慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中STING基因表達(dá)與HBV DNA載量的關(guān)系

楊曉燕，張平安，牛志立，王方平

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是嚴(yán)重危害人類健康的重大肝臟疾病之一[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)報(bào)道，全球約有二十多億人感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，有3.6億人患CHB，每年有60萬人因HBV相關(guān)性肝衰竭、肝硬化或肝細(xì)胞癌死亡[2]。目前，乙型肝炎的臨床治療以干擾素和核酸類及核酸類似物等藥物為主，但治療效果并不理想[3]。HBV是一種沒有明顯細(xì)胞毒性的嗜肝性雙鏈DNA病毒，可導(dǎo)致急性和慢性肝炎[4]。通常認(rèn)為，細(xì)胞免疫應(yīng)答的活力和強(qiáng)度可以決定HBV感染是否是被清除或是持續(xù)[5]。然而，除了適應(yīng)性免疫，由通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分析模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)誘導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)在控制病毒感染中也發(fā)揮不可或缺的作用[6]。近年研究[7-9]表明，干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes，STING)是天然免疫信號(hào)通路中一種重要的中間蛋白，它不僅參與幾乎所有胞內(nèi)PRRs誘導(dǎo)dsDNA產(chǎn)生I型干擾素(interferon，IFN)的過程，其自身也可以作為PRRs識(shí)別c-di-GMP，c-di-AMP并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN。藉此，為探討STING在機(jī)體抗HBV免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，我們觀察了CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞SITNG的表達(dá),以及HBV DNA復(fù)制情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年2月—2017年2月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科初入院的CHB患者88例為CHB 組，其中男性42例，女性46例；年齡18～83歲，平均(54±15)歲；CHB的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[10]，所有患者在入院前6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)過任何抗病毒治療，排除其他嗜肝病毒感染，自身免疫系統(tǒng)疾病，其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病及感染性疾病。選取同期來我院進(jìn)行體檢的健康人群，共74例為對(duì)照組，其中男性35例，女性39例；年齡20～85歲，平均(56±15)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol和SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo Scientific購(gòu)自公司。RNA濃度測(cè)定采用Thermo Scientific公司的分光光度計(jì)NanoDrop 2000。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產(chǎn)，熒光定量PCR儀LighterCycler1.2 由羅氏生產(chǎn)。HBV DNA 病毒載量檢測(cè)試劑購(gòu)自凱杰生物工程有限公司，檢測(cè)儀器為羅氏 LC480，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作；HBV-DNA 定量最低檢出限為5×102IU/mL，定量檢測(cè)線性范圍為1×103～1×107IU/mL。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站中提供的STING mRNA序列和BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表1。所有引物均由上海維基生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線峰單一，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示目的條帶單一并且目的基因片段的長(zhǎng)度與預(yù)期設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度一致，表明引物的特異性較好。見圖1～2。

表1 STING、干擾素基因及GAPDH基因的上下游引物

圖1 STING、干擾素基因及GAPDH基因引物溶解曲線

注：M為標(biāo)準(zhǔn)分子量

圖2STING、干擾素基因及GAPDH基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Figure2Gel electrophoresis map of PCR products ofSTING, interferon genes, andGAPDHgene

1.3.2 mRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，嚴(yán)格按照淋巴細(xì)胞分離液說明書分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞總mRNA的提取采用Trizol法，所獲得RNA 的純度要求為A260 nm/A280 nm>1.8。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，取11 μL RNA模板并加入1 μL oligo引物混勻后瞬時(shí)離心，65℃加熱5 min，冰上加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：4 μL Reaction Buffer，2 μL Mix，1 μL RI，1 μL RT。反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系為1 μL cDNA，各l μL上下游引物，10 μL SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX II，7.6 μL ddH2O，總體積為20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為5個(gè)基因(STING、IFN-α、IFN-β、GAPDH、內(nèi)參基因)的反應(yīng)條件均為預(yù)變性94℃ 30 s，變性94℃ 20 s，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 35 s，PCR進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，溶解曲線條件為：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。對(duì)CHC組和健康組4個(gè)目的基因mRNA的表達(dá)采用相對(duì)表達(dá)量ΔCT進(jìn)行比較，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參[11]。擴(kuò)增效率驗(yàn)證：本實(shí)驗(yàn)對(duì)4個(gè)基因(STING、IFN-α、IFN-β、GAPDH)進(jìn)行了10倍稀釋，稀釋5個(gè)梯度，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差小于5%，且在98%～102%之間，可以認(rèn)為擴(kuò)增效率近似相等[12]。STING、干擾素基因及GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線見圖3。

圖3STING、干擾素基因及GAPDH基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Figure3Real-time fluorescence quantitative PCR amplification curves ofSTING, interferon genes, andGAPDHgene

2 結(jié)果

2.1 一般資料 CHB組與對(duì)照組兩組研究對(duì)象在性別構(gòu)成比和年齡間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.027，P>0.05)，而在肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為52.530、49.430，均P<0.01)，見表2。

表2CHB組與對(duì)照組一般資料比較

Table2Comparison of general data between CHB group and control group

組別例數(shù)性別[男，n(%)]年齡(歲，x±s)AST(mmol/L，x±s)ALT(mmol/L，x±s)CHB組8842(47．72)53．50±14．7950．01±35．1057．13±39．84對(duì)照組7435(47．30)55．61±14．8818．35±7．2822．57±4．77t/χ2-0．003-0．90151．53049．430P-0．9560．6840．0010．001

2.2 CHB組和對(duì)照組STING及干擾素基因mRNA表達(dá)量的比較 與健康對(duì)照組相比，CHB組患者STING、IFN-α、IFN-β表達(dá)量均上調(diào)，分別是健康對(duì)照組的2.95、3.14、2.01倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

組別例數(shù)基因相對(duì)表達(dá)量STINGIFN?αIFN?βCHB組888．97±1．959．04±3．139．14±2．74對(duì)照組7410．53±2．1510．69±2．9810．15±2．82ΔΔCt-1．56-1．651．012-ΔΔCt2．953．142．01t-4．72-3．41-2．31P<0．01<0．01<0．05

2.3 不同HBV DNA載量CHB患者STING及干擾素基因表達(dá)量的比較 根據(jù)CHB患者體內(nèi)HBV DNA病毒載量的不同將其分為HBV DNA ≤104IU/mL組、104～I(xiàn)U/mL組、105～I(xiàn)U/mL組和>106IU/mL組，使用方差分析檢驗(yàn)四組的差異，結(jié)果顯示四組不同HBV DNA載量的CHB患者STING表達(dá)有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)；四組不同HBV DNA載量的CHB患者IFN-β表達(dá)有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)。見表4。通過SNK檢驗(yàn)對(duì)不同HBV DNA載量CHB患者STING基因表達(dá)量比較進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV DNA≤104IU/mL組患者與其他三組相比，STING基因相對(duì)表達(dá)量增高，分別是HBV DNA 104～I(xiàn)U/mL組、105～I(xiàn)U/mL組、>106IU/mL組的2.98、3.76、3.97倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

HBVDNA載量(IU/mL)例數(shù)基因相對(duì)表達(dá)量STINGIFN?αIFN?β≤104組217．57±1．838．40±3．438．30±2．51104～組189．14±1．778．97±3．308．85±3．19105～組249．47±1．7310．14±2．5810．42±1．95>106組259．56±1．879．04±3．138．83±2．945χ25．791．492．75P0．010．2230．048

2.4 CHB患者STING表達(dá)量與干擾素基因表達(dá)量以及HBV DNA載量的相關(guān)性 CHB患者STING mRNA表達(dá)量與IFN-α 和IFN-β mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r值分別為0.475和0.503，P值均<0.05)，與HBV DNA 載量呈弱相關(guān)性(r=0.333，P<0.05)。

3 討論

固有免疫是人體抵御病原微生物感染的第一道防線，可通過PRRs精細(xì)識(shí)別出不同的抗原，并激活下游免疫信號(hào)通路，最終生成IFN和其他細(xì)胞因子限制病原微生物對(duì)人體的侵襲[13]。固有免疫很大程度地影響著感染的最終結(jié)局，同時(shí)也是適應(yīng)性免疫的基礎(chǔ)[14]。STING是DNA傳感器環(huán)鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)和RNA傳感器人視黃酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)下游的細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)中的銜接蛋白，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路可以識(shí)別多種入侵病毒[15]。HBV病毒基因組全長(zhǎng)約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，其在宿主體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)槌菪墓矁r(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子，并作為模板轉(zhuǎn)錄出前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)和其他mRNA。雖然肝臟是HBV復(fù)制的主要部位，但是人體外周血中也可以檢測(cè)到HBV DNA。HBV通常被認(rèn)為是一種“隱形”病毒，因?yàn)樵贖BV感染的自然過程中，固有免疫反應(yīng)很弱甚至不存在，可能是由于固有免疫系統(tǒng)雖然可以識(shí)別到HBV，但病毒可以主動(dòng)抑制或逃避早期抗病毒反應(yīng)[16]。實(shí)際上，最近的研究表明，HBV的前基因組RNA和其松弛的環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，可分別被RIG-I和STING識(shí)別[17]。不同的先天免疫信號(hào)通路的激活可誘導(dǎo)IFN應(yīng)答并抑制HBV復(fù)制。另一方面，越來越多的證據(jù)表明不同的HBV蛋白和HBV病毒粒子可以通過各種機(jī)制損害先天免疫信號(hào)，如RIG-I，Toll樣受體3(Toll-like receptor，TLR3)和STING刺激的信號(hào)[18]。如HBV誘導(dǎo)的miR146a可靶向干擾RIG-I，從而減弱IFN產(chǎn)生[19]。HBV X蛋白與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)相互作用，P蛋白競(jìng)爭(zhēng)RNA解旋酶3(DDX3)與TANK結(jié)合激酶1(TBK1)的結(jié)合，以抑制RIG-I介導(dǎo)的I型IFN通路信號(hào)傳導(dǎo)[8]。

最近的研究[20]表明，cGAS-STING通路的激活可以有助于抑制的HBV復(fù)制。cGAS是細(xì)胞質(zhì)dsDNA感受器，可結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的DNA經(jīng)催化后形成cGAMP。cGAMP能有效激活STING，進(jìn)而激活下游Ⅰ型IFN生成及抗病毒效應(yīng)。由于HBV復(fù)制期間可產(chǎn)生dsDNA和ssDNA，因此，STING也參與HBV復(fù)制中間體的識(shí)別和HBV清除的調(diào)節(jié)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組患者與健康對(duì)照組相比較，其STING表達(dá)量是增多的，且在HBV DNA載量低的患者體內(nèi)，其STING的表達(dá)也是增多的。與Liu等[22]的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果一致，即過度表達(dá)的STING在體外和體內(nèi)均可抑制HBV的復(fù)制，而且除了固有免疫反應(yīng)外，STING也調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)HBV的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。同時(shí)，本研究中還發(fā)現(xiàn)，STING的相對(duì)表達(dá)量與IFNα、IFNβ的表達(dá)呈正相關(guān)，與最近報(bào)道[23]的有關(guān)STING與干擾素基因的研究類似。

綜上所述，STING在機(jī)體抗HBV免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，由于本研究納入樣本量有限，關(guān)于STING抗HBV感染的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。對(duì)于STING介導(dǎo)的固有免疫網(wǎng)絡(luò)亦有待完善，從而為進(jìn)一步探明病毒逃避宿主固有免疫的機(jī)制，并為HBV感染的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

[1] Lusida MI, Juniastuti, Yano Y. Current hepatitis B virus infection situation in Indonesia and its genetic diversity[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(32): 7264-7274.

[2] Askari A, Hakimi H, Nasiri Ahmadabadi B, et al. Prevalence of hepatitis B co-infection among HIV positive patients: narrative review article[J]. Iran J Public Health, 2014, 6, 43(6): 705-712.

[3] Konerman MA, Lok AS. Interferon treatment for hepatitis B[J]. Clin Liver Dis, 2016, 20(4): 645-665.

[4] Villar LM, Cruz HM, Barbosa JR, et al. Update on hepatitis B and C virus diagnosis[J]. World J Virol, 2015, 4(4): 323-342.

[5] Ohno M, Otsuka M, Kishikawa T, et al. Novel therapeutic approaches for hepatitis B virus covalently closed circular DNA[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(23): 7084-7088.

[6] Lee JA, Kim YM, Hyun PM, et al. Honeybee (Apis mellifera) venom reinforces viral clearance during the early stage of infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus through the up-regulation of Th1-specific immune responses[J]. Toxins (Basel), 2015, 7(5): 1837-1853.

[7] Wu J, Sun L, Chen X, et al. Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic DNA[J]. Science, 2013, 339(6121): 826-830.

[8] Liu Y, Li J, Chen J, et al. Hepatitis B virus polymerase disrupts K63-linked ubiquitination of STING to block innate cytosolic DNA-sensing pathways[J]. J Virol, 2015, 89(4): 2287-2300.

[9] Guo F, Han Y, Zhao X, et al. STING agonists induce an innate antiviral immune response against hepatitis B virus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(2): 1273-1281.

[10] 王貴強(qiáng),王福生,成軍,等.慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)[J].臨床肝膽病雜志, 2015, 31(12) :1941-1960.

[11] Pfaffl MW．A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29(9): e45.

[12] Livak KJ, Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T)) method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[13] Wang L, Wang K, Zou ZQ. Crosstalk between innate and adaptive immunity in hepatitis B virus infection[J]. World J Hepatol, 2015, 7(30): 2980-2991.

[14] Li X, Ni R. Breaking hepatitis B virus tolerance and inducing protective immunity based on mimicking T cell-independent antigen[J]. Viral Immunol, 2016, 29(9): 502-509.

[15] Luangsay S, Gruffaz M, Isorce N, et al. Early inhibition of hepatocyte innate responses by hepatitis B virus[J]. J Hepatol, 2015, 63(6): 1314-1322.

[16] Ran Y, Shu HB, Wang YY. MITA/STING: a central and multifaceted mediator in innate immune response[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2014, 25(6): 631-639.

[17] Cui X, Clark DN, Liu K, et al. Viral DNA-dependent induction of innate immune response to hepatitis B virus in immortalized mouse hepatocytes[J]. J Virol, 2015, 90(1): 486-496.

[18] Sato S, Li K, Kameyama T, et al. The RNA sensor RIG-I dually functions as an innate sensor and direct antiviral factor for hepatitis B virus[J]. Immunity, 2015, 42(1): 123-132.

[19] Wei CW, Ni CF, Song T, et al. The hepatitis B virus X protein disrupts innate immunity by downregulating mitochondrial antiviral signaling protein[J]. J Immunol, 2010, 185(2): 1158-1168.

[20] Guo F, Tang L, Shu S, et al. Activation of stimulator of interferon genes in hepatocytes suppresses the replication of hepatitis B virus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(10), pii: e00771-17.

[21] Gao D, Wu J, Wu YT, et al. Cyclic GMP-AMP synthase is an innate immune sensor of HIV and other retroviruses[J]. Science, 2013, 341(6148): 903-906.

[22] Liu S, Zhao K, Su X, et al. MITA/STING and its alternative splicing isoform MRP restrict hepatitis B virus replication[J]. PLoS One, 2017, 12(1): e0169701.

[23] Chen H, Pei R, Zhu W, et al. An alternative splicing isoform of MITA antagonizes MITA-mediated induction of type I IFNs[J]. J Immunol, 2014, 192(3): 1162-1170.