持續(xù)偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群多樣性、揮發(fā)性脂肪酸和血清腦腸肽的影響

常雙雙 馬貴達 張敏紅 石玉祥 馮京海

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.河北工程大學農學院，邯鄲 056021)

目前，關于高溫環(huán)境對肉雞影響的研究多集中在32 ℃以上[1]，而實際生產中低于32 ℃的偏熱環(huán)境對肉雞帶來的影響也不容小覷，有研究表明偏熱環(huán)境對肉雞生理、行為、物質代謝、腸道菌群和生長性能等方面產生不利影響[2-4]。飼養(yǎng)密度同樣是家禽養(yǎng)殖行業(yè)關注的焦點，它不僅直接影響肉雞活動空間[5]，還間接影響雞舍環(huán)境溫度以及雞只生長性能、行為、盲腸菌群及福利水平等[6-8]。研究表明短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)可降低腸道pH，達到促進益生菌的生長增殖并抑制特定病原菌定植的目的[9-11]。另外有研究表明腸道菌群與腦腸肽的分泌是相互作用的[12]，如雙歧桿菌四聯(lián)活菌片可顯著升高血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)的含量，降低P物質(SP)的含量[13]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、VIP和SP等腦腸肽與胃腸活動相關[14]。但是目前針對偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群、揮發(fā)性脂肪酸以及血清腦腸肽的影響研究尚未見報道，因此本試驗旨在研究偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群、揮發(fā)性脂肪酸以及血清腦腸肽的影響，以期為肉雞科學的飼養(yǎng)管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗采用單因素設計，選取22日齡健康、體重相近愛拔益加(AA)肉雞144只，隨機分成3個組，每組6個重復，每個重復單籠飼養(yǎng)。將3個組的肉雞轉入環(huán)境溫度為21 ℃、相對濕度為60%的環(huán)境控制艙適應7 d。29日齡時開始正式試驗，單個雞籠飼養(yǎng)面積為0.64 m2，飼養(yǎng)密度分別設置為每籠6只(公母各占1/2，Ⅰ組)、每籠8只(公母各占1/2，Ⅱ組)和每籠10只(公母各占1/2，Ⅲ組)，環(huán)境溫度為31 ℃，相對濕度為60%，試驗條件維持至試驗結束，共計14 d。試驗在動物營養(yǎng)學國家重點實驗室環(huán)境控制艙內進行，溫度、相對濕度自動控制(精度分別為±1 ℃和±7%)，無風，24 h光照。

1.2 試驗飼糧

采用玉米-豆粕型飼糧，所用飼糧為參照NRC(1994)營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼糧，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗肉雞均采用單層平養(yǎng)，所選用籠具為本實驗室研發(fā)的單層平養(yǎng)籠具[15]，自由采食與飲水，常規(guī)免疫。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血液采集與指標測定

分別于試驗第7天、第14天，每組隨機選取6只肉雞(公母各占1/2，每個重復1只肉雞)，肉雞采用靜脈采血，靜置2 h后，3 000 r/min低溫離心10 min吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存。

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定血清中5-HT、VIP和SP的含量。

1.4.2 盲腸內容物的采集與指標測定

1.4.2.1 盲腸內容物的采集

分別于試驗第7天、第14天，每組隨機選取6只肉雞(公母各占1/2，每個重復1只肉雞)剪斷頸靜脈處死，全身消毒后剖開腹腔，分離腸道，結扎回盲交界處，剪下盲腸迅速移至超凈工作臺，用無菌剪刀剪開腸壁，收集盲腸內容物，將同一組的6個樣品迅速混勻(用于揮發(fā)性脂肪酸測定的無需混勻)，裝置于無菌離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet:VA 10 000 IU,VD33 400 IU，VE 16 IU，VK32.0 mg，VB12.0 mg，VB26.4 mg，VB62.0 mg，VB120.012 mg，泛酸鈣 pantothenic acid calcium 10 mg，煙酸 nicotinic acid 26 mg，葉酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 0.1 mg，膽堿 choline 500 mg，Zn (ZnSO4·7H2O) 40 mg，F(xiàn)e (FeSO4·7H2O) 80 mg,Cu (CuSO4·5H2O) 8 mg,Mn (MnSO4·H2O) 80 mg，I (KI) 0.35 mg，Se (Na2SeO3) 0.15 mg。

2)計算值 Calculated values。

1.4.2.2 揮發(fā)性脂肪酸含量測定

稱取2 g左右盲腸食糜置于離心管中，然后準確加入5 mL超純水，旋渦振蕩3～5 min，5 000×g離心10 min；取上清液1 mL置于塑料安培管中，加入0.2 mL的25%偏磷酸溶液，蓋緊蓋子，振蕩搖勻，并置冰水浴中30 min；10 000×g離心10 min，取上清液，上機測定盲腸內容物中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.4.2.3 DNA的提取

采用Fast DNATMSPIN Kit For Soil提取樣品基因組DNA。

1.4.2.4 細菌16S rDNA片段的PCR擴增

以樣品基因組DNA為模板，采用細菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列，引物信息見表2。

表2 引物信息

PCR擴增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.2 μL；ExTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 μmol/L)1 μL；518R(20 μmol/L)1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.4.2.5 PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的產物進行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V、60 ℃下電泳5 h。DGGE完畢后，采用銀染法染色，步驟如下：1)固定液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL，定容至500 mL)固定15 min；2)Milli-Q純水清洗20 s和2 min各1次；3)銀染液(硝酸銀1 g、37%甲醛0.75 mL，定容至500 mL)染色15 min；4)Milli-Q純水清洗20 s和2 min各1次；5)顯色液(氫氧化鈉7.5 g、37%甲醛2.5 mL，定容至500 mL)顯色5～7 min；6)最后用終止液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL，定容至500 mL)終止反應。

1.4.2.6 DGGE圖譜中優(yōu)勢電泳條帶的序列測定

DGGE凝膠條帶回收后，以338F/518R為引物進行PCR擴增，PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上，轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆測序。測序結果與GenBank中的序列進行比對，得到條帶所代表的細菌類型。每個回收條帶選取3個克隆進行序列測定。

1.5 數據處理

試驗數據使用SAS 9.2統(tǒng)計分析軟件進行單因素分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著；采用軟件Quantity One分析DGGE圖譜多樣性。

2 結果與分析

2.1 肉雞盲腸菌群多樣性

2.1.1 肉雞盲腸菌群PCR-DGGE擴增指紋圖譜分析

由圖1和圖2可知，試驗第7天和第14天，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群條帶數產生影響，且Ⅱ組肉雞盲腸菌群條帶數高于Ⅰ組和Ⅲ組。由表3可知，同一階段，偏熱環(huán)境下不同飼養(yǎng)密度間肉雞盲腸菌群相似性指數為44.3%～61.0%，其中Ⅰ組和Ⅱ組間盲腸菌群相似性最低僅為44.3%，Ⅱ組和Ⅲ組間盲腸菌群結構相似性最高僅為61.0%，這表明偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞盲腸菌群豐富度最高，此外Ⅱ組與Ⅰ組間比Ⅲ組與Ⅰ組間盲腸菌群相似性低，即Ⅱ組與Ⅰ組間比Ⅲ組與Ⅰ組間盲腸菌群結構差異大。

2.1.2 肉雞盲腸菌群結構多樣性分析

由表4可知，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群結構多樣性產生一定的影響。試驗第7天，Ⅰ組肉雞盲腸菌群香農指數和辛普森指數分別為2.20和0.88，Ⅱ組分別為2.36和0.90，Ⅲ組分別為2.12和0.87。試驗第14天，Ⅰ組肉雞盲腸菌群香農指數和辛普森指數分別為2.59和0.92，Ⅱ組分別為2.70和0.93，Ⅲ組分別為2.57和0.92。由此可見，偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞盲腸菌群多樣性高于其他2個組。

2.1.3 肉雞盲腸特異性菌群和共性菌群分析

從肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜中分別割膠回收了1條特異性條帶和4條共性條帶，由圖1和表5可知，試驗第7天和第14天3個組肉雞盲腸內容物中均檢測出共性條帶2號菌條帶[單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis)]、3號菌條帶(Eisenbergiellamassiliensis)、4號菌條帶(Clostridiumstraminisolvens)和5號菌條帶(Ruminococcusfaecis)，僅Ⅱ組肉雞盲腸內容物中檢測出1號菌條帶[普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)]。

圖譜左側條帶編號2、5和6分別為試驗第7天Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅰ組，圖譜右側條帶編號2、5和6分別為試驗第14天Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅰ組。

The left band numbered 2, 5, 6 were groups Ⅱ, Ⅲ and Ⅰ on the 7thday of the experiment, and the right band numbered 2, 5, 6 were groups Ⅱ, Ⅲ and Ⅰ on the 14thday of the experiment, respectively.

圖1肉雞盲腸內容物菌群DGGE圖譜

Fig.1 DGGE profiles of microflora in cecal contents of broilers

圖2 3個組間盲腸菌群條帶數比較

在5個測序結果中，條帶序列大部分分布于厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，與GenBank數據庫中細菌的相似度均在92%以上。

2.2 肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量

由表6可知，試驗第7天和第14天，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)含量的影響無顯著差異(P>0.05)。

2.3 肉雞血清腦腸肽含量

由表7可知，試驗第7天，偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞血清5-HT含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，而偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞血清VIP和SP含量的影響無顯著差異(P>0.05)；試驗第14天，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞血清5-HT、VIP和SP含量的影響無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸菌群多樣性的影響

腸道菌群是肉雞體內環(huán)境中不可缺少的組成部分，在平衡狀態(tài)時，對其宿主是有益無害的[16]。而家禽在生長發(fā)育過程中，環(huán)境應激可改變家禽腸道菌群結構[17]。研究報道，持續(xù)偏熱環(huán)境(26和31 ℃)下肉雞盲腸細菌條帶數和菌群多樣性下降[4]；在3周齡時飼養(yǎng)密度顯著影響肉雞消化道菌群變化，變化最顯著的是嗉囊和盲腸菌群(相似性分析的R值分別為0.77和0.69，P≤0.05)；6周齡時飼養(yǎng)密度對嗉囊和盲腸菌群的影響存在顯著差異(相似性分析的R值分別為0.52和0.27，P≤0.05)[18]。本試驗研究表明偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞盲腸菌群豐富度和相似性高于其他2個組，進而說明偏熱環(huán)境下0.64 m2飼養(yǎng)8只雞的飼養(yǎng)密度有利于肉雞盲腸菌群的生長。

研究表明，肉雞盲腸內主要以厚壁菌門為主，其次為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門[19-20]。隨著飼養(yǎng)密度增加，即飼養(yǎng)密度高于450 cm2/只時，籠養(yǎng)蛋雞十二指腸中有益菌(Lactobacillusgastricus和Lactobacillusalvi)消失，并對腸道菌群平衡產生不利影響[21]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ組肉雞盲腸中檢測出特異性菌群Bacteroidesvulgatus，而另外2個組并未發(fā)現(xiàn)。Bacteroidesvulgatus屬于擬桿菌門，擬桿菌門是腸道革蘭氏陰性菌中數量最大的一類細菌，產降解植物細胞壁的酶，參與植物細胞壁的降解，從而與腸道的消化功能有關[4]。

表3 戴斯系數比較PCR-DGGE圖譜的相似性

表4 肉雞盲腸菌群結構多樣性分析

表5 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對

3.2 偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

SCFA是腸道菌群的主要代謝產物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是由纖維和抗性淀粉(指在小腸中難以被消化的淀粉及其降解產物)在腸道中經厭氧菌發(fā)酵產生[22]。SCFA可降低腸道pH達到促進益生菌生長增殖并抑制特定病原菌定植的目的[9-11]。另有研究表明，腸道菌群以SCFA為介質作用于腸嗜鉻細胞，影響腸道重要信息分子5-HT的合成和釋放[23]。而本試驗研究發(fā)現(xiàn)，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響無顯著差異。

表6 肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量

同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表7 肉雞血清腦腸肽含量

3.3 偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞血清腦腸肽含量的影響

腦腸肽可以直接作用于中樞神經系統(tǒng)，由血液所攜帶的腦腸肽是胃腸道向腦內傳遞的重要化學信號，這些信號物質可以通過腦干的最后區(qū)直接入腦而作用于腦干迷走復合體，進而影響迷走神經的傳出功能，參與胃腸運動、食欲及攝食功能的調節(jié)[24]。

5-HT又名血清素(serotonin)，是一種神經遞質，也是重要的腸道生理調節(jié)器，主要由腸內分泌細胞產生，參與調解腸道運動和感覺，直接或間接刺激腸道分泌。研究報道，在生命早期缺乏菌群的時候，會導致血漿色氨酸水平的升高[25]。還有研究表明雙歧桿菌則可以影響色氨酸的代謝，口服嬰兒雙歧桿菌可誘導大鼠神經遞質多巴胺、5-HT血漿濃度升高[26]。VIP是一種非膽堿能非腎上腺素能抑制系統(tǒng)的神經遞質，對胃腸活動起抑制性調節(jié)作用，引起全胃腸環(huán)形肌松弛[27]，還能改善腸黏膜組織微循環(huán)及內環(huán)境，為腸上皮細胞提供營養(yǎng)物質和氧，并清除過多的氧自由基等有害物質[28]，減少脂多糖對腸黏膜的損傷，促進有益菌的定植使菌群比例恢復正常[29]。SP本身又是一種速激肽，可增加胃腸蠕動，強烈促消化道平滑肌收縮，加強結腸的集團推進運動，刺激小腸、結腸黏膜分泌水和電解質，使胃腸道的血管擴張，通透性增高，血漿外滲，并參與炎癥過程和免疫反應[30]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞血清5-HT含量顯著高于Ⅰ組，而偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞血清VIP和SP含量的影響無顯著差異，這可能與肉雞腸道菌群的變化相關，有待進一步試驗探究。

綜上所述，偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度可改變肉雞盲腸菌群多樣性與結構以及血清腦腸肽5-HT的含量，但不影響盲腸揮發(fā)性脂肪酸的含量，各檢測指標間的確切關系有待進一步探究。

4 結 論

① 偏熱環(huán)境下Ⅱ組肉雞盲腸菌群豐富度和多樣性高于Ⅰ組和Ⅲ組，同時該組飼養(yǎng)密度有利于盲腸Bacteroidesvulgatus的定植。

② 偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對肉雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響無顯著差異。

③ Ⅱ組肉雞血清5-HT含量顯著高于Ⅰ組，但偏熱環(huán)境下飼養(yǎng)密度對血清VIP和SP含量的影響無顯著差異。

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