BBI阻斷LPS對(duì)腸道上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的抑制作用

古 俊, 劉金彪, 霍文哲

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071)

腸道是人體最重要和最復(fù)雜的器官之一，它不僅為機(jī)體各個(gè)器官組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也為微生物的生存提供必要的空間與營(yíng)養(yǎng)條件。人類(lèi)的許多疾病都伴有腸道功能紊亂以及菌群失調(diào)癥狀。因此，腸道的功能表現(xiàn)也是反映機(jī)體健康的直接和重要指標(biāo)之一[1]。腸道上皮細(xì)胞在血液循環(huán)和腸道內(nèi)的外環(huán)境間形成一道天然屏障，是阻擋腸道內(nèi)微生物及其產(chǎn)物進(jìn)入機(jī)體的第一道重要防線(xiàn)，對(duì)維持腸道內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡和正常功能至關(guān)重要[2]。腸道上皮細(xì)胞能吸收對(duì)機(jī)體有益的物質(zhì)，并特異性地排斥病原體等有害物質(zhì)[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種感染性細(xì)菌(革蘭陰性細(xì)菌)的產(chǎn)物，可誘導(dǎo)包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞表達(dá)大量的炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子會(huì)損傷腸道上皮屏障，改變屏障的通透性[4]。腸道內(nèi)菌群紊亂以及腸道上皮屏障受損會(huì)導(dǎo)致LPS的移位，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。在艾滋病等多種感染性疾病以及腸炎等非感染性疾病中，腸道免疫紊亂及腸道屏障破壞是主要的病理變化[5]。

包曼-畢爾克抑制劑(Bowan-Birk inhibitor，BBI)是一種大豆富含的耐酸性蛋白酶抑制劑，具有抗炎功效[6]。研究表明，BBI能有效抑制炎性因子表達(dá)，對(duì)免疫性疾病具有潛在的治療功效[7-8]。BBI還能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，減少炎性巨噬細(xì)胞造成的神經(jīng)損傷[9]。我們的前期研究[10]顯示，BBI能激活巨噬細(xì)胞內(nèi)天然免疫，抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的感染和復(fù)制；BBI能抑制LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞NF-κB激活，從而抑制炎癥因子的表達(dá)。大量研究表明，腸道還是HIV感染的主要場(chǎng)所。HIV感染使腸道CD4+T細(xì)胞丟失，造成腸上皮屏障通透性增加，細(xì)菌及其產(chǎn)物如LPS進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身性免疫激活，這是HIV感染進(jìn)展到艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的主要原因。因此，抑制或降低LPS誘導(dǎo)的免疫激活有助于減緩HIV疾病進(jìn)展。在這項(xiàng)研究中，我們選擇既有抗炎作用又能抑制HIV的天然產(chǎn)物BBI，研究BBI是否能阻斷LPS對(duì)腸道上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的抑制作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 LPS購(gòu)于美國(guó)InvivoGen公司，其效價(jià)為106EU/mg(endotoxin Unit/mg)，用無(wú)內(nèi)毒素的水溶解LPS(10 μg/μL)后保存于-80℃；BBI購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，其純度>90%，用高壓滅菌雙蒸水溶解BBI(10 mg/mL)后保存于-80℃；Tri-reagent購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；SsoAdvancedTM Universal Inhibitor-Tolerant SYBR○RGreen Supermix購(gòu)于美國(guó)BIO RAD公司；CCK8試劑盒購(gòu)于美國(guó)MCE公司。ZO-1兔單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Occludin兔單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，NF-κB和p-NF-κB兔單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞(人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系)購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)。在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%HEPES緩沖液)培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。

1.3 毒性試驗(yàn) 用CCK8試劑盒檢測(cè)LPS和/或BBI對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HT-29細(xì)胞(104個(gè)/孔)，12 h后用不同濃度的LPS(0、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL)、BBI(0、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)或BBI預(yù)處理后再用LPS處理細(xì)胞72 h。在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(在波長(zhǎng)450 nm處)檢測(cè)吸光度值。

1.4 熒光定量PCR 用Tri-Reagent提取細(xì)胞RNA，然后用NANDROP超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Promega，USA)和隨機(jī)引物(Promega，USA)對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 37℃擴(kuò)增1 h，95℃終止反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR用SYBR Green Supermix試劑盒。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min，95℃ 5 s→60℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)所使用引物見(jiàn)表1。Ct值相對(duì)GAPDH進(jìn)行均一化，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 在6孔板中按2×106個(gè)/孔培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。用RIPA中強(qiáng)度裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)提取LPS或BBI處理過(guò)的細(xì)胞蛋白，RIPA中加入蛋白磷酸酶抑制劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。用8% SDS-PAGE膠分離40 μg總蛋白，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜(Biro Rad公司)，5%脫脂奶粉封閉，再用稀釋的ZO-1兔單克隆抗體(1∶1 000)，Occludin兔單克隆抗體(1∶1 000)，NF-κB及p-NF-κB兔單克隆抗體(ser-536，1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，充分洗滌后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育3 h，洗滌后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑ECL(碧云天生物技術(shù)公司)在化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影。用Image J圖像軟件分析條帶密度。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 BBI和/或LPS對(duì)腸道上皮細(xì)胞的毒性作用 用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，將未處理的細(xì)胞在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值定為1.0，以此計(jì)算處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞的百分比值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)復(fù)孔取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。用不同濃度LPS和/或BBI處理HT-29細(xì)胞72 h，處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞的活性相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1A。先用BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用不同濃度LPS處理細(xì)胞，處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞的活性相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1B。BBI最大濃度(1 000 μg/mL)和LPS最大濃度(1 000 ng/mL)，對(duì)細(xì)胞均無(wú)毒性作用。

A：用不同濃度LPS和/或BBI處理HT-29細(xì)胞72 h；B：用BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用不同濃度LPS繼續(xù)處理72 h

2.2 BBI阻斷LPS對(duì)腸道上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的抑制作用 提取細(xì)胞RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin以及GAPDH的mRNA水平表達(dá)，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計(jì)算，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)復(fù)孔取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。LPS可顯著地下調(diào)HT-29細(xì)胞間緊密連接蛋白(ZO-1, Occludin)在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，其下調(diào)作用與LPS濃度成正比。BBI預(yù)處理6 h 能抑制LPS對(duì)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白的下調(diào)作用，且這種抑制效應(yīng)與BBI劑量成正相關(guān)。見(jiàn)圖2。

2.3 BBI 對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響 提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞TLR4以及GAPDH在mRNA水平的表達(dá)，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計(jì)算，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)復(fù)孔取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。LPS能顯著上調(diào)HT-29細(xì)胞TLR4受體的表達(dá)，且上調(diào)作用具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。LPS處理HT-29細(xì)胞3 h時(shí)對(duì)TLR4mRNA水平的上調(diào)作用最明顯，見(jiàn)圖3A。在10 ng/mL濃度時(shí)，LPS對(duì)TLR4的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，見(jiàn)圖3B。BBI預(yù)處理HT-29細(xì)胞6 h可明顯抑制LPS對(duì)TLR4的上調(diào)作用，而且BBI的這種抑制作用具有劑量效應(yīng)，見(jiàn)圖3C。

A：按不同時(shí)間(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細(xì)胞，檢測(cè)LPS對(duì)ZO-1和Occludin表達(dá)的影響；B：用不同濃度BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用LPS處理6 h，檢測(cè)BBI對(duì)LPS的阻斷作用；C：用不同濃度LPS處理HT-29細(xì)胞24 h；或用不同濃度BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用LPS處理24 h；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞ZO-1、Occludin以及內(nèi)參β-actin蛋白水平表達(dá)；*：P<0.05；**：P<0.01

圖2BBI阻斷LPS對(duì)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白的抑制作用

Figure2BBI blocks LPS-mediated inhibitory effect on tight junction protein in HT-29 cells

A：按不同時(shí)間點(diǎn)(0、3、6、12、24 h)用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細(xì)胞；B：用不同濃度的LPS處理HT-29細(xì)胞；C：用不同濃度BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用LPS(10 ng/mL)處理3 h；*：P<0.05；**：P<0.01

圖3BBI阻斷LPS對(duì)TLR4的作用

Figure3BBI blocks LPS-mediated effect on TLR4

2.4 BBI對(duì)腸道上皮細(xì)胞炎癥因子、TLR4及MyD88表達(dá)的影響 用BBI(100 μg/mL)處理HT-29細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、TLR4、MyD88以及GAPDH的mRNA表達(dá)，數(shù)據(jù)采用 2-△△Ct法計(jì)算，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)的三個(gè)復(fù)孔取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。高濃度BBI(100 μg/mL)處理HT-29細(xì)胞對(duì)炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1)、TLR4以及MyD88的表達(dá)無(wú)明顯作用。BBI處理時(shí)間長(zhǎng)短(3、6、12、24 h)對(duì)上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)也無(wú)影響(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5 BBI對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞NF-κB活化的影響 用含蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞磷酸化的N F-κB。LPS能顯著地促進(jìn)HT-29細(xì)胞內(nèi)NF-κB的磷酸化，這種促NF-κB磷酸化的作用具有劑量效應(yīng)。BBI對(duì)NF-κB的磷酸化無(wú)影響，而B(niǎo)BI預(yù)處理HT-29細(xì)胞6 h能明顯阻斷LPS對(duì)NF-κB的磷酸化的促進(jìn)作用。見(jiàn)圖5。

圖4 BBI對(duì)HT-29細(xì)胞表達(dá)炎癥因子、TLR4和MyD88的影響

A：用不同濃度LPS處理HT-29細(xì)胞30 min；B：用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細(xì)胞后，按不同時(shí)間點(diǎn)(0、5、15、30、60、120 min)檢測(cè)細(xì)胞NF-κB；C：用不同濃度BBI預(yù)處理細(xì)胞6 h后再用LPS(10 ng/mL)處理HT-29細(xì)胞30 min

圖5BBI對(duì)LPS誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞NF-κB的磷酸化的影響

Figure5Effect of BBI on LPS-mediated phosphorylation of NF-κB in the intestinal epithelial cells

3 討論

腸道上皮細(xì)胞是腸道屏障的重要組成部分，腸道屏障對(duì)保護(hù)腸道不受病原微生物入侵至關(guān)重要，以腸道上皮屏障的通透性作為疾病防治靶標(biāo)越來(lái)越受到重視[11-12]。研究表明，細(xì)菌內(nèi)毒素LPS能通過(guò)TLR4受體募集MyDD8，激活NF-κB，誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞表達(dá)包括TNF-α、IL-1β、IL-8在內(nèi)的大量炎性因子，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞通透性增加，屏障損傷[13-14]，導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物及其產(chǎn)物移位，進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身性免疫激活[15-16]。由于HIV感染的主要靶細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞，免疫激活成為HIV感染進(jìn)展主要促進(jìn)因素。因此，維持腸道完整性至關(guān)重要。腸道上皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白維持上皮屏障的穩(wěn)定[17]。Occludin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間緊密連接蛋白，表達(dá)于所有上皮細(xì)胞，在上皮屏障細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能中均發(fā)揮重要作用[18]。ZO-1是細(xì)胞間帶狀緊密連接蛋白，是上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的主要標(biāo)志[19-20]。本研究顯示，LPS處理腸道上皮細(xì)胞能明顯地降低緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)。此外，LPS還能誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4，有利于LPS發(fā)揮功效。LPS能激活腸道上皮細(xì)胞NF-κB，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)。然而，BBI預(yù)處理能阻斷LPS對(duì)細(xì)胞間緊密連接蛋白的抑制作用，BBI還能抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)和NF-κB活化。這些結(jié)果為BBI對(duì)LPS的抑制作用提供了合理的解釋。

LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子是導(dǎo)致腸道屏障損傷及免疫激活的主要因素。機(jī)體免疫激活及腸道LPS移位促進(jìn)HIV-1疾病進(jìn)展。新近研究顯示，LPS增加腸道上皮細(xì)胞通透性，損傷腸道屏障。由于緊密連接蛋白(ZO-1，Occludin)是形成細(xì)胞間空隙、控制腸道內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)的重要蛋白，抑制其表達(dá)會(huì)造成腸上皮屏障通透性增加，細(xì)菌及其產(chǎn)物如LPS進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，使HIV有更多靶細(xì)胞。因此，本研究結(jié)果表明，BBI能保護(hù)腸道上皮細(xì)胞不受LPS介導(dǎo)的炎性損傷，有利于降低和減緩HIV感染的進(jìn)展。

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