miRNA-381對胃癌細胞增殖和侵襲的影響及機制*

李麗平，葉俊，吳舜，馬松林，周艷玲

（1.武漢科技大學醫(yī)學院 生理與病理生理學系，湖北 武漢 430014；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院后湖院區(qū) 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430014）

胃癌是致死率很高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2012年全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病人數(shù)約951，000例，死亡人數(shù)高達723，000例[1]。同時胃癌也是一種高度異質性疾病，侵襲和轉移能力極強，具有復雜的分子和組織學特征[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是在多細胞生物中發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)性RNAs，在人體內(nèi)廣泛分布，通過靶向mRNA 3’UTR觸發(fā)翻譯抑制或RNA降解[3]。越來越多的研究表明，miRNA的改變?nèi)缛笔АU增、突變或表觀遺傳沉默等與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移有關[4]。由于miRNA在惡性腫瘤細胞中普遍表達異常，表明miRNAs控制抑癌基因或促癌基因，亦或是被其控制，因此miRNA的發(fā)現(xiàn)為尋找腫瘤早期診斷特異性分子標志物及基因靶向治療提供新的方向[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與胃癌的發(fā)生密切相關，如Let-7[5]、miRNA-101[6]、miRNA-130b 等[7]。miRNA-381是miRNA家族一員，被證實參與膠質瘤[8]、腎癌[9]及乳腺癌等[10]腫瘤生長。但是miRNA-381在胃癌中的研究還未有涉及，本研究觀察miRNA-381在胃癌細胞系及正常胃上皮細胞系中的表達及過表達miRNA-381對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞系AGS、MGC-803、Hs746T及BSG823和正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1（購自北京協(xié)和醫(yī)學院），RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶及Trizol（購自美國BD公司），肝受體類似物1（liver receptor homolog-1，LRH-1）和扭曲相關蛋白1（twistrelated protein-1，Twist1）一抗（購自cell signaling公司），羊抗兔二抗（購自武漢博士德生物科技有限公司），miRNA-381 mimics及scramble（由上海吉瑪生物科技有限公司合成）。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染及分組

將胃癌細胞系 AGS、MGC-803、Hs746T及BSG823和正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1加入到RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)48 h后消化傳代。將AGS細胞系分成兩組，陰性對照組和miRNA-381模擬物組，采用LipofectamineTM2000 reagent（Invitrogen，USA）分別轉染 miRNA-381 scramble及 mimics，miRNA-381 mimics轉染序列：miRNA-381 mimics 正向引物：5'-UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU-3'，反向引物 ：5'-AGAGAGCUUGCCCUUGUAUAUU-3'；miRNA-381 scrramble正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3'，反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3'。

1.3 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應

①miRNA-381表達量測定：用All-in-One micro RNA抽提試劑盒提取AGS、MGC-803、Hs746T、BSG823和RGM-1細胞系的miRNAs，ABI Prism 7700 system 的 SYBR Green Reagents（TaKaRa，日本 Tokyo）實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），在 ABI 7500 qRTPCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miRNA-381相對表達水平；②LRH-1和Twist1 mRNA表達量測定。

提取miRNA-381模擬物組和陰性對照組兩組細胞總RNA后，在ABI 7500實時定量PCR儀中，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列：LRH-1，正向引物：5'-CT GATACTGGAACTTTTGAA-3'，反向引物：5'-CTTCATT TGGTCATCAACCTT-3'；Twist1，正向引物：5'-AGAAGT CTGCGGGCTGTGGCG-3'，反向引物：5'-GAGGGCAGC GTGGGGAGATC-3'；GAPDH正向引物：5'-GAAGGT GAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物：5'-GAAGATGGTG ATGGGATTT-3'。使用 2-ΔΔCt方法定量，量化 LRH-1和Twist1 mRNA相對表達水平。

1.4 細胞增殖實驗

采用CCK-8法，將陰性對照組和miRNA-381模擬物組細胞，按2×103個/孔接種于96孔板上，按200 μl每孔標準培養(yǎng)，在培養(yǎng)后0、24、48、72及96 h后，按每孔20 μl的標準加入CCK-8溶液，用酶標儀在490 nm處的波長下測定各孔的光密度（optical density，OD）值，繪制細胞增殖曲線。

1.5 細胞侵襲實驗

采用Transwell法，將陰性對照組和miRNA-381模擬物組兩組細胞各取2×104個細胞，接種于碳酸磷脂表面，于37℃下培養(yǎng)24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細胞結合并用0.2%結晶紫溶液染色，隨機取10個視野（×200），計算穿過膜的細胞數(shù)量，重復3次該實驗，并取均值。

1.6 Western blot

將陰性對照組和miRNA-381模擬物組兩組細胞經(jīng)RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉膜，加入LRH-1、Twist 1及GAPDH一抗，濃度為1∶200，一抗孵育過夜，二抗（1∶500）于37℃孵育4 h，PBST漂洗3次，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白印跡條帶進行定量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/GAPDH，實驗重復3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Graph軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-381在胃癌及正常胃黏膜上皮細胞系中的表達

qRT-PCR檢測miRNA-381的表達量，正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1的miRNA-381相對表達量為1.0，在胃癌細胞系AGS中相對表達量為（0.19±0.03），MGC-803 為（0.29±0.03），Hs746T 為（0.47±0.06），BSG823為（0.56±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計 學 意 義（F=93.260，P=0.000）；經(jīng) LSD-t檢 驗，miRNA-381在胃癌細胞系AGS、MGC-803、Hs746T及BSG823中相對表達量均低于RGM-1（P＜0.05）。見圖1。

2.2 miRNA-381過表達抑制胃癌細胞AGS增殖

在AGS細胞中過表達miRNA-381模擬物，用qRT-PCR檢測其相對含量變化，miRNA-381模擬物組miRNA-381相對表達量為（10.5±0.9），陰性對照組為（1.0±0.03），miRNA-381模擬物組的miRNA-381表達量高于陰性對照組（t=18.272，P=0.000）。轉染 后 0、24、48、72及 96 h，miRNA-381模 擬 物組vs對照組的OD 450 nm值分別為（0.32±0.03 vs 0.31±0.04）（t=0.346，P=0.373），（0.53±0.06 vs 0.55±0.07）（t=-0.375，P=0.363)，（1.05±0.09 vs 1.10±0.12）（t=-0.577，P=0.297），（1.49±0.15 vs 2.36±0.25）（t=-5.168，P=0.003）及（2.22±0.21 vs 3.55±0.29）（t=-6.433，P=0.000）。見圖 2。

2.3 miRNA-381過表達抑制胃癌細胞AGS侵襲

Transwell實驗示，200倍視野下，陰性對照組侵襲細胞數(shù)為（79.6±7.2）個，miRNA-381模擬物組侵襲細胞數(shù)為（31.70±4.2）個，miRNA-381模擬物組侵襲細胞數(shù)少于陰性對照組（t=9.953，P=0.002）。見圖3。

2.4 miRNA-381下調(diào)LRH-1和TWIST1的表達

圖1 miRNA-381在胃癌細胞系及正常胃黏膜上皮細胞系中的表達

圖2 miRNA-381過表達抑制胃癌細胞AGS增殖

qRT-PCR示，miRNA-381模擬物組LRH-1 mRNA相對表達量為（0.33±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組LRH-1 mRNA相對表達量低于陰性對照組（t=25.948，P=0.000）；見圖4A；miRNA-381模擬物組Twist1 mRNA相對表達量為（0.45±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組Twist 1 mRNA相對表達量低于陰性對照組（t=-21.301，P=0.000），見圖 4B。

Western blot示，miRNA-381模擬物組LRH-1蛋白相對表達量為（0.39±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組LRH-1蛋白相對表達量低于陰性對照組（t=-23.625，P=0.000）；見圖4C、4D；miRNA-381模擬物組Twist 1蛋白相對表達量為（0.51±0.05），陰性對照組為（1.0±0.01），miRNA-381模擬物組Twist 1蛋白相對表達量低于陰性對照組（t=-16.644，P=0.000），見圖4C和4E。

圖3 miRNA-381過表達抑制胃癌細胞AGS侵襲

圖4 miRNA-381下調(diào)LRH-1和TWIST 1的表達

3 討論

盡管過去幾十年中，胃癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)下降，但是胃癌仍然是世界上第4大常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的第2大原因[11]。胃癌患者預后較差，5年生存率低于30%，大多數(shù)胃癌患者的死亡是由于轉移或復發(fā)導致[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過調(diào)控一系列侵襲和轉移相關基因，在腫瘤的侵襲和轉移過程中起到關鍵作用[12]。在本研究顯示，在正常胃上皮細胞系中miRNA-381表達高于胃癌細胞系。更重要的是，過量表達miRNA-381能抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移能力，表明miRNA-381在胃癌浸潤、侵襲及轉移中發(fā)揮抑癌基因作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-381過表達引起LRH-1蛋白表達水平下降。研究證實，LRH-1是miRNA-381的靶蛋白，miRNA-381通過直接靶向LRH-1 3'-UTR抑制肝癌細胞生長和侵襲[13]。在結腸癌中，miRNA-381表達下降上調(diào)LRH-1蛋白水平促進結腸癌細胞生長、增殖、遷移[14]。意味著LRH-1活性的增加與胃癌細胞迅速增長和增殖有一定關聯(lián)。細胞周期蛋白D1和E1（Cyclin D1和Cyclin E1）是細胞周期G1期關鍵蛋白，能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）組成Cyclin D1-CDK4/6和Cyclin E1-CDK2復合物參與調(diào)控G1/S期轉變[15]。Cyclin D1已被證實是一種原癌基因，其過度表達導致細胞增殖失控和惡化[16]。Cyclin E1在多種腫瘤組織中表達較高，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[17]。C-Myc基因也是一個公認的原癌基因，在多種腫瘤中被激活，其靶基因參與腫瘤細胞生長、凋亡和代謝等過程中[18]。研究發(fā)現(xiàn)，LRH-1與β-catenin能夠協(xié)同共激活下游基因Cylin D1、Cyclin E1及c-Myc的表達，促進腸腫瘤細胞增殖[19]。已有研究證實，LRH-1基因沉默降低Cylin D1、Cyclin E1及c-Myc的表達水平，抑制胰腺癌細胞增殖[19]。本研究中，miRNA-381表達上升導致LRH-1蛋白表達下調(diào)，其作用機制可能是miRNA-381直接綁定結合LRH-1 3'-UTR，在轉錄后水平負調(diào)控LRH-1基因的表達。筆者推測，LRH-1與β-catenin協(xié)同共激活Cyclin D1、Cyclin E1及c-Myc的作用減弱，使G1/S期轉換受抑制，導致細胞阻滯于G0/G1期，進入S期和G2期的細胞數(shù)目減少，同時使c-Myc靶基因表達失控，降低胃癌細胞增殖和侵襲能力。

在腫瘤轉移過程中，細胞間黏附和連接能力降低，導致腫瘤細胞脫落并遷移到其他組織、器官是腫瘤轉移的重要環(huán)節(jié)[20]。上皮間質轉化是上皮細胞表型向間質細胞表型轉變的過程，主要特征為細胞黏附分子的表達減少、細胞骨架及形態(tài)改變，在腫瘤浸潤和遷移過程中起關鍵作用[21]。轉錄因子Twist-1是上皮間質轉化的重要調(diào)節(jié)因子，Twist-1表達上升誘導發(fā)生該過程，參與腫瘤侵襲和轉移發(fā)生機制[22]。研究發(fā)現(xiàn)，Twist-1 3'-UTR含有大量miRNAs的調(diào)控元件，包括miRNA靶點，多個miRNAs被證實能夠抑制Twist-1的翻譯，如miRNA-145a-5p、miRNA-151-5p等[23]。據(jù)報道，miRNA-106b通過靶向Twist-1調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞系上皮間質轉化[24]，在結直腸癌中miRNA-381通過直接靶向Twist-1發(fā)揮抑癌作用[25]。在本研究中，miRNA-381可能通過特異性結合Twist-1 3'-UTR靶位點，降低Twist1基因翻譯水平，抑制胃癌細胞上皮間質轉化，從而阻礙細胞轉移和侵襲。

綜上所述，miRNA-381通過抑制LRH-1和Twist-1蛋白的表達，調(diào)控細胞周期和上皮間質轉化，進而抑制胃癌細胞增殖和侵襲。miRNA-381在胃癌中功能及其作用機制的鑒定，有望成為腫瘤早期診斷標志物及基因靶向治療的新靶點。

[1]FERLAY J, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. International journal of cancer,2015, 136(5): 359-386.

[2]Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J]. Nature,2014, 513(7517): 202-209.

[3]Iorio M V, Ferracin M, Liu C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J]. Cancer research, 2005,65(16): 7065-7070.

[4]CROCE C M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J]. Nature reviews genetics, 2009, 10(10):704-714.

[5]OHSHIMA K, INOUE K, FUJIWARA A, et al. Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line[J]. PloS one,2010, 5(10): e13247.

[6]WANG H J, RUAN H J, HE X J, et al. MicroRNA-101 is downregulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion[J]. European journal of cancer, 2010, 46(12): 2295-2303.[7]LAI K W, KOH K X, LOH M, et al. MicroRNA-130b regulates the tumour suppressor RUNX3 in gastric cancer[J]. European Journal of Cancer, 2010, 46(8): 1456-1463.

[8]TANG H, LIU X, WANG Z, et al. Interaction of hsa-miR-381 and glioma suppressor LRRC4 is involved in glioma growth[J]. Brain research, 2011, 1390: 21-32.

[9]CHEN B, DUAN L, YIN G, et al. miR-381, a novel intrinsic WEE1 inhibitor, sensitizes renal cancer cells to 5-FU by up-regulation of Cdc2 activities in 786-O[J]. Journal of Chemotherapy, 2013, 25(4):229-238.

[10]MING J, ZHOU Y, DU J, et al. miR-381 suppresses C/EBPαdependent Cx43 expression in breast cancer cells[J]. Bioscience reports, 2015, 35(6): e00266.

[11]ZHANG G, ZHAO X, LI J, et al. Racial disparities in stagespeci fi c gastric cancer: analysis of results from the Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) program database[J].Journal of Investigative Medicine, 2017: jim-2017-000413.

[12]ZHANG Y, WANG Z, CHEN M, et al. MicroRNA-143 targets MACC1 to inhibit cell invasion and migration in colorectal cancer[J]. Molecular cancer, 2012, 11(1): 23.

[13]ZHANG Q, ZHAO S, PANG X, et al. MicroRNA-381 suppresses cell growth and invasion by targeting the liver receptor homolog-1 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncology reports, 2016, 35(3):1831-1840.

[14]LIANG Y, ZHAO Q, FAN L, et al. Down-regulation of MicroRNA-381 promotes cell proliferation and invasion in colon cancer through up-regulation of LRH-1[J]. Biomedicine &Pharmacotherapy, 2015, 75: 137-141.

[15]FINN R S, CROWN J P, LANG I, et al. The cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib in combination with letrozole versus letrozole alone as fi rst-line treatment of oestrogen receptorpositive, HER2-negative, advanced breast cancer (PALOMA-1/TRIO-18): a randomised phase 2 study[J]. The lancet oncology,2015, 16(1): 25-35.

[16]PARONETTO M P, CAPPELLARI M, BUSà R, et al. Alternative splicing of the cyclin D1 proto-oncogene is regulated by the RNA-binding protein Sam68[J]. Cancer research, 2010, 70(1): 229-239.

[17]KEYOMARSI K, TUCKER S L, BUCHHOLZ T A, et al. Cyclin E and survival in patients with breast cancer[J]. New England Journal of Medicine, 2002, 347(20): 1566-1575.

[18]WANG J, WANG Z, WANG H, et al. Curcumin induces apoptosis in ej bladder cancer cells via modulating c-myc and pi3k/akt signaling pathway[J]. World Journal of Oncology, 2011, 2(3):113-122.

[19]BENOD C, VINOGRADOVA M V, JOURAVEL N, et al. Nuclear receptor liver receptor homologue 1 (LRH-1) regulates pancreatic cancer cell growth and proliferation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(41): 16927-16931.

[20]SCHOONJANS K, DUBUQUOY L, MEBIS J, et al. Liver receptor homolog 1 contributes to intestinal tumor formation through effects on cell cycle and inflammation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(6): 2058-2062.

[21]RADISKY D C. Epithelial-mesenchymal transition[J]. Journal of cell science, 2005, 118(19): 4325-4326.

[22]SUN T, ZHAO N, ZHAO X, et al. Expression and functional significance of Twist1 in hepatocellular carcinoma: its role in vasculogenic mimicry[J]. Hepatology, 2010, 51(2): 545-556.

[23]NAIRISM?GI M L, FüCHTBAUER A, LABOURIAU R, et al.The proto-oncogene TWIST1 is regulated by microRNAs[J]. PloS one, 2013, 8(5): e66070.

[24]DONG P, KANEUCHI M, WATARI H, et al. MicroRNA-106b modulates epithelial–mesenchymal transition by targeting TWIST1 in invasive endometrial cancer cell lines[J]. Molecular carcinogenesis, 2014, 53(5): 349-359.

[25]CHENG G Z, CHAN J, WANG Q, et al. Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration, invasion, and resistance to paclitaxel[J]. Cancer research, 2007, 67(5): 1979-1987.