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    SRAP技術(shù)分析海南降香檀遺傳多樣性

    2018-03-05 11:03:36孟慧陳波楊云
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:遺傳多樣性

    孟慧 陳波 楊云

    摘要 為探討海南降香檀遺傳多樣性,以采自海南省東、西、南、北、中五個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)185份降香檀單株材料為材料,采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:利用篩選出的25對(duì)SRAP引物組合,擴(kuò)增共檢測(cè)到174個(gè)位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)92個(gè),多態(tài)率為52.8%。UPGMA聚類分析結(jié)果表明,185份海南降香檀種質(zhì)材料與對(duì)照多裂黃檀遺傳相似系數(shù)為0.56;在相似系數(shù)約為0.73處,可將收集到降香檀種質(zhì)劃分為4個(gè)類群。SRAP標(biāo)記可較好地反映海南降香檀種質(zhì)間的遺傳多樣性,為合理保護(hù)和利用海南降香檀種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)與借鑒.并為海南降香檀分類系統(tǒng)和進(jìn)化關(guān)系提供分子系統(tǒng)學(xué)依據(jù)。

    關(guān)鍵詞 SRAP;降香檀;遺傳多樣性

    降香檀(Dalbergia odorifera T.Chen)為豆科黃檀屬植物,是海南特有瀕危樹種,被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1-2]。其根、莖部干燥心材即為中藥“降香”,具有行氣活血、止痛止血的功效[3],是珍稀名貴南藥。由于國(guó)產(chǎn)降香檀心材具有耐腐蝕、紋理細(xì)密,且散發(fā)芳香,經(jīng)久不退等特點(diǎn),是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)5屬8類34種紅木之一[4]。早在17世紀(jì),海南省野生降香檀資源已被掠奪式砍伐[5]?,F(xiàn)僅存的資源也被原產(chǎn)地附近居民采挖栽種于自家院落.導(dǎo)致原始森林中已很難找到成齡降香檀。由于野生資源的匱乏,心材的高附加值,導(dǎo)致海南、廣東、廣西、云南、福建、四川等地大量開展人工栽培降香黃檀林[6-12]。降香檀因地理分布的特點(diǎn)及特有的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其心材生長(zhǎng)發(fā)育影響十分明顯,分析降香檀遺傳多樣性對(duì)于降香檀種質(zhì)資源的收集、品種選育、合理保護(hù)和利用具有重要的意義。

    SRAP(序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)是一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù),該技術(shù)是通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs (Open reading frames開放閱讀框)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[13]。SRAP技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性高,共顯性高、引物具有通用性、易于測(cè)序等優(yōu)點(diǎn),在動(dòng)物、植物、微生物等學(xué)科中都廣泛使用。其中,該技術(shù)在植物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、基因定位、重要性狀標(biāo)記以及比較基因組學(xué)等方面廣泛應(yīng)用[14]。目前,有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)RAPD技術(shù)分析降香黃檀遺傳多樣性[15],而有關(guān)降香檀的SRAP分析尚未見報(bào)道。前人研究表明,SRAP技術(shù)在生態(tài)型進(jìn)化史上比AFLP更具有一致性。在育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記,有較高的多態(tài)性標(biāo)記比率,是評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具[16]。SRAP標(biāo)記能夠較好的開展遺傳多樣性分析,通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性作為不同居群的劃分依據(jù)更為可行和客觀,可以避免由于不同發(fā)育階段和季節(jié)性生理生化差異而影響指標(biāo)的準(zhǔn)確性[17]。本研究利用篩選出的25對(duì)SRAP引物組合[18]對(duì)采自海南省東、西、南、北、中5個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)185份降香檀單株材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,為合理保護(hù)和利用海南降香檀種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)與借鑒,并為海南降香檀分類系統(tǒng)和進(jìn)化關(guān)系提供分子系統(tǒng)學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料

    以采自海南省東、西、南、北、中五個(gè)區(qū)域23個(gè)點(diǎn)共185份降香檀(Dalbergia odorifera T.Chen)和1份外類群物種多裂黃檀(Dalbergia rimosaRoxb)的嫩葉進(jìn)行遺傳多樣性分析,植物經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所資源室李榕濤老師鑒定無(wú)誤,具體見表1。

    1.1.2 引物材料

    25對(duì)引物參考楊云等[18]對(duì)降香檀SRAP引物的篩選。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA的提取方法與檢測(cè)

    降香檀基因組DNA提取參考楊云等[19]的方法。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μL,其中10×Taq Buffer 2μL、25 mmol/L MgCl2 1.6μL、4×dNTP Mixture 0.5μL、5 U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL、左右引物濃度各2μL,約20 ng/μL基因組DNA 2μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,35℃退火45 s,72延伸45 s,5個(gè)循環(huán);94℃變性30 s,50℃退火45 s,72延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳結(jié)束后取下凝膠進(jìn)行銀染,染色程序參考張軍等[20]的方法。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    以電泳照片記錄譜帶,按照相同遷移位上有多態(tài)性擴(kuò)增帶記為“1”,無(wú)帶為“0”的方法,用Glyko Banscan 4.5軟件輔助記錄電泳譜帶,多態(tài)性和重復(fù)性好的擴(kuò)增帶才被記錄。聚類分析應(yīng)用NTSYSpc 2.1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行,UPGMA方法聚類。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SRAP擴(kuò)增結(jié)果

    利用楊云等[16]篩選出的25對(duì)SRAP引物組合對(duì)185份種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均獲得帶型豐富且清晰可辨的電泳圖譜,共檢測(cè)到174個(gè)位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)92個(gè),多態(tài)率為52. 8%,反映了海南降香檀種質(zhì)具有較高的基因多樣性水平。部分引物的電泳結(jié)果見圖~2。

    2.2 遺傳多樣性和聚類分析

    根據(jù)SRAP標(biāo)記對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析,得到聚類樹狀圖(圖3)。由圖3可知,185份海南降香檀種質(zhì)材料與對(duì)照多裂黃檀(編號(hào)186號(hào))遺傳距離較遠(yuǎn),遺傳相似系數(shù)為0.56。結(jié)果與余敏[21]提出的降香檀與多裂黃檀在黃檀屬中有著較近的親緣關(guān)系,但是二者又不屬于同一植物類群的觀點(diǎn)相同。5個(gè)行政區(qū)域23個(gè)自然居群的185份降香檀樣品,總多態(tài)位點(diǎn)百分率是52.8%,說(shuō)明降香檀種內(nèi)遺傳背景具有較豐富的多樣性;在相似系數(shù)約為0.73處可將供試的185份海南降香檀種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群(即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),這與降香檀自然分布情況一致。

    第Ⅰ類群主要為海南南部地區(qū)和北部地區(qū)的部分種質(zhì),這個(gè)類群又可劃分為2個(gè)亞類群,南、北部地區(qū)的種質(zhì)分別在2個(gè)不同亞類群中。

    第Ⅱ類群除了南部地區(qū)的1份種質(zhì)外(編號(hào)112號(hào)),其它8份全部為北部地區(qū)種質(zhì)。

    第Ⅲ類群主要包括了海南南部地區(qū)和西部地區(qū)的部分種質(zhì)。

    第Ⅳ類群包括了東、西、北和中部地區(qū)的部分種質(zhì),中部地區(qū)的大部分種質(zhì)均聚在這個(gè)類群中,并且與其它地區(qū)的種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn)。如果將這個(gè)類群再細(xì)劃分,各地區(qū)的種質(zhì)又分別在不同的亞類群中。

    3 討論

    分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于降香檀遺傳多樣性檢測(cè)方面的報(bào)道不多。楊新全等[22]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)降香黃檀6個(gè)居群77個(gè)樣品的遺傳多樣性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)位性百分率為54.55%。訾慧等[23]利用RAPD技術(shù)鑒別中藥降香及其易混淆品山油柑,品種間出現(xiàn)了明顯的多態(tài)性差異,每種藥材均得到4~7條帶,易混淆品山油柑與正品降香的帶型不同,有明顯的差異。本研究對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析,結(jié)果表明,25對(duì)SRAP引物組合對(duì)185份海南降香檀種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均獲得帶型豐富且清晰可辨的電泳圖譜,多態(tài)率為52.8%,說(shuō)明SRAP標(biāo)記技術(shù)在海南降香檀種質(zhì)的遺傳多樣性研究中有較高的檢出率。

    海南各地降香檀雖然被聚類為4大類群,但主要以北部地區(qū)和南部及西南部地區(qū)為主,這與海南降香檀野生分布集中在北部石山地區(qū)和南部及西南部地區(qū)相吻合,其余各地區(qū)種質(zhì)基本來(lái)自于這兩個(gè)大地區(qū)。

    降香檀種質(zhì)遺傳多樣性較為豐富,但來(lái)源主要為北部、南部及西南部的自然分布區(qū)。第Ⅲ類群中包含了南部和西部2個(gè)區(qū)域,這與降香檀歷史記載的天然分布一致,分布在西南部和南部區(qū)域的種質(zhì)資源來(lái)源基本相同;第IV類群中包含了北、東、西、中4個(gè)區(qū)域,唯獨(dú)沒有南部區(qū)域的種質(zhì)資源,說(shuō)明東、西、中區(qū)域的種源大多來(lái)自北部區(qū)域。北部區(qū)域由于海口的政治經(jīng)濟(jì)文化中心地位以及便利的交通,更利于降香檀種苗的運(yùn)輸和傳播。其中,西部區(qū)域出現(xiàn)了南部和北部種質(zhì)混雜的現(xiàn)象,主要原因是西部樣品來(lái)源于儋州、白沙、昌江、東方等地,其中儋州等位于西北部,其種質(zhì)主要來(lái)源于北部區(qū)域,而另一部分西部區(qū)域采樣點(diǎn)位于西南部,和南部區(qū)域交叉種質(zhì)交流頻繁,所以導(dǎo)致西部區(qū)域種質(zhì)出現(xiàn)南北混雜的現(xiàn)象。

    本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)解析了海南地區(qū)降香檀種質(zhì)遺傳多樣性,為我國(guó)降香檀種質(zhì)資源調(diào)查、種質(zhì)鑒別提供理論依據(jù)。但由于研究區(qū)域、采樣數(shù)量的局限性,只能局部的反映降香檀種質(zhì)的遺傳多樣性特點(diǎn)。因此,要全面系統(tǒng)地對(duì)降香檀種質(zhì)遺傳多樣性研究還需要更大的采樣量并結(jié)合多種研究方法,后續(xù)工作也正在開展。

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