[19]。這說明IL-17不僅促進(jìn)了嗜酸性粒細(xì)胞在息肉組織中的浸潤和活化，Th17細(xì)胞還通過釋放更多數(shù)量的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，加速了鼻竇黏膜局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部組織損傷和黏膜重塑。而IL-35可明顯抑制Th17細(xì)胞的分化及其細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生，抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展[20]。另外，CRSwNP患者外周血中Treg的比例明顯低于對照組[19]。IL-35可促進(jìn)小鼠CD4+T細(xì)胞的增殖，經(jīng)體外培養(yǎng)后Treg可被最大程度的活化，其結(jié)果表明IL-35可明顯擴(kuò)增Treg的數(shù)量[17]。在小鼠或人體內(nèi)用IL-35刺激傳統(tǒng)T細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)分化成一種新型Treg細(xì)胞(iTr35)，并通過特異性分泌產(chǎn)生IL-35發(fā)揮其抑制作用；而傳統(tǒng)Treg細(xì)胞也可以通過分泌IL-35來誘導(dǎo)傳統(tǒng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閕TR35細(xì)胞，使IL-35與iTr35細(xì)胞形成正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)揮更強(qiáng)的抑制功能[21]。我們在鼻息肉組織中檢測IL-35的蛋白和IL-35 mRNA(EBI3 mRNA和IL-12A mRNA)均呈低表達(dá)水平，與正常下鼻甲黏膜組織中的表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示我們，CRSwNP患者外周血中減少的 Treg 細(xì)胞導(dǎo)致其數(shù)量和功能的不足，使細(xì)胞因子IL-35的水平隨之降低，較低水平的IL-35又影響了Treg細(xì)胞的表達(dá)和作用，最終導(dǎo)致調(diào)節(jié)功能降低，無法抑制和調(diào)節(jié)亢進(jìn)的Th17細(xì)胞的促炎作用，致使其細(xì)胞比率的失衡，從而促進(jìn)了鼻息肉組織的形成。檢測鼻息肉組織IL-35和IL-17的表達(dá)結(jié)果也印證我們的推測。這些是對Th1/Th2細(xì)胞失衡理論的重要補(bǔ)充，也是CRSwNP發(fā)生與形成的重要機(jī)制。

IL-35主要通過促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖和抑制Th17細(xì)胞的分化發(fā)揮調(diào)控作用，而rhIL-35的出現(xiàn)是否是潛在的治療靶點(diǎn)，是否可以減緩局部鼻黏膜炎癥反應(yīng)程度，降低CRSwNP患者VAS 評分、Lanza-Kennedy評分及Lund-Mackay評分，在鼻息肉組織的發(fā)生發(fā)展中起到特異性免疫治療的作用。Wang等[8]研究支氣管哮喘患者時(shí)發(fā)現(xiàn)外周靜脈血中IL-35的蛋白水平和mRNA水平均呈低表達(dá)。在體外加入的rhIL-35以劑量依賴的方式抑制了CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖。同時(shí)，Kochetkova等[20,22]對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的關(guān)節(jié)rhIL-35后可以不同程度的降低炎癥反應(yīng)，關(guān)節(jié)腫脹也不同程度得到部分減緩。這些研究也為CRSwNP的治療及預(yù)防提供新思路。在CRSwNP發(fā)生發(fā)展的過程中，各種細(xì)胞及細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)和平衡非常重要。在理想的情況下，通過抑制或阻斷其中一個(gè)通路就可調(diào)節(jié)和平衡其發(fā)生發(fā)展。然而，鼻息肉的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)和平衡的過程，rhIL-35的特異性免疫調(diào)節(jié)功能也需精準(zhǔn)化治療來實(shí)現(xiàn)，這些都仍需進(jìn)一步的研究。盡管CRSsNP已被證明主要是Th1極化的炎癥，CRSwNP的特點(diǎn)是Th2傾向嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥特征。但是，CRSwNP在不同種族、地域及環(huán)境等因素下的表現(xiàn)各異。研究顯示西方人群中Th2傾向嗜酸性炎癥占優(yōu)勢，而亞洲人群中鼻息肉表現(xiàn)Th1或Th17傾向中性粒細(xì)胞炎癥特征[23,24]。因此，不同的表型的CRSwNP可能IL-35的表達(dá)也有差異，還需擴(kuò)大樣本量、豐富檢測方法以進(jìn)一步證實(shí)。

總之，我們的研究顯示IL-35在鼻息肉組織中呈低表達(dá)水平，提示IL-35可能在CRSwNP的病理機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。IL-35在鼻息肉中的功能及作用仍需進(jìn)一步研究和探索。

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