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    RNA干擾沉默同源異型基因A5逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞耐藥性的研究*

    2018-03-05 09:05:01高菲劉文君
    關(guān)鍵詞:空白對照白血病耐藥

    高菲,劉文君

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科,四川 瀘州 646000)

    白血?。╨eukemia)是一類造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病,是兒童最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害兒童的健康[1-2],其治療主要是以化療為主的綜合性治療,而耐藥已成為白血病治療的一大阻礙。研究發(fā)現(xiàn),同源盒(homeobox,HOX)基因的過表達(dá)可使細(xì)胞分化成熟障礙、造血能力降低,最終可導(dǎo)致造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。作為HOX基因家族中的一員,HOXA5定位于7號染色體(7p15.2),其表達(dá)主要局限在粒-單核細(xì)胞系。據(jù)報(bào)道,HOXA5基因與腫瘤的耐藥性有關(guān),但其作用機(jī)制不清[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)信號通路異常與白血病的發(fā)生、發(fā)展及其多重耐藥密切相關(guān),其中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是白血病耐藥的重要機(jī)制之一[6-9],其主要參與細(xì)胞的活化、生長及凋亡。研究表明HOX基因與p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化存在相關(guān)性[10]。因此,我們推測HOXA5基因可能通過p38MAPK通路逆轉(zhuǎn)K562/ADM的耐藥性。

    RNA干擾(RNA interferene,RNAi)技術(shù)是雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后引起同向靶基因表達(dá)沉默,具有快速、特異、高效等優(yōu)點(diǎn)[11]。本實(shí)驗(yàn)建立在前期設(shè)計(jì)并合成3條針對HOXA5的特異性有效siRNA序列,并通過相關(guān)檢測方法篩選出對HOXA5表達(dá)抑制效率最佳的1條siRNA序列的基礎(chǔ)上[12-13],通過RNAi技術(shù)沉默HOXA5,探討p38MAPK信號通路在耐藥白血病細(xì)胞中的作用,為耐藥白血病的靶向治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    人白血病耐阿霉素細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞(購自上海信裕生物科技有限公司),阿霉素(購自浙江海正藥業(yè)股份有限工司),RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清(購自美國Hyclone公司),二甲基亞砜(DMSO)(購自美國Sigma公司),100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、總RNA提取試劑盒、CCK8及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(購自碧云天公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(購自日本ToYoBo公司),Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及細(xì)胞周期檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技有限公司),脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(購自美國Invitrogen公司),靶向HOXA5的siRNA序列、陰性對照siRNA序列(杭州艾迪康公司合成),兔抗人HOXA5多克隆抗體一抗(購自英國Abcam公司),兔抗人p38MAPK及p-p38MAPK多克隆抗體一抗(購自美國CST公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    將K562/ADM細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、1 000 ng/ml阿霉素完全培養(yǎng)基中并接種在培養(yǎng)瓶,置于5%二氧化碳CO2的37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)液并傳代,實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞用無ADM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)先分為K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞組。然后以本課題組前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)對K562/ADM細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后再分為3組:實(shí)驗(yàn)組(pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5),陰性對照組(pRNAT-GFP-Neo-siNC),空白對照組(未作任何處理的K562/ADM)。本課題組前期設(shè)計(jì)并合成3條針對HOXA5的特異性有效siRNA序列,并篩選出對HOXA5抑制率最高的1條序列,正向:5'-TTGCGGTCGCTATCCAAATGG-3',反向:5'-CCATT TGGATAGCGACCGCAA-3'[12-13]。根據(jù)此序列合成靶向抑制HOXA5的特異性真核表達(dá)載體pRNAT-GFPNeo-siHOXA5,并設(shè)計(jì)合成陰性對照載體pRNATGFP-Neo-siNC。轉(zhuǎn)染時調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107個/ml接種于6孔板內(nèi),按LipofectamineTM2000說明書將脂質(zhì)體與表達(dá)載體在無血清無抗生素培養(yǎng)基中混合配成轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染K562/ADM細(xì)胞。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。收集上述各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.2 CCK-8檢測 CCK-8實(shí)驗(yàn)采用的ADM的干預(yù)濃度依次為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00及40.00 μg/ml。分別收集上述各組細(xì)胞,經(jīng)不同濃度的ADM干預(yù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml,用微量移液器吸取100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板中,同時設(shè)置對照組和空白調(diào)零組,每組設(shè)3個復(fù)孔,每孔再加10 μl的CCK-8溶液,放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用2 h,在450 nm處用酶標(biāo)儀測量各孔的OD值。求得均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,增殖抑制率=(OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。IC50=Ig-1[Xm-i(∑p-0.5)]。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=對照IC50/實(shí)驗(yàn)IC50。

    1.3.3 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中HOXA5及P38的mRNA表達(dá) 收集上述各組細(xì)胞,用總RNA提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR法擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照基因人GAPDH。HOXA5、p38及GAPDH引物擴(kuò)增片段長度分別為140、130及262 bp,各引物的序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性60 s;95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸45 s,共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-△△Ct的方法進(jìn)行分析,由此表示目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。

    表1 HOXA5、p38及GAPDH引物序列

    1.3.4 Western blot檢測各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達(dá) 分別收集上述各組細(xì)胞,按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞全蛋白。BCA法測蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度取等量蛋白,加5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h,經(jīng) TBST 充分漂洗(5 min,3次),HOXA5、p38及 p-p38多克隆抗體均按1∶1 000稀釋。4℃孵育過夜,充分漂洗后加山羊抗兔二抗按照1∶3 000稀釋,室溫27℃孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。通過Gel-Pro annalyzer軟件分析圖像,以HOXA5、p38及p-p38蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

    1.3.5 Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的K562/ADM,轉(zhuǎn)染24 h后,每組再分為ADM未干預(yù)組及加濃度為2.5 μg/ml的ADM干預(yù)組。用冷PBS將上述細(xì)胞組的細(xì)胞洗2次,調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個 /ml將細(xì)胞重懸于 50 μl的 Binding Buffer,并加入5 μl 7-AAD,室溫27℃,避光染色5~15 min,然后分別加入450 μl Binding Buffer混勻,再加入1 μl Annexin V-PE,室溫27℃,避光染色5~15 min,在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    1.3.6 細(xì)胞周期的檢測 取對數(shù)生長期的K562/ADM,轉(zhuǎn)染24 h后用冷PBS將上述細(xì)胞組的細(xì)胞洗2次,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml,取1 ml的單細(xì)胞懸液去除上清液,用70%的冷乙醇500 μl懸浮細(xì)胞4℃放置2 h或至過夜對細(xì)胞進(jìn)行固定,PBS洗滌去乙醇。加入RNAase 100 μl 37℃水浴30 min。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測定,結(jié)果用Multicycle software進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)數(shù)資料用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞

    用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染K562/ADM細(xì)胞24 h后,在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞,因?yàn)檗D(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒載體pRNA-GFP-Neo-siHOXA5和pRNAT-GFP-Neo-siNC帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因,因此實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組在熒光顯微鏡觀察下出現(xiàn)綠色熒光,而空白對照組未見熒光。見圖1。

    2.2 ADM對各組細(xì)胞的抑制作用

    ADM對各組細(xì)胞均有抑制作用,各組細(xì)胞的IC50比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.325,P=0.000),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50與對照組比較降低(P<0.05)。見表 2。

    2.3 細(xì)胞中HOXA5、p38的mRNA表達(dá)情況

    K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的mRNA表達(dá)高于K562細(xì)胞(P<0.05)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的K562/ADM細(xì)胞后,比較各組細(xì)胞中HOXA5 mRNA的表達(dá)量,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.282和172.900,均P=0.000),重組質(zhì)粒能抑制K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的mRNA表達(dá)(P<0.05),同時p38的mRNA表達(dá)經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.817和34.227,均P=0.001),結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較p38的mRNA表達(dá)增高(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表 3、4 和圖 2。

    圖1 普通倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染的各組K562/ADM細(xì)胞

    表2 ADM作用下各組細(xì)胞IC50的變化

    2.4 各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的表達(dá)情況

    Western blot檢測發(fā)現(xiàn),K562細(xì)胞中HOXA5蛋白的相對表達(dá)量低于K562/ADM細(xì)胞(P<0.05)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后比較各組中HOXA5蛋白及p-p38的表達(dá),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1722.480和115.433,均P=0.000),實(shí)驗(yàn)組中HOXA5蛋白被抑制(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中p-p38的蛋白相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,siRNA能特異性沉默K562/ADM中的HOXA5基因,并使p38激活為p-p38,但對p38的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.153,P=0.074)。見表5和圖3。

    表3 HOXA5的mRNA表達(dá) (±s)

    表3 HOXA5的mRNA表達(dá) (±s)

    相對表達(dá)量(RQ=2-ΔΔCt)實(shí)驗(yàn)組 0.31±0.12 0.22±0.09陰性對照組 1.35±0.10 0.99±0.04空白對照組 1.37±0.06 1.00 K562 0.58±0.11 0.42±0.11 F值 122.282 172.900 P值 0.000 0.000組別 HOXA5 mRNA(目的基因/內(nèi)參照基因)

    表4 p38的mRNA表達(dá) (±s)

    表4 p38的mRNA表達(dá) (±s)

    相對表達(dá)量(RQ=2-ΔΔCt)實(shí)驗(yàn)組 1.17±0.07 3.26±0.59陰性對照組 0.38±0.06 1.06±0.29空白對照組 0.37±0.05 1.00 F值 152.817 34.227 P值 0.000 0.001組別 P38 mRNA(目的基因/內(nèi)參照基因)

    圖2 HOXA5、p38及GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.5 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞的凋亡情況

    比較ADM未干預(yù)及ADM干預(yù)中各組細(xì)胞的凋亡,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.606和423.492,P=0.003和0.000)。ADM未干預(yù)及干預(yù)中實(shí)驗(yàn)組的凋亡率與對照組相比增高(P<0.05);ADM干預(yù)中各組細(xì)胞的凋亡率高于ADM未干預(yù)(P<0.05),而ADM干預(yù)與ADM未干預(yù)中陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6和圖4。

    2.6 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞的周期變化

    各組細(xì)胞的G0/G1期和S期比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.783和70.549,均P=0.000)。與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組G0/G1期升高(P<0.05),而 S期降低(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G2/M期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.568,P=0.594)。見表7和圖5。

    表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達(dá) (%,±s)

    表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達(dá) (%,±s)

    圖3 各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達(dá)(Western blot)

    表6 ADM干預(yù)下各組細(xì)胞的凋亡率 (%,±s)

    表6 ADM干預(yù)下各組細(xì)胞的凋亡率 (%,±s)

    圖4 細(xì)胞的凋亡情況 (FCM法)

    圖5 細(xì)胞周期的變化 (FCM法)

    表7 沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞周期的分布情況(%,±s)

    表7 沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞周期的分布情況(%,±s)

    組別 G0/G1 G2/M S實(shí)驗(yàn)組 46.85±2.01 10.82±2.62 42.93±1.68陰性對照組 25.52±2.29 12.21±2.51 62.60±2.26空白對照組 27.55±1.22 11.85±3.00 60.26±2.59 F值 115.783 0.568 70.549 P值 0.000 0.594 0.000

    3 討論

    哺乳動物的HOX基因在結(jié)構(gòu)上分為A、B、C、D 4個簇,依次定位于7、17、12及2號染色體上,其按照線性順序進(jìn)行表達(dá)并參與造血細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控[14]。據(jù)報(bào)道,HOX基因在許多髓系白血病樣品中高表達(dá),但是其表達(dá)的模式和相關(guān)監(jiān)管機(jī)制并不清楚[15]。在MLL患者中能檢測到上調(diào)的HOXA基因,HOXA異常表達(dá)是造血細(xì)胞正常分化的一大障礙[16]。而HOXA5基因作為HOXA族中的一員,對白血病的發(fā)生、發(fā)展同樣具有重要影響。FULLER等[17]發(fā)現(xiàn),過度表達(dá)HOXA5的K562細(xì)胞株紅細(xì)胞分化被抑制,抑制HOXA5表達(dá)有助于增高紅細(xì)胞祖細(xì)胞的分化及成熟。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HOXA5基因在K562及K562/ADM細(xì)胞中高表達(dá),且其在K562/ADM中的表達(dá)高于K562細(xì)胞,進(jìn)一步證明HOXA5的過表達(dá)與白血病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

    兒童慢性髓系白血病的5年生存率(5-year event-free survival,EFS)為44%[18],復(fù)發(fā)和耐藥是影響其生存率的重要原因,因此,進(jìn)一步研究髓系白血病的耐藥機(jī)制具有重要意義[19]。有研究表明,運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制HOXA7基因的表達(dá)在一定程度上可逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞U937的多重耐藥[20]。據(jù)報(bào)道,通過降低和提高細(xì)胞中HOXA5的表達(dá),觀察肺癌細(xì)胞對小細(xì)胞肺癌(SCLC)常用化療藥物敏感性的變化發(fā)現(xiàn)HOXA5可能參與SCLC耐藥性的產(chǎn)生[5]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的表達(dá)增高,RNAi特異性沉默K562/ADM細(xì)胞中的HOXA5基因后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對ADM的IC50較對照組的IC50降低2.55倍。結(jié)果提示,HOXA5基因與白血病細(xì)胞的耐藥性相關(guān),沉默HOXA5基因能在一定程度上逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性,與上述報(bào)道[20,5]的研究結(jié)果相似。

    CUI等[10]應(yīng)用TGF-β2抑制性抗體及p38抑制劑等干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOXA10能降低TGF-β2及MMP-3的表達(dá)并抑制p38的活化,表明HOX基因與p38的活化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中有效沉默K562/ADM細(xì)胞中的HOXA5基因后,經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的p38 mRNA及p-p38蛋白表達(dá)增高。結(jié)果提示,沉默HOXA5能增強(qiáng)p38mRNA的表達(dá),并能激活p38使其磷酸化為p-p38,與CUI等[10]的研究結(jié)果相似。

    結(jié)果顯示ADM未干預(yù)及ADM干預(yù)中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率較對照組增高;并且ADM干預(yù)組中各組細(xì)胞的凋亡率高于ADM未干預(yù)組。在細(xì)胞周期檢測中,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較G0/G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例相應(yīng)降低,說明抑制HOXA5的表達(dá)能減緩G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,減少細(xì)胞分裂增殖。以上結(jié)果提示沉默HOXA5基因后,能在一定程度上能增強(qiáng)細(xì)胞對ADM的敏感性,阻滯細(xì)胞的G0/G1期,減少細(xì)胞分裂增殖,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

    綜上所述,HOXA5與K562/ADM細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。沉默HOXA5在一定程度上能逆轉(zhuǎn)白血病的多重耐藥,其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)p38的mRNA表達(dá)并使其激活為p-p38。RNAi技術(shù)沉默HOXA5基因后,激活p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的耐藥性可能成為耐藥白血病治療的新靶點(diǎn)。

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