miRNA-138調(diào)控卵巢上皮癌細胞對順鉑敏感性的機制研究

周宏博，桂藝方

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 1.腫瘤科，2.檢驗科，黑龍江 牡丹江 157011）

卵巢上皮癌（epithelial ovarian cancer，EOC）鉑耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[1]。EOC鉑耐藥的產(chǎn)生機制十分復(fù)雜，目前仍不甚清楚。microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，參與多種生理及病理過程[2-3]。文獻報道，miRNA-138在宮頸癌和膀胱癌等腫瘤細胞的增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用[4-5]，其在卵巢上皮癌中的表達及作用仍不清楚。研究顯示SIRT1可調(diào)節(jié)腫瘤細胞對順鉑的敏感性[6]，而生物信息學(xué)預(yù)測顯示SIRT1是miRNA-138的靶基因，因此本研究假設(shè)miRNA-138可通過SIRT1調(diào)節(jié)卵巢上皮癌細胞對順鉑化療的敏感性，為卵巢上皮癌鉑耐藥的產(chǎn)生機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2017年1月在牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院婦科就診的EOC患者80例為研究對象。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①既往無其他惡性腫瘤病史或自身免疫性疾病；②在本院首次接受治療或確診的EOC患者；③經(jīng)分期手術(shù)或腫瘤細胞減滅術(shù)手術(shù)治療；④經(jīng)病理檢查確診為EOC；⑤術(shù)后需行鉑為基礎(chǔ)的規(guī)范化療；⑥有完整的臨床資料，可進行隨訪（包括腫瘤復(fù)發(fā)時間和總生存期）。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者；②合并不能控制的高血壓、高血糖或嚴(yán)重心臟疾病者。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN）指南中對EOC鉑敏感和鉑耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)[7]將所有EOC患者分為鉑敏感組和鉑耐藥組（鉑敏感：初次接受鉑類藥物化療，停藥后復(fù)發(fā)時間＞6個月或不復(fù)發(fā)；鉑耐藥：初次接受鉑類藥物化療，停藥后6個月內(nèi)復(fù)發(fā)）。其中鉑耐藥組患者30例。年齡32～68歲，平均（52.7±6.2）歲；漿液性卵巢癌15例、黏液性卵巢癌9例、子宮內(nèi)膜樣癌6例；早期（Ⅰ/Ⅱ）15例、晚期（Ⅲ/Ⅳ）15例。鉑敏感組患者40例。年齡28～72歲，平均（54.5±8.1）歲；漿液性卵巢癌18例、黏液性卵巢癌12例、子宮內(nèi)膜樣癌10例；早期（Ⅰ/Ⅱ）25例、晚期（Ⅲ/Ⅳ）15例。兩組患者年齡、腫瘤類型及分期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器和試劑

高速冷凍離心機（德國Eppendorf）、Nano Drop 2000（美國Thermo Scientific）普通PCR儀（美國Bio-Rad）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（上海風(fēng)嶺）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；Trizol RNA提取試劑、Fast Quant RT Kit （With gDNase）、Fast Fire qPCR Pre Mix（SYBR Green）（天根公司）、miRNA-138及U6引物[上海生工（生物）工程股份有限公司]、蛋白提取試劑盒（凱基公司）、SIRT1抗體及HRP標(biāo)記二抗（美國Abcam公司），ECL發(fā)光液（美國Thermo Fisher公司）雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒E1910（美國Promega公司）。

1.2.1 qRT-PCR檢測所有患者卵巢上皮癌組織中miRNA-138和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1）miRNA的表達水平 Trizol提取卵巢上皮癌組織中的總RNA，按Fast Quant RT Kit說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR分析。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s（采集熒光），重復(fù)40個循環(huán)；熔解曲線分析。結(jié)果顯示，PCR擴增反應(yīng)線性梯度良好，熔解曲線峰形單一，無雜峰，說明引物特異性良好。SIRT1相對表達水平以GAPDH的表達水平為參照，根據(jù)目的基因的相對表達量=2-△△Ct計算SIRT1 miRNA的表達變化。MiRNA-138相對表達水平以U6的表達水平為參照，與上述計算方法相同，計算miRNA-138的表達變化。

1.2.2 Western blot檢測所有患者卵巢上皮癌組織中SIRT1蛋白的表達水平 將卵巢上皮癌組織勻漿后，按蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白并定量。加入Loading Buffer混勻，100℃ 5 min使蛋白變性。取10 μl蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，切取約43和81 kD位置的凝膠進行轉(zhuǎn)膜操作，觀察蛋白Maker的轉(zhuǎn)移效率并采用5%的脫脂奶粉進行封閉2 h，分別與anti-SIRT1和anti-β-actin 4℃孵育過夜。PBST洗膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育2 h，PBST洗膜3次后于凝膠成像分析儀上成像并分析條帶灰度值。以β-actin表達量為參照，計算SIR1與β-actin的比值并進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 miRNA-138 mimic、inhibitor及SIRT1 3'-UTR野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取約1×106個細胞均勻鋪于6孔板中，設(shè)置對照組（Negative Control，NC）、miRNA-138 mimic組、miRNA-138 inhibitor組，共轉(zhuǎn)miRNA-138 mimic與SIRT1 3'-UTR野生型質(zhì)粒組及共轉(zhuǎn)miRNA-138 mimic與SIRT1 3'-UTR突變型質(zhì)粒組，采用LipoTM2000試劑進行轉(zhuǎn)染。48 h后收集細胞進行后續(xù)試驗分析，熒光素酶活性分析采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，按步驟操作即可。

1.2.4 MTT檢測SKOV3細胞對順鉑的敏感性 將細胞吹打成單細胞懸液，在96孔板中加入細胞懸液100 ml/孔（約 1×104），37℃、5% 二氧化碳 CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)液，分別加入普通培養(yǎng)液及含順鉑的培養(yǎng)液，每組8孔，孵育48 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加50 ml 1×MTT，37℃孵育4 h，除去上清液，每孔加150 ml DMSO，搖勻后用酶標(biāo)儀測定550 nm波長處各孔的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用Students’t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢上皮癌組織中miRNA-138和SIRT1的表達變化

圖1 卵巢上皮癌組織中miRNA-138和SIRT1的表達變化

與順鉑敏感組比較，鉑耐藥組miRNA-138的表達水平降低（t=2.752，P=0.0332），而SIRT1的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（miRNA：t=7.126，P =0.000；蛋白：t=5.468，P=0.000），見圖1。

2.2 miRNA-138和SIRT1的差異表達對卵巢上皮癌順鉑化療敏感性的影響

過表達miRNA-138后，SIRT1 miRNA的 表達水平降低，細胞活力亦降低即對順鉑敏感性升高，而抑制miRNA-138后，SIRT1 miRNA的表達水平則升高，細胞活力亦升高即對順鉑敏感性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（miRNA-138：F=61.99，P =0.000；SIRT1 miRNA ：F=126，P =0.000；吸光度：F=56.93，P =0.000），見圖 2A～C。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miRNA-138與SIRT1 3'-UTR區(qū)有可能結(jié)合位點，見圖2D。構(gòu)建攜載SIRT1 mRNA 3'-UTR野生型（wild）和突變型（mut）的pGL3重組螢光素酶報告基因質(zhì)粒與miRNA-138 mimic共轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型載體后熒光素酶活性降 低（t=4.894，P=0.000），而轉(zhuǎn)染 SIRT1 miRNA 3'-UTR突變型載體后，熒光素酶活性無變化（t=0.3221，P=0.7511），見圖 2E。

圖2 miRNA-138通過SIRT1調(diào)控卵巢上皮癌細胞對鉑的敏感性

3 討論

卵巢上皮癌發(fā)病隱匿、進展迅速，是目前致死率最高的婦科惡性腫瘤，每年可導(dǎo)致全球125 000人死亡[8]。至少約20%的卵巢上皮癌患者對一線化療藥物天然耐藥，而化療耐藥是導(dǎo)致卵巢上皮癌治療失敗，腫瘤復(fù)發(fā)及死亡率居高不下的重要原因之一[9]。因此，尋找卵巢上皮癌癌細胞耐藥的靶點，闡明其耐藥產(chǎn)生機制是目前亟待解決的問題。

miRNAs種類繁多，在各種組織中廣泛表達，具有重要的生理學(xué)調(diào)控作用，其表達異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。CHEN等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-130a與卵巢上皮癌鉑耐藥密切相關(guān)；CUI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a可通過減少SOD2的產(chǎn)生抑制卵巢癌上皮癌細胞增殖并增強其對化療的敏感性；WEI等[12]報道m(xù)iRNA-551b可通過下調(diào)Foxo3和TRIM31的表達介導(dǎo)卵巢癌細胞的增殖、侵襲及耐藥的發(fā)生。以上文獻提示miRNAs在卵巢上皮癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。

SIRT1是sirtunis家族一員，是一種組蛋白去乙?；福渌閷?dǎo)的生理過程包括轉(zhuǎn)錄沉默、細胞分化、細胞增殖和氧化應(yīng)激等[13]。組蛋白乙?；且环N表觀遺傳學(xué)修飾方式，該修飾可通過改變組蛋白二級結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄因子更易于與基因啟動子區(qū)結(jié)合，而組蛋白去乙?；瘎t使轉(zhuǎn)錄因子難以與基因啟動子區(qū)結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用。研究報道，SIRT1通過改變腫瘤細胞的線粒體代謝參與順鉑耐藥的產(chǎn)生[14]。同時SIRT1也是一種DNA修復(fù)基因。而順鉑是一種細胞周期非特異性抗癌化療藥物，可結(jié)合腫瘤細胞DNA上的堿基，使DNA分子形成鏈內(nèi)和鏈間的交叉鍵聯(lián)，從而抑制腫瘤細胞的DNA合成與修復(fù)。因此SIRT1可能通過修復(fù)腫瘤細胞的DNA對抗順鉑。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示SIRT1是miRNA-138的靶基因，因此本研究假設(shè)miRNA-138可能通過調(diào)控SIRT1的表達參與卵巢上皮癌順鉑耐藥。研究結(jié)果顯示，過表達miRNA-138后，SIRT1 miRNA的表達水平降低，細胞活力亦降低，即對順鉑敏感性升高；而抑制miRNA-138后，SIRT1 miRNA的表達水平則升高，細胞活力亦升高，即對順鉑敏感性降低，有差異。因本研究對細胞的處理只有過表達或敲減miRNA-138的表達和加入藥物順鉑，而過表達或敲減miRNA-138并不影響細胞活力。因此，若細胞活力發(fā)生變化則為對順鉑的敏感性發(fā)生改變。miRNA主要通過與靶基因miRNA 3'-UTR區(qū)相互作用調(diào)控基因的表達。因此，筆者構(gòu)建攜載SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型和突變型螢光素酶報告基因質(zhì)粒與miRNA-138 mimic共轉(zhuǎn)染SKOV3細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型載體后熒光素酶活性降低，而轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR突變型載體后，熒光素酶活性無變化，說明miRNA-138可結(jié)合到SIRT1 miRNA 3'-UTR區(qū)并調(diào)控其表達。

綜上所述，miRNA-138可能通過SIRT1調(diào)控卵巢上皮癌細胞對鉑類藥物的敏感性，因此miRNA-138可作為卵巢上皮癌鉑耐藥防治的靶點。

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