明日葉查爾酮制備方法與抗衰老作用研究進展

陸香珍，李群，李子超

（1.青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島266071；2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266071）

明日葉（Angelica keiskei Koidzumi），又名“濱海當(dāng)歸”、“長壽芹”、“神仙草”、“還陽草”、“海峰人參”等[1]，為當(dāng)歸屬傘形花科（Umbelliferae），多年生草本植物。原產(chǎn)于日本太平洋沿岸—伊豆、八丈諸島，據(jù)其莖顏色的不同分為紅、青與混合莖種3個品種[2]。明日葉當(dāng)代研究始于20世紀(jì)60年代日本[3]，90年代末引入國內(nèi)，目前在山東、云南、兩廣、海南、臺灣等地區(qū)均有種植，市面上明日葉商品已有代茶飲、精力湯粉、面條、查爾酮膠囊等。

明日葉作為一種天然藥食兼?zhèn)渲参?，?0種礦物質(zhì)、16種氨基酸[4]、多種維生素以及豐富的葉綠素和微量元素，特別是其含有植物中少見的查爾酮、維生素B12、葉酸與天然有機鍺等[5-6]，是難得的天然營養(yǎng)補充劑及保健食品，被譽為“神奇植物”[7]。查爾酮類物質(zhì)為明日葉的主要活性成分，現(xiàn)已有多達42種查爾酮衍生物從明日葉中成功分離并鑒定[8]。據(jù)報道，明日葉查爾酮具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、抗心血管疾病、抗血栓、保肝、抗?jié)?、抗黑色素生成及生發(fā)、記憶修復(fù)[9-25]等諸多功效。大量研究表明[8]，明日葉查爾酮具有顯著的抗氧化、抗衰老活性。隨著衰老自由基理論（Free radical theory of aging）研究的深入[26]，明日葉查爾酮所具有的強的自由基清除能力引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

1 明日葉查爾酮的提取

明日葉查爾酮以其諸多顯著的生理活性與高度的安全性[27]已得到各界認(rèn)可，故采用最簡便的方法獲取高含量、高純度的查爾酮，成為明日葉研究的熱點。目前明日葉查爾酮的主要提取方法有：溶劑萃取法、索式回流提取法、超聲與微波輔助法以及其他新興的提取方法。

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法依據(jù)查爾酮類物質(zhì)在水、醇、酯等溶劑中溶解度的不同進行提取，提取工藝簡單，成本低，最易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

1.1.1 水提法

黃酮類物質(zhì)含有酚羥基，在常溫水中溶解度小，但在沸水中有一定溶解度[28]。郭曉青等[29]以明日葉干粉為原料，對比了水浴加熱、煮沸、微波輔助浸提的提取率，得到最佳浸提條件為95℃下浸提10 min，總黃酮提取率為2.52 mg/g。該法的最大優(yōu)點是綠色環(huán)保、無污染，但提取率較低。

1.1.2 有機溶劑提取法

1.1.2.1 乙醇提取法

乙醇的極性比水小，所以醇水體系對查爾酮的提取率比水提法明顯提高。Ohnogi等[30]用干燥的明日葉根粉，無水乙醇為溶劑，室溫下提取了明日葉中黃當(dāng)歸醇（xanthoangelol，XA）、4-羥基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）等8種查爾酮；郭曉青等將明日葉葉冷凍、干燥、粉碎后，用65%的乙醇[31]、45℃下浸提15 min，提取物中的總黃酮提取率達10.18 mg/g。和水提法相比，醇水法能耗低、效率高、穩(wěn)定性好。

1.1.2.2 甲醇提取法

甲醇極性比乙醇高、比水低，故常用其調(diào)節(jié)萃取溶劑的極性。Kim[32]等用明日葉根皮粉為原料，純甲醇為溶劑，料液比 1∶10（g/mL），室溫下提取量為 290 mg/g，提取物含有包括5種查爾酮類化合物等共計16種物質(zhì)；何月秋等[33]則以冷凍的新鮮明日葉莖葉為原料，93%甲醇為溶劑，料液比 1∶25（g/mL），提取 28 min，總黃酮提取率為17.28 mg/g。

1.1.2.3 乙酸乙酯提取法

乙酸乙酯是比乙醇極性更小的有機溶劑，也常用于黃酮類物質(zhì)的提取。該方法主要為醇類粗提后，乙酸乙酯作二步萃取，旨在得到相對較純的查爾酮類物質(zhì)。Masaharu等[18]以明日葉根粉為原料，50%乙醇回流萃取3次，每次3 h，提取率為97.6 mg/g。提取物用1∶8的乙酸乙酯/水體系萃取，酯溶物占26.9%。酯溶物再經(jīng)硅膠柱色譜多次分離得到查爾酮，占酯溶物的百分含量為11.5%，占原料的0.29%。Ogawa等[34]與Zhang等[35]也采用了類似方法提取查爾酮。

1.1.2.4 多溶劑混合提取法

另外國外也有研究為簡化實驗步驟、節(jié)約試劑，選用包括甲醇在內(nèi)的兩相溶劑系統(tǒng)為溶劑，如Akihisa等[36]選擇明日葉莖粉滲出物凍干粉為原料，正己烷∶甲醇∶水=95∶95∶10 的體系提取，得率為 92.3%，用 1∶1 的乙酸乙酯/水體系萃取，得率為18.9%；最后用中、高效液相色譜（medium and high performance liquid chromatography，MPLC+HPLC）分離得5種查爾酮，得率5.0%，其中XA得率2.6%，4-HD得率1.4%。

1.2 索式回流提取法

索式回流提取法是指借助索式提取器提取的方法。陳欣華等[37]以明日葉干粉為原料，60%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g/mL）進行索氏提取 3 h，總查爾酮提取率為6.19 mg/g。

1.3 超聲輔助提取法

超聲輔助法利用超聲對植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，加速溶劑滲入細(xì)胞，且超聲震動帶來的能量可加速植物中有效成分的溶解，從而縮短提取時間，提高提取率。寧鴻珍等[38]利用超聲提取法，選擇功率300 W，乙醇濃度為 70%，1∶50（g/mL）的料液比，50℃下提取 20min，重復(fù)兩次。與索式提取法相比，該方法提取率由6.19mg/g提高到7.53 mg/g，時間由3 h縮短到40 min，溫度由100℃降低至50℃。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助法利用了電磁波穿透力強、選擇性好、熱效率高等優(yōu)點來提取分離，是新興的“綠色萃取技術(shù)”[39]。鄒毓蘭等[40]以明日葉干粉為原料，85%、40%乙醇為溶劑，各提取3次，微波功率為600、700 W時，采用AlCl3與Al（NO3）3顯色法，分別確定樣品中總黃酮的得量分別為1.48 mg/g與1.67 mg/g；尹慧丹等[41]以明日葉干粉為原料，70%乙醇，料液比 1∶40（g/mL），提取2 min，反復(fù)提取3次，微波功率320 W，查爾酮得率為1.039 mg/g。

1.5 其他新興提取方法

酶解法是通過一種或多種酶的水解作用來破壞天然產(chǎn)物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞的通透性，從而提高黃酮類物質(zhì)提取率的方法。如王敏等[42]利用纖維素酶處理苦蕎莖葉粉，黃酮得率為未經(jīng)酶處理的3.08倍；另外超臨界流體萃取（supercritical fluid extraction，SFE）與半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）等新興提取方法[43-45]，提取效果均優(yōu)于傳統(tǒng)提取法，但明日葉查爾酮的提取目前還未出現(xiàn)類似新興提取方法的研究。

2 明日葉查爾酮的分離與純化

2.1 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂吸附利用樹脂與吸附質(zhì)之間的范德華力作用進行吸附，且大孔樹脂具有孔徑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，比表面積大等優(yōu)點，故可用于明日葉查爾酮的純化。朱芳等[46]從12種大孔樹脂中篩選出純化效果最好的HPD-600，確定上樣濃度 2mg/mL～3mg/mL，流速 3BV/h，上樣量2.7 BV，洗脫條件為：用蒸餾水沖至無色后，改用4 BV，50%乙醇進行洗脫，總黃酮的純度由14.46%提升至46.96%；王亦敏等[47]則采用AB-8大孔樹脂分離明日葉總黃酮，條件為：蒸餾水為洗脫劑，大孔樹脂粒徑為30目，洗脫流速為15 mL/min，4-HD含量最高為29.08%。但大孔樹脂洗脫只能優(yōu)化總黃酮的提取純度，并不能將各查爾酮類物質(zhì)逐一分開。

2.2 柱層析法

2.2.1 常壓柱層析法

常壓柱層析法是天然產(chǎn)物分離最普遍的方法之一，根據(jù)其填料的不同分為硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜（Sephadex LH-20）等。分離、純化各查爾酮衍生物，多選擇幾種層析法結(jié)合使用的方法。Matsuura等[48]將明日葉的粗提物用乙酸乙酯、氯仿-甲醇等不同展開劑，硅膠柱色譜梯度洗脫，得到5種查爾酮，占原料的0.29%。Akihisa等[14]則將硅膠柱色譜結(jié)合反式柱色譜與高效液相色譜，得到的9種查爾酮的純度均高于95%，且XA含量最高為0.43 mg/g。

2.2.2 中、高效液相色譜法

中、高效液相色譜法（MPLC/HPLC）為柱色譜法的重要分支，通過對輸液系統(tǒng)施加一定壓力，加速各組分進入色譜柱，再經(jīng)檢測器進行檢測。經(jīng)HPLC后基本可獲得高度純化的查爾酮，比經(jīng)典柱層析法有高速、高效、高靈敏度以及分析范圍廣等優(yōu)點。李亞麗等[49]選擇Hola C18柱，0.1%甲酸溶液-甲醇經(jīng)HPLC梯度洗脫，于370 nm下檢測，確定了XA與4-HD在各部位（干粉）的分布：莖 75、149 μg/g，根 144、122 μg/g，葉1.2、1.2 μg/g。Akihisa等[14]將明日葉的乙酸乙酯提取物采用MPLC反向色譜柱，甲醇為洗脫劑，流速3.0 mL/min得三大類查爾酮物質(zhì)；進一步經(jīng)HPLC反向制備柱，甲醇、水與乙酸體積比為 65∶35∶1，2.0 mL/min，成功分離出5種查爾酮，總提取率為112 mg/g滲出液。

2.2.3 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（high speed counter current chromatography，HSCCC）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液液分離色譜技術(shù)，適合天然生物活性成分的分離。Kil等[50]采用sephadex LH20結(jié)合HSCCC，選擇體積比為：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=9∶5∶9∶4為洗脫劑，轉(zhuǎn)速800 r/min，流速1.5 mL/min，成功分離了明日葉中兩種主要查爾酮XA（0.359 mg/g干粉）與4-HD（0.044 mg/g干粉），純度分別達到了99.9%與98.7%，是目前所得明日葉查爾酮純度最高的分離方法。

3 明日葉查爾酮的抗衰老作用

3.1 衰老與抗衰老機理模型

衰老是由身體、心理以及一系列的外界環(huán)境，如輻射、環(huán)境污染、精神壓力、過度勞累等共同作用引起的一種復(fù)雜的生命現(xiàn)象，如圖1[52-53]所示。其發(fā)生機理說法不一。其中，英國學(xué)者Harman于1956年提出的氧化自由基學(xué)說是目前最具有說服力的學(xué)說之一[26]。該學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)自由基可攻擊DNA、生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子，造成機體衰老；而體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)或體外清除自由基物質(zhì)（如查爾酮）的引入，可以通過抗氧化作用來減小或避免自由基對生物大分子的破壞，達到抗衰老的目的。生物體內(nèi)常見自由基[51]有超氧自由基（O2-·）、羥自由基（HO·）、過氧自由基（ROO-）和過氧化氮自由基（ONOO-）等。

圖1 衰老與抗衰老的自由基作用機理圖Fig.1 Scheme of aging and anti-aging mechanism of free radicals

美國衰老研究學(xué)者Sohal教授[54]指出了該學(xué)說的缺陷，并提出了氧化應(yīng)激（redoxstress response，ROS）[55]的概念，即生物體因遭受各種有害刺激或隨年齡的增長，氧化程度超出氧化物的清除速率，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，進一步參與到包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種病理過程，從而導(dǎo)致組織損傷，以致衰老[56]?？寡趸^度表達不會延長小鼠的壽命，但輕度的氧化應(yīng)激增加可延長壽命[57-58]。Manuel[59]通過回顧9個衰老標(biāo)志后發(fā)現(xiàn)，基因組不穩(wěn)定和線粒體功能障礙與ROS直接相關(guān)，其他表現(xiàn)為間接關(guān)系。故細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)依然是抗衰老研究的重點。

明日葉查爾酮由于其特殊活性的結(jié)構(gòu)決定了其在體內(nèi)、外抗氧化，防衰老等方面發(fā)揮著獨特功效?，F(xiàn)階段對明日葉抗氧化的研究主要為體外清除自由基與體內(nèi)酶活性抑制階段。

3.2 明日葉查爾酮抗衰老作用研究進展

3.2.1 體外研究

體外研究是利用抗氧化劑清除自由基能力來判斷抗氧化作用的大小的研究方法。一般采用光譜分析法測定作用前后的吸光度來作出判斷。

3.2.1.1 總抗氧化作用

氧化自由基清除能力即抗氧化能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），主要依據(jù)自由基破壞β-藻紅蛋白的熒光性[60]，使熒光強度產(chǎn)生變化的原理，最早采用抗氧化劑作用下與熒光自然衰退下，衰退曲線面積的差，作為衡量抗氧化劑的抗氧化能力指標(biāo)，選擇維生素E水溶性類似物Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)[61]，現(xiàn)多使用熒光微孔板分析儀進行分析。如Kwon等[62]最早通過該方法，證明明日葉粗提物HO·的清除能力。

3.2.1.2 HO·清除

HO·作為體內(nèi)最活潑的活性氧，可引發(fā)多種疾病，故對HO·的研究具有深遠意義[63]。郭曉青等[64]于510nm下測定明日葉總黃酮清除費頓反應(yīng)產(chǎn)生HO·能力，發(fā)現(xiàn)其對HO·有強清除作用，且總黃酮濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，清除率與濃度呈正相關(guān)，最高為61.9%。

3.2.1.3 超氧陰離子自由基的清除

超氧陰離子自由基（O2-·）是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種可引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加快機體衰老的活性氧自由基之一，故日本Aoki等[65]利用次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系在體外產(chǎn)生O2-·的方法，將XA、抗壞血酸等與明日葉根提取的4種查爾酮xanthokeismins A、B、C、黃當(dāng)歸醇B作對比，利用超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒分別測定對O2-·的抑制活性，使用酶標(biāo)儀于450 nm下測定，發(fā)現(xiàn)4種查爾酮均表現(xiàn)出強有效的O2-·抑制活性，半抑制率IC50約為0.51 μmol/L～1.1 μmol/L，抗壞血酸與 XA 的 IC50均大于40 μmol/L基本無抑制活性，即4種查爾酮可以通過某些程序抑制酶的活性間接抑制活性氧自由基的產(chǎn)生，首次從分子機制闡述了查爾酮的抗衰老活性。

3.2.1.4 ABTS+自由基清除

ABTS+自由基（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽），是一種人工合成的顯色劑，在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟聲谎趸删G色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在時ABTS+自由基的產(chǎn)生會被抑制，可通過在734 nm或405 nm測定吸光度并計算出抗氧化劑的總抗氧化能力。如2010年，Aoki等[66]發(fā)現(xiàn)明日葉種子在萌芽過程中，種皮中存在大量查爾酮ashitabaol A，該查爾酮具有強的ABTS+自由基清除活性，半清除率SC50=13.8 μmol/L，可有效地緩解種子萌芽過程中產(chǎn)生的的自由基氧化損傷。

3.2.1.5 DPPH自由基清除

DPPH （1，1-二 苯 基-2-三 硝 基 苦 肼 ，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基為人工合成的穩(wěn)定自由基，其在517 nm處有強吸收，醇溶液呈紫色，當(dāng)抗氧化劑存在時，抗氧化劑對DPPH自由基有一定清除作用，致使其單電子配對而造成吸收降低，故可采取分光光度法進行快速定量分析。如2016年，何月秋等[33]對比明日葉甲醇、乙醇提取物總黃酮的DPPH自由基清除效率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇提取物總黃酮質(zhì)量濃度為129.87 μg/mL時，清除率在74%以上，繼續(xù)升高后，清除率最大達75.7%，之后趨于平緩，IC50為5.06 μg/mL，而乙醇提取物總黃酮IC50僅為58.37 μg/mL。

3.2.2 體內(nèi)研究

明日葉查爾酮體內(nèi)抗氧化作用的評價主要通過查爾酮作用于細(xì)胞后，通過測定細(xì)胞中各酶含量的變化情況來判斷。

候芳霖等[67]通過單核細(xì)胞直接細(xì)胞毒性測定法（mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay，MTT）考察明日葉查爾酮對荷H22肝癌小鼠抗氧化能力，通過檢測各組小鼠瘤組織血清總SOD、脂質(zhì)過氧化物（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Pχ）水平等，發(fā)現(xiàn)血清總 SOD活力與GSH-Pχ的含量均隨明日葉查爾酮劑量的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，MDA呈相反趨勢，充分證明高濃度查爾酮優(yōu)異的體內(nèi)抗氧化性；Luo等[68]采用液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS） 的方法，以谷胱甘肽（glutataione，GSH）為底物，發(fā)現(xiàn)明日葉中異補骨脂查爾酮（Isobavachalcone）、XA、4-HD等可以與GSH迅速結(jié)合導(dǎo)致醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase 1，NQO1）誘導(dǎo)活動，因NQO1可將醌類如甲萘醌催化成氫醌，可提供防止醌介導(dǎo)的氧化損傷的保護[69]；Kim等[70]則將明日葉發(fā)酵汁、葉子、粉碎物等喂食肥胖大鼠，測定查爾酮對其影響，發(fā)現(xiàn)明日葉及其加工制品的攝入可通過增加高脂肪動物中抗氧化酶（過氧化氫酶和GSH-Pχ）的表達，消除肝臟中的活性氧，達到延緩衰老的目的。

4 結(jié)語

1）目前對明日葉查爾酮的提取、分離、純化工藝雖已研究較多，但明日葉不同生長階段、不同部位的查爾酮種類及含量會有所不同，研究極其復(fù)雜，獲得一種綠色且高效的天然查爾酮純品制備技術(shù)尚需更進一步研究；

2）目前明日葉查爾酮的抗衰老作用研究成果較少，特別是動物實驗及臨床實驗研究數(shù)據(jù)還十分缺乏，另其作用機理仍未完全闡明，尚需研究工作者更深入的研究，為明日葉醫(yī)藥應(yīng)用的開發(fā)提供理論堅實的理論和試驗依據(jù)。

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