西青果多酚的提取純化及其抗氧化活性分析

林款，茹琴，梁征，徐叢玥，周梅，李超英

（江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北武漢430056）

西青果為君子科植物訶子的干燥幼果，該植物主要分布于巴基斯坦和印度。在中國，西青果又名藏青果，是傳統(tǒng)中藥藥材，分布于我國廣東、廣西、云南等地區(qū)。中醫(yī)里西青果具有清熱生津、解毒的作用，近年來其降血糖、抗炎、抗氧化、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等生物活性也有報(bào)道[1-4]。有研究表明，西青果提取物中主要含有訶子寧、訶子鞣酸、柯黎勒酸等化合物[5]，具有抑制大鼠腸道麥芽糖酶活性[6]和降血糖作用[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)西青果的有效成分訶子寧具有具有抗炎活性，可顯著降低膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)[8]。西青果中含有酚類、類黃酮和萜類化合物，也使其具有很好的抗菌活性[9]。

西青果黃酮類物質(zhì)的提取已有部分研究[10]，對(duì)于西青果水提物的抗氧化活性也有所報(bào)道[11-12]，而西青果多酚的不同提取純化方法鮮有研究報(bào)道，其多酚類物質(zhì)含量和抗氧化效果也尚不清楚。本研究以西青果為研究對(duì)象，用甲醇作為提取溶劑，再用乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，過大孔樹脂柱進(jìn)行純化，并采用4種體外抗氧化方法綜合評(píng)價(jià)兩種提取物的體外抗氧化活性，以期為從西青果中提取天然的抗氧化活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 原材料

西青果：產(chǎn)自廣西壯族自治區(qū)玉林市興業(yè)縣，經(jīng)鑒定為君子科植物訶子的干燥幼果。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)：美國珀金埃爾默股份有限公司；Fluoroskan ascent FL熒光光度計(jì)：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試劑

沒食子酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；熒光素鈉、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）：阿拉丁試劑網(wǎng)；L-抗壞血酸（VC）、福林-酚試劑、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 西青果多酚提取工藝流程

西青果→打粉過篩→甲醇加熱回流→抽濾濃縮→石油醚脫脂→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取3次→分別濃縮蒸干→加水重懸→過AB-8大孔樹脂柱→水洗棄去→分別用20%、60%、80%、95%乙醇洗脫收集→濃縮凍干成粉末

2.2 西青果多酚提取工藝優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。單因素為甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時(shí)間[13-14]。分別計(jì)算出各條件下多酚的提取量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

2.3 西青果多酚提取量的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定[15]。準(zhǔn)確稱取0.012 5 g沒食子酸，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液溶解并定容至250mL，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0.05（mg/mL）。分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1 mL 于10 mL具塞比色管中，分別加入福林-酚試劑1 mL，搖勻后再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)2 h后，在765 nm波長下測(cè)定吸光度。平行3組，以試劑空白作參比溶液，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded levels used for orthogonal array design

取各西青果多酚提取液1.0 mL，置于10 mL具塞比色管中，分別加入福林-酚試劑1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，室溫下避光反應(yīng)2 h后，在765 nm波長下測(cè)定吸光度。并根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算提取液中總多酚的含量。

2.4 抗氧化活性檢測(cè)

2.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

用甲醇溶液配制待測(cè)樣品，配成濃度分別為0、1、5、10、20、30、40、50 μg/mL，取 3 mL 不同濃度樣品溶液，加入3 mL 0.004%DPPH甲醇溶液，充分混勻，室溫下避光靜置30 min，517 nm波長測(cè)吸光度，以等體積甲醇替代DPPH溶液為空白組，以甲醇代替提取液為對(duì)照組，VC作陽性對(duì)照[16]。

清除率/%=[1-（Ai-Aj）÷ Ao]× 100

式中：Aj為空白組吸光度；Ai為樣品吸光度；Ao為對(duì)照組吸光度。

2.4.2 ABTS法測(cè)定抗氧化能力

ABTS+自由基清除活性測(cè)定使用ABTS總抗氧化能力評(píng)價(jià)方法。ABTS在氧化劑的作用下生成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+·會(huì)被抑制。使用前12 h～16 h將ABTS反應(yīng)原液與過硫酸鉀混合，用PBS稀釋調(diào)整在734 nm吸光度為0.70±0.05。添加 200 μL 混合液和 10 μL 樣品溶液，2 min～6 min后在734 nm測(cè)量吸光度，以VC為陽性對(duì)照，以蒸餾水為空白組對(duì)照[17]。

清除率/%=[1-（Aj-Ai）÷ Ao]× 100

式中：Aj為空白組吸光度；Ai為樣品吸光度；Ao為對(duì)照組吸光度。

2.4.3 樣品總還原力的測(cè)定

分別取 1 mL 濃度為 1、5、10、50、100、200、400（μg/mL）的各待測(cè)樣品溶液，加入0.2 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1.5 mL的0.3%K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃水浴 20 min，迅速冷卻，加入1mL的10%三氯乙酸，混勻后10000r/min離心10 min。取2 mL上清液依次加入3 mL的蒸餾水和0.5 mL的0.3%三氯化鐵，搖勻，在700 nm測(cè)定吸光值，以蒸餾水為空白對(duì)照，VC為陽性對(duì)照[18]。

1.3.4.4 ORAC法測(cè)定抗氧化能力

ORAC也被成為抗氧化能力指數(shù)，熒光素鈉與過氧化氫自由基作用后熒光強(qiáng)度會(huì)衰減，以trolox作為抗氧化物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以蒸餾水為空白對(duì)照。用75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制熒光素鈉溶液和AAPH溶液（153 mmol/L），現(xiàn)配現(xiàn)用，避光，配制濃度為 2.5、5、10、25、50、100、150、200 μg/mL的待測(cè)樣品溶液。在96孔熒光板中加入50 μL的待測(cè)樣品、100 μL的熒光素鈉溶液和 50 μL的AAPH溶液。在37℃、485 nm激發(fā)波長、538 nm發(fā)射波長條件下，每隔3 min檢測(cè)熒光強(qiáng)度，持續(xù)120 min，通過時(shí)間和熒光強(qiáng)度變化計(jì)算各樣品的ORAC值，即Trolox當(dāng)量值[19-20]。熒光衰退曲線下的凈面積（AUC）采用近似積分法計(jì)算，AUC=3×（f0+f1+…+fn）-1.5×（f0+fn），fn為第 n 個(gè)測(cè)定點(diǎn)的相對(duì)熒光光強(qiáng)度。待測(cè)樣品的ORAC值具體計(jì)算公式表示為

ORAC值=（AUCi-AUCo）/（AUCtrolox-AUCo）

式中：AUCi為樣品吸光度；AUCo為空白組吸光度。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS19.0軟件進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組結(jié)果采用LSD顯著性差異測(cè)驗(yàn)進(jìn)行單向方差分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)多酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取西青果粉末6份，料液比分別為1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），用 60%甲醇溶液提取2 h，提取溫度60℃。料液比對(duì)多酚提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)多酚提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

由圖 1可知，在料液比為 1∶20（g/mL）時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值51.61 mg/g，隨后逐漸減小?？赡茉虍?dāng)粉末的量過多時(shí)，只有部分多酚溶出，當(dāng)甲醇的體積到足夠大時(shí)，多酚可以全部溶出，隨著甲醇體積的不斷增大，一些醇溶性雜質(zhì)也會(huì)被提取出來，從而使多酚的含量有所下降，導(dǎo)致多酚提取率逐漸減小直至穩(wěn)定。

3.1.2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響

按料液比1∶20（g/mL）準(zhǔn)確稱取西青果粉末7份，分別加入到甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的溶劑中，提取2 h，提取溫度60℃。甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響見圖2。

圖2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols

由圖2可知，當(dāng)甲醇濃度較低時(shí)，一些糖類物質(zhì)會(huì)溶出，降低了多酚的提取率，隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加至50%時(shí)，多酚與甲醇溶劑的極性最為接近，多酚的提取率達(dá)到最大值39.12 mg/g，當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，一些脂溶性物質(zhì)也會(huì)溶出，同時(shí)甲醇與多酚類物質(zhì)極性差異變大，這些因素都會(huì)影響多酚的提取率。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響

按料液比1∶20（g/mL）準(zhǔn)確稱取西青果粉末7份，在 60 ℃恒溫水浴中分別提取 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)50%，提取溫度60℃。提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

由圖3可知，多酚提取量隨提取時(shí)間的延長逐漸增大，在2.5 h時(shí)達(dá)到最大值為43.24 mg/g，隨后有所減少。這是由于溶劑與被提取物質(zhì)接觸時(shí)間增加，有利于多酚類物質(zhì)的溶出，當(dāng)多酚溶出完全時(shí)，延長提取時(shí)間可能導(dǎo)致部分不穩(wěn)定的多酚被氧化損失。

3.1.4 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響

按料液比1∶20（g/mL）準(zhǔn)確稱取西青果粉末6份，分別置于 30、40、50、60、70、80 ℃恒溫水浴中，其中，提取時(shí)間為2.5 h，甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)50%，提取溫度60℃。提取溫度對(duì)多酚提取量的影響見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)多酚提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

由圖4可知，多酚提取量隨提取溫度的增高而逐漸增大，在70℃時(shí)達(dá)到最大值為47.96 mg/g，隨后有所減少。可能原因溫度升高，溶劑分子熱運(yùn)動(dòng)速度加快，提取效率增大，當(dāng)溫度過高時(shí)，多酚容易被氧化甚至產(chǎn)生降解，因此不宜用過高的溫度來提取多酚類物質(zhì)。

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，考察結(jié)果用多酚提取量來表示，正交試驗(yàn)結(jié)果如表所示，影響多酚提取效果的四因素主次順序?yàn)镈＞A＞B＞C，即提取溫度＞料液比＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間；提取最佳工藝條件為A2B2C1D2，即甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間2 h、提取溫度70℃、料液比1∶20（g/mL）。按照正交試驗(yàn)最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，多酚粗提物提取量為54.12mg/g，提取效率高于以上9個(gè)試驗(yàn)組合，正交試驗(yàn)最佳工藝條件得以驗(yàn)證。

3.3 提取最佳工藝驗(yàn)證及過柱純化后各組分總多酚含量

取100 g的西青果粉末，按照最佳提取工藝提取一批西青果多酚的粗提液，經(jīng)過萃取和柱純化后，正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分各洗脫級(jí)份多酚含量如表3所示，其中20%～60%乙醇洗脫部分的西青果多酚含量最高，分別達(dá)到71%和72%，因此采用20%～60%乙醇洗脫部分來研究西青果多酚的抗氧化能力。

表3 乙醇分級(jí)洗脫組分中多酚含量Table 3 Polyphenol content in elution composition with different concentrations ethanol

3.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

3.4.1 DPPH自由基清除能力

同質(zhì)量濃度西青果多酚對(duì)DPPH自由基清除效果見圖5。

圖5 不同質(zhì)量濃度西青果多酚對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由圖5可知，西青果多酚和VC都有清除DPPH自由基的作用。隨著多酚提取物和VC質(zhì)量濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力均先增強(qiáng)最后趨于恒定。在濃度＜30 μg/L時(shí)，乙酸乙酯和正丁醇萃取西青果多酚的DPPH自由基清除能力均顯著強(qiáng)于VC（P＜0.05）。當(dāng)濃度＞30 μg/L時(shí)，3種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基基本清除完全。通過計(jì)算正丁醇萃取部分IC50值為3.483 μg/L，乙酸乙酯萃取部分IC50值為 3.151 μg/mL，VCIC50值為 5.521 μg/mL，說明西青果多酚具有比VC更強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。本方法采用的VC純度為97%，而經(jīng)過萃取和純化的西青果多酚具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，因此應(yīng)當(dāng)選取抗氧化能力比VC更強(qiáng)的物質(zhì)作為陽性對(duì)照。

3.4.2 ABTS法測(cè)定抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度西青果多酚對(duì)ABTS+自由基清除效果見圖6。

圖6 不同質(zhì)量濃度西青果多酚對(duì)ABTS+自由基清除效果Fig.6 ABTS+free radical scavenging effect of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由圖6可知，當(dāng)濃度＜75 μg/mL時(shí)，乙酸乙酯和正丁醇萃取西青果多酚對(duì)ABTS+自由基清除能力與VC無顯著性差異，但當(dāng)濃度＞75 μg/mL，乙酸乙酯部分的西青果多酚對(duì)ABTS+自由基清除能力顯著大于正丁醇萃取西青果多酚（P＜0.05）和VC（P＜0.05），當(dāng)濃度增大到400 μg/mL時(shí)，3種物質(zhì)對(duì)ABTS+自由基基本清除完全。通過計(jì)算正丁醇萃取部分IC50值為 76.774 μg/mL，乙酸乙酯萃取部分 IC50值為53.977 μg/mL，VC的 IC50值為 76.337 μg/mL，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取部分的西青果多酚具有更強(qiáng)的清除ABTS+自由基能力。分析原因是正丁醇的極性大于乙酸乙酯，不同極性溶劑萃取出來的各多酚物質(zhì)的種類和相對(duì)含量有所差異，因此兩者的抗氧化能力也有差異。經(jīng)過乙酸乙酯萃取和純化的西青果多酚具有比VC更好的清除ABTS+自由基能力，因此應(yīng)當(dāng)選取抗氧化能力更強(qiáng)的物質(zhì)代替VC作為陽性對(duì)照。

3.4.3 總還原能力的測(cè)定

不同質(zhì)量濃度西青果多酚的總還原能力見圖7。

圖7 不同質(zhì)量濃度西青果多酚的總還原能力Fig.7 Total reduction force of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由圖7可知，西青果多酚和VC的總還原力均隨著濃度的增大而增加，正丁醇和乙酸乙酯萃取的西青果多酚均顯著高于VC的還原力（P＜0.05），當(dāng)濃度＞50 μg/mL時(shí)，正丁醇和乙酸乙酯萃取的西青果多酚的總還原力相當(dāng)。說明西青果多酚的總還原力強(qiáng)于VC，這從另一方面也表明了西青果多酚較強(qiáng)的抗氧化能力，與其他的幾種抗氧化能力評(píng)價(jià)方法結(jié)果相符合。

3.4.4 ORAC法測(cè)定抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度西青果多酚的ORAC值見圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度西青果多酚的ORAC值Fig.8 ORAC value of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

根據(jù)曲線下面積和濃度之間的關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)物Trolox 的標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=1.203 1x+3.470 3，R2=0.988 4，通過與標(biāo)準(zhǔn)物Trolox的曲線進(jìn)行對(duì)比，得到了西青果多酚和VC的ORAC值。ORAC值越大，說明單位濃度下?lián)Q算成的Trolox的量也越大，即抗氧化能力越強(qiáng)。由圖可知，隨著濃度的增大，3種物質(zhì)的ORAC值隨之增大，當(dāng)濃度較低時(shí)，正丁醇萃取的西青果多酚ORAC值最低，當(dāng)濃度增加到10 μg/mL時(shí)，兩種西青果多酚的抗氧化能力均大于VC，濃度增加到最大50 μg/mL時(shí)，VC、正丁醇和乙酸乙酯萃取部分的ORAC分別達(dá)到0.98、1.41、1.28 μmol/g（即與每g質(zhì)量的trolox具有同等抗氧化能力的物質(zhì)的量），其中乙酸乙酯萃取的西青果多酚在不同濃度條件下始終保持著最高的ORAC值。結(jié)果表明乙酸乙酯萃取的西青果多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，與以上3種抗氧化能力評(píng)價(jià)結(jié)果想符合。

4 討論與結(jié)論

在西青果多酚的提取過程中，用甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間2 h、提取溫度70℃、料液比1∶20（g/mL）的工藝條件，可以使多酚提取量達(dá)到最大值54.12 mg/g。在用大孔樹脂純化粗提多酚的過程中，用20%～60%濃度的乙醇洗脫可以得到含量較高的西青果多酚。這種提取方法原料為西青果粉末，提取效率高，因此適用于工業(yè)上的大批量生產(chǎn)。

通過DPPH自由基清除能力、ABTS法測(cè)定抗氧化能力、FRAP法測(cè)定總抗氧化能力、總還原能力的測(cè)定、ORAC法測(cè)定抗氧化能力等一系列抗氧化能力評(píng)價(jià)試驗(yàn)，比較了不同溶劑萃取的西青果多酚的抗氧化活性，綜合結(jié)果表明經(jīng)過萃取和純化的西青果多酚均具有良好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取部分的西青果多酚的效果最好。由于不同極性的溶劑萃取出的多酚物質(zhì)種類也不相同，從而導(dǎo)致了抗氧化活性的差異?？梢詫⑽髑喙喾娱_發(fā)為優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)，有利于提高西青果中多酚的綜合利用價(jià)值，為進(jìn)一步深入研究西青果的功效活性提供理論依據(jù)。

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