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    血液系統(tǒng)條件性DNMT3B基因敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定*

    2018-03-05 09:05:03李福興胡超何薇喬曉紅謝曉恬
    關(guān)鍵詞:小鼠

    李福興,胡超,何薇,喬曉紅,謝曉恬

    (1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院 兒科,上海 200065;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科,上海 200032)

    抑癌基因失活可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,而啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因沉默失活的常見(jiàn)機(jī)制之一,該現(xiàn)象廣泛地存在于多種惡性腫瘤中[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中一種最為重要的修飾,是通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)來(lái)催化和維持。DNMTs包括 DNMT1,DNMT2,DNMT3A,DNMT3B,后2個(gè)在哺乳動(dòng)物DNA甲基化中起主要催化作用[2]。目前研究發(fā)現(xiàn),DNMT3B在部分MDS及急性髓系白血病中呈高表達(dá)水平,且高表達(dá)患者生存期較短,化療療效不佳,預(yù)后不良,提示DNMT3B在血液腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展起重要作用[3-6]。通過(guò)基因敲除是研究基因功能的主要手段之一,目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)在血液系統(tǒng)條件性敲出DNMT3B基因小鼠模型的報(bào)道,國(guó)外僅有利用Cre/loxP系統(tǒng)在細(xì)胞水平敲出DNMT3B基因的研究[7],也有可以在腸道組織敲除DNMT3B小鼠模型相關(guān)研究[8],尚無(wú)可以條件性在血液系統(tǒng)敲出DNMT3B基因小鼠模型的報(bào)道。本課題組利用引進(jìn)的DNMT3Bflox/flox小鼠,與Mx1-Cre小鼠交配,成功構(gòu)建可以在血液系統(tǒng)條件性敲除DNMT3B基因的小鼠,并進(jìn)行敲除后鑒定,為研究DNMT3B在血液腫瘤中的作用提供動(dòng)物模型。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    DNMT3Bflox/flox小鼠 [從 Fan Guoping教授(David Geffen School of Medicine,UCLA)獲得 ],Mx1-Cre小鼠(由伊利諾伊大學(xué)芝加哥校區(qū)血液腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室保存繁育),均為C57BL/6背景。所有動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖均在伊利諾伊大學(xué)芝加哥校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

    1.2 小鼠飼養(yǎng)和繁殖

    按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng),環(huán)境溫度控制在20~25℃,濕度控制在40%~70%,小鼠飼料、墊料和飲水均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理,墊料1周更換1次。采用1只雄鼠和2只雌鼠同居的方式進(jìn)行繁殖。母鼠孕期為19~21 d,哺乳期為20~22 d。

    1.3 方法

    1.3.1 小鼠構(gòu)建策略與流程 DNMT3Bflox/flox小鼠,是以DNMT3B基因的16~19號(hào)外顯子作為靶基因,在其兩端插入loxP位點(diǎn)(見(jiàn)圖1A),與表達(dá)Cre酶的Mx1-Cre工具鼠(見(jiàn)圖1B)交配后獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+,通過(guò)注射pI-pC注射誘導(dǎo)Cre重組酶表達(dá),切除2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列,從而實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除。

    1.3.2 構(gòu)建流程 DNMT3Bflox/flox小鼠與Mx1-Cre+小鼠交配后產(chǎn)生DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-2種子代,再用DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-與DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+雜交產(chǎn)生子代,最后通過(guò)PCR反應(yīng)鑒定其基因型(見(jiàn)圖1C)。

    圖1 DNMT3B敲除小鼠模型構(gòu)建流程

    1.3.3 小鼠基因型鑒定 剪取4周齡小鼠尾尖2~5 mm,置于1.5 ml Eppendorf管中,每管加入鼠尾裂解緩沖液(direct PCR lysis reagent,Viagen Biotech Inc)100 μl和 蛋 白 酶 K(proteinase K,Sigma-Aldrich)5 μl,55℃震蕩裂解過(guò)夜;然后85℃,45 min滅活蛋白酶K;室溫,12 000 r/min離心,5 min,取上清做模板可用于PCR分析。使用Sigma公司合成的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。見(jiàn)表1。

    反應(yīng)體系(10 μl):10×Titanium Taq Buffer 1 μl,模板 DNA 1 μl,正反向引物各 0.1 μl,50×Titanium Taq Polymerase 0.2 μl,4 μmol/L dNTP 0.5 μl,雙蒸水補(bǔ)足至10 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min;95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s,33個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min,置入4℃保存?zhèn)溆?,取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)擴(kuò)增條帶確定小鼠子代基因型。

    表1 基因型鑒定的引物

    使用Floxed引物擴(kuò)增,凡是能擴(kuò)增出2條帶(270和406 bp)者均為DNMT3Bflox/+,而只能擴(kuò)增出1條406 bp條帶者基因型必為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+或者DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-;再以Cre通用異物擴(kuò)增,凡是可以擴(kuò)增出301 bp條帶者為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+,即可以用于DNMT3B敲除的小鼠,見(jiàn)表2。

    表2 基因型對(duì)應(yīng)電泳條帶

    1.3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠DNMT3B敲除效能鑒定 由于floxed小鼠在DNMT3B基因的15和16,19和20號(hào)外顯子中間各插入1個(gè)LoxP位點(diǎn),設(shè)計(jì)敲除后鑒定引物primer F’,位于15號(hào)外顯子,如果成功敲除,將可以擴(kuò)增出500 bp左右條帶。對(duì)DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠,通過(guò)隔天腹腔注射聚肌胞苷酸(pI-pC;GE Healthcare)1次,體重10 μg/g,共5次,誘導(dǎo)DNMT3B基因的丟失。pI-pC腹腔注射完成后,第7天處死小鼠取骨髓細(xì)胞,使用DNA提取試劑盒(Puregene Blood Core KitB,QIAGEN)按說(shuō)明書提取DNA,同時(shí)使用3條引物primer F,primer F’,primer R按genotyping體系和條件行PCR證實(shí)DNMT3B的敲除。

    2 結(jié)果

    2.1 DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+小鼠鑒定

    通過(guò)DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+和DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-交配,共產(chǎn)出小鼠13只,分兩步分別進(jìn)行DNMT3Bflox/flox和Mx1-Cre基因型鑒定。

    2.1.1 DNMT3Bflox/flox基因型鑒定 DNMT3Bflox/+小鼠自交所生子代DNMT3Bflox/flox、DNMT3Bflox/+、DNMT3B+/+的基因型鑒定結(jié)果,見(jiàn)圖2:僅可以擴(kuò)增出270 bp條帶的為野生型(如2號(hào)和10號(hào)),可以同時(shí)擴(kuò)增儲(chǔ)270和406 bp的為雜合子(如1,3,6,11,13號(hào)),而僅可以擴(kuò)增出406 bp條帶者為DNMT3Bflox/flox,需要的突變純合子(如4,5,7,8,9,12號(hào))。

    圖2 DNMT3Bflox/flox基因型PCR鑒定結(jié)果

    2.1.2 Mx1-Cre基因型鑒定 Mx1-Cre+及Mx1-Cre-小鼠交配僅可以產(chǎn)出Mx1-Cre+和Mx1-Cre-兩種子代,其中基因型為Mx1-Cre+的子代可以擴(kuò)增出301 bp條帶(如9和12號(hào)),而基因型為Mx1-Cre-的子代無(wú)法擴(kuò)增出條帶(如1-8號(hào),10號(hào)和13號(hào)),在獲得的13只子代小鼠中,只有9號(hào)和12號(hào)攜帶Mx1-Cre基因。見(jiàn)圖3。

    圖3 Mx1-Cre基因型PCR鑒定結(jié)果

    2.1.3 DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+個(gè)體獲得 綜合分析DNMT3Bflox/flox基因型和Mx1-Cre基因型鑒定結(jié)果,確認(rèn)9號(hào)和12號(hào)子鼠基因型為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+,是可以用于敲除DNMT3B的工具鼠。

    2.2 Dnmt3B敲除鑒定

    對(duì)DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠,隔天注射5次pI-pC后,取鼠尾組織行PCR進(jìn)行基因型鑒定,由于可以敲除DNMT3B基因,故能擴(kuò)增出500 bp的片段,用作實(shí)驗(yàn)組對(duì)象。而DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-小鼠無(wú)法敲除DNMT3B基因,只能擴(kuò)增出406 bp的片段,可用作對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

    圖4 DNMT3B敲除后PCR鑒定結(jié)果

    3 討論

    在哺乳動(dòng)物基因組中,CpG島甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾,不僅對(duì)個(gè)體正常發(fā)育起重要作用,還可以影響基因表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[9]。甲基化調(diào)控需要DNMTs的參與,其中DNMT3A和DNMT3B負(fù)責(zé)從頭甲基化,影響DNA的甲基化水平并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[10]。R OBERTSON等研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤患者DNMT3A、DNMT1及DNMT3B表達(dá)上調(diào),且DNMT3B的表達(dá)水平升高最為顯著[11],提示DNMT3B可能在惡性腫瘤發(fā)病中起重要作用。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn),DNMT3B基因高表達(dá)與膀胱癌,胃腸道惡性腫瘤,乳腺癌、肝癌及白血病等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12-15],目前認(rèn)為,DNMT3B可以導(dǎo)致抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化,導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[16-17]。有研究提示,DNMT3B在myc誘發(fā)的淋巴瘤和MLL-AF9誘發(fā)的AML中表現(xiàn)為抑制腫瘤作用,提示其抑癌基因?qū)傩訹18],然而亦有研究顯示在AML患者中,DNMT3B高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[19],提示原癌基因?qū)傩?,故DNMT3B在血液腫瘤中的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    構(gòu)建基因敲除小鼠模型,在全部組織或者特定組織中使某基因功能缺失,是闡明該基因功能最直接有效的手段之一。Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)是目前用于條件性基因敲除中最常用的系統(tǒng)工具之一。LoxP序列來(lái)源于噬菌體P1,而Cre酶是來(lái)源于噬菌體P1的一種蛋白。LoxP序列中的特殊回文結(jié)構(gòu)可以被Cre酶特異性識(shí)別結(jié)合并催化2個(gè)LoxP序列之間的片段發(fā)生同源重組,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該片段的基因敲除。如果將Cre重組酶cDNA通過(guò)基因工程的手段置于組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子之下,可以實(shí)現(xiàn)在特定組織/細(xì)胞特異性表達(dá)Cre,獲得Cre工具小鼠跟Flox小鼠交配之后,可以得到可以在特定組織細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除的小鼠[20]。

    本研究為構(gòu)建DNMT3B基因條件性敲除小鼠,首先從美國(guó)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)DNMT3Bflox/flox小鼠,該小鼠在DNMT3B基因的15和16,19和20號(hào)外顯子中間各插入1個(gè)LoxP位點(diǎn)[21]。通過(guò)與血液系統(tǒng)特異表達(dá)Cre酶的Mx1-Cre小鼠雜交,獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠,用pI-pC誘導(dǎo)Cre酶表達(dá),可以在血液系統(tǒng)敲除DNMT3B核心序列,使得靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠模型的構(gòu)建為研究DNMT3B在正常造血調(diào)控及血液腫瘤中的作用機(jī)制提供合適的工具?;贑re/LoxP系統(tǒng),開發(fā)構(gòu)建其他組織系統(tǒng)特異性CRE表達(dá)小鼠,可以通過(guò)條件敲除DNMT3B研究其在多種腫瘤中的作用機(jī)制。

    志謝:感謝UCLA范國(guó)平教授慷慨提供DNMT3Bflox/flox小鼠,感謝伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校錢志堅(jiān)教授提供Mx1-cre小鼠及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo),感謝黎力平博士對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)指導(dǎo)。

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