HPLC同時測定云南卡蒂姆咖啡中種有機酸含量的方法

段麗娜 邱碧麗 代麗玲 張紹龍 梅麗寶 康文虹

摘要 建立云南卡蒂姆咖啡中L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸含量的測定方法。采用HPLC同時測定云南卡蒂姆咖啡中7種有機酸的含量，以C18為色譜柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸水，梯度洗脫，流速0.8 mL/min.柱溫：35℃，檢測波長：210 nm。7種有機酸成分分離度良好;各成分質量濃度與峰面積在測定范圍內均呈良好的線性關系（r>0.9995），平均加標回收率在86.31%～95.23%，0.7種有機酸的精密度及重復性的RSD值均<3.0%。該方法簡便、準確、重復性好，可用于云南小粒咖啡中L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸含量的測定。

關鍵詞 HPLC;云南卡蒂姆咖啡;有機酸

卡蒂姆咖啡是卡杜拉（Caturra）與蒂姆（HDT）雜交的品種。具有抗銹病性強、高產、植株緊湊、適應性好、耐熱等特點[1]。目前，云南卡蒂姆咖啡種植面積約占全省咖啡總面積的95%以上，支撐起云南咖啡產業(yè)排行全國第一的地位。生長在高海拔的卡蒂姆咖啡豆，在2012年的杯評結果中，曾被評價為香氣強，有特殊香味，酸味好，果酸強，苦味好，口感醇厚豐富，回甘強，整體口感較好[2]。這些風味的形成與有機酸有著密切的關聯(lián)，咖啡豆中苦、澀、酸、甜等味道主要由非揮發(fā)性酚酸類有機酸決定：檸檬酸、酒石酸會產生酸味[3]，蘋果酸會導致酸澀味[4]，其他有機酸則主要產生苦味[5]，蘋果酸、檸檬酸這些有機酸引起的酸味，能讓人產生愉快的感覺。這些咖啡多酚能改善微血管壁的通透性，增強血管的抵抗能力及在受損后的自我修復能力，增強毛細血管的彈性?？Х榷喾幽芘c多種細菌的蛋白質結合，使蛋白質凝固而導致細菌死亡[6]。L-蘋果酸還具有抗疲勞[7-8]、保護心臟[g]、降低抗癌藥物毒副作用的功能[10]。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸在咖啡豆中含量并不高，其總量約占2.5%[11]，有關云南咖啡品質的研究，多集中于功能性成分方面的研究，如咖啡因[12-13]、綠原酸[14-15]、胡蘆巴堿[18]及揮發(fā)性香氣成分[17]，而對咖啡中有機酸含量研究較少，其測定方法的研究也有待探究。本文通過超聲提取、小柱凈化，高效液相色譜儀檢測的方式，能有效富集有機酸含量，增加檢驗的靈敏度，為云南小?？Х鹊钠焚|研究、質量體系建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 咖啡生豆樣品

云南省咖啡的種植主要集中在保山市、普洱市、臨滄市、德宏州，2016年此4個州市的種植面積約占全省的92% [18]，故分別采自保山市、普洱市、臨滄市、德宏州4個州市的咖啡種植基地的卡蒂姆咖啡豆作為樣品進行檢測。

1.1.2 儀器及試劑

戴安U3000高效液相色譜儀（配置DAD檢測器）;MS205DU電子分析天平（瑞士METTLERROLEDD公司）;EXceed-AC-24超純水機（成都康寧實驗專用純水設備）;WF-1200MH超聲波清洗儀（寧波海曙五方超聲設備有限公司）;TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器廠）MTN-2800W氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

強陰離子固相萃取柱（SAX）：1000 mg/6mL（購自迪馬科技）。甲醇（色譜級，天津市光復精細化工研究所）;磷酸（購自美圈TEDIA）。標準品：L-蘋果酸（批號：20160820;純度：99.0%）、DL酒石酸（批號：20161227;純度：99.9%）、檸檬酸（批號：T1703130;純度：99.8%）、乳酸（批號：T160096;純度：88.2%）、單寧酸（批號：20161228;純度：98.2%）、富馬酸（批號：T160077;純度：99.9%）均購自北京壇墨質檢科技有限公司，琥珀酸（批號：16985000;純度：99.5%）購自Dr.EhrenstorferGmbH。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

Aglient ZORBAX SB-Aq C₁₈柱（粒徑5μm，柱長250 mm×4.5 mm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫;流速：0.8 mL/min;檢測波長：210 nm;柱溫：35℃;進樣量：10μL。洗脫條件見表1，液相色譜圖見圖1。

1.2.2 標準品的制備

取L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加0.1%的磷酸水溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合對照溶液（L-蘋果酸1.6940 mg/mL，DL-酒石酸0.8180 mg/mL，檸檬酸5.0660mg/mL，乳酸0.8960mg/mL，單寧酸0.1032 mg/mL，富馬酸0.0126mg/mL，琥珀酸0.4048mg/mL）。

1.2.3 供試品溶液的制備

咖啡豆研磨成粉末（過0.45 mm篩），稱取咖啡豆粉末0.7～0.8g（精確至0.0001g），置于50 mL容量瓶中，加入40℃蒸餾水約40 mL， 40℃下超聲提取30 min，冷卻至室溫，定容，混勻。4000r/min離心10 min，上清液過濾，取25 mL濾液全部轉移至經過預活化的SAX固相萃取柱中（使用前依次用5 mL甲醇、5mL水活化），控制流速在1mL/min，棄去流出液。用5mL水淋洗凈化柱，棄去流出液，再用10 mL磷酸-甲醇（2%磷酸甲醇溶液）洗脫，控制流速在1mL/min，收集洗脫液，氮吹儀吹干洗脫液，用2.0mL 0.1%磷酸水溶液溶解殘渣后，渦旋混勻，過0.45μm濾膜后，待測。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性關系

以標準品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行回歸分析，得L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸的線性回歸方程，見表2。結果顯示，L-蘋果酸在0.0847-1.6940mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為0.9999;DL-酒石酸在0.0409～0.8180mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為0.9999;檸檬酸在0.2533-5.0660mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為1.0000;乳酸在0.0448～0.8960 mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為0.9999;單寧酸在0.0052～0.1032mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為0. 999 7：富馬酸在0.0006-0.0126mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為1.0000;琥珀酸在0.0202～0.4048mg/mL線性關系良好，相關系數(shù)r為0.9999。

1.2.4.2 精密度

精密吸取混合標準品溶液10μL，按1.2.1色譜條件，連續(xù)進樣6針，以L-蘋果酸、DL-酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸的峰面積作為考察指標，計算RSD值。

1.2.4.3 重復性

稱取同一咖啡豆供試品6份，按1.2.3的方法制成供試品溶液，并進樣，分別計算6份供試品中L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸含量的RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性

分別稱取同一咖啡豆供試品溶液1份，按1.2.1色譜條件，分別于配置0、2、4、8、12、16和24 h進樣，以L-蘋果酸、DL酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸的峰面積作為考察指標，計算RSD值。

1.2.4.5 加樣回收率

分別精密稱取7種有機酸對照品適量，加入蒸餾水分別制成含L-蘋果酸1.02mg/mL、DL-酒石酸0.05mg/mL、檸檬酸3.50mg/mL、乳酸0.25mg/mL、單寧酸0.03mg/mL、富馬酸0.007mg/mL、琥珀酸0.2mg/mL的混合對照品溶液。精密稱取已知7種有機酸含量的咖啡豆粉末0.300g，共9份。分別加入混合對照品溶液1.5、2和2.5 mL，各3份，混勻。按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按色譜條件測定，計算回收率及RSD值。L-蘋果酸的平均回收率為91.22%， RSD為1.75%; DL-酒石酸的平均回收率為86.31%， RSD為2.65%;檸檬酸的平均回收率為95.23%，RSD為0.98%;乳酸的平均回收率為88.43%， RSD為1.84%;單寧酸的平均回收率為87.27%， RSD為2.38%;富馬酸的平均回收率為94.52%，RSD為1.03%;琥珀酸的平均回收率為86.77%， RSD為2.54%。符合定量測定要求，表明本法準確可靠。

2 結果與分析

2.1 7種有機酸含量

精密稱取不同產地的咖啡豆粉末0.75g，各3份，按供試品項制成供試品溶液，測定7種有機酸的含量，求平均值，結果見表3。

保山市、臨滄市、普洱市、德宏州的咖啡豆（品種均為卡蒂姆）進行有機酸的含量測定結果顯示：7中有機酸中含量最高的為檸檬酸，含量在9.718～11.584 mg/g;其次為L-蘋果酸，含量在2.256～3.654 mg/g; DL-酒石酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸含量較低，均<1.0 mg/g。不同產地的咖啡豆中各組分在含量上存在一定差異，但在總量上無顯著差異。

2.2 精密度、重復性、穩(wěn)定性

實驗結果（表4）顯示：L-蘋果酸、DL-酒石酸、檸檬酸、乳酸、單寧酸、富馬酸、琥珀酸的RSD值均<1.0%.表明儀器精密度良好。

各成分的RSD值在0.79%-1.51%，表明該供試品制備方法重復性較好。

實驗結果顯示，供試品溶液在24h內各組分峰面積的RSD值在0.95%～1.83%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

3 討論與結論

3.1 討論

在試驗中，對多個色譜條件進行了考察。包括對供試品提取溶劑的選擇：對甲醇水的不同配比，0.1%的磷酸溶液及40℃蒸餾水的提取效果進行了比較，結果0.1%的磷酸溶液及40℃蒸餾水的提取效果較好，提取率相等，最終選擇40℃蒸餾水為提取溶劑;對《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》[19]中供試品溶液的制備進行了優(yōu)化：增加了超聲提取，使得有機酸的溶出更加充分;將添加乙醇濃縮的過程省去，改為離心，過濾，取過濾液直接上柱的方式，不僅節(jié)約了時間，還減少了樣品的損失，提高了回收率;洗脫液采取氮吹濃縮的方式，較旋轉蒸發(fā)儀的濃縮方式，顯著減少了測定成分的損失;對色譜條件進行了細化，使得色譜分離條件更加適合咖啡樣品。

3.2 結論

有機酸是咖啡豆的重要組成部分，作為咖啡的風味物質，對咖啡的口感、質量起著關鍵性作用。故對咖啡質量評價時，應增加有機酸的含量指標，能更加全面、科學地評價咖啡的品質。本實驗建立的HPLC方法，樣品中各被組分的色譜峰基本達到基線分離，并且通過對方法學的考察，顯示該分析方法準確、穩(wěn)定、重復性好，適用于咖啡中有機酸的分離、鑒定及含量測定。

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