月季花黃酮類化合物的串聯(lián)ESI-MS分析

云南開放大學/云南國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南 昆明 650223

月季花(RosachinensisJacq.)早期的藥用記載出自李時珍《本草綱目》，又名月月紅、四季花、月季紅、四香春、艷雪紅、勒泡，為薔薇科薔薇屬植物，分布于全國大部分地區(qū)，主產(chǎn)于云南、廣東、湖北和四川，全年均可采收[1]。月季花除具有觀賞性之外，其藥材為其干燥球形花蕾或微開的花朵，氣清香，味淡和微苦。藥理學研究表明月季的花、根和葉均可入藥[2]。據(jù)報道月季花的主要活性成分為黃酮和酚酸類化合物，另外還有芳香油、鞣質(zhì)和色素等[3-4]。中醫(yī)認為其性味甘溫，有活血調(diào)經(jīng)、消腫解毒之功，主治月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、癰瘡腫毒、淋巴結(jié)核等[3]。在民間月季花作為一種常用的活血化瘀藥受到老百姓的歡迎，其中的黃酮苷類化合物具有很強的藥理作用，例如槲皮素具有較強的抗腫瘤、抗病毒及抑制血小板聚集的作用[5-7]，山奈酚屬于目前急缺的廣譜抗菌中草藥[8]，萹蓄苷具有利尿、抑菌殺蟲和抗氧化的作用[9-11]。目前我省各地薔薇科薔薇屬植物資源豐富，筆者研究這些化合物對于抗腫瘤、抗炎、抗衰老等藥物的開發(fā)和利用具有一定的參考價值，同時研究代表藥物月季花中黃酮類化合物的藥理作用和機制等，為進一步開發(fā)利用薔薇屬植物奠定了基礎(chǔ)。

本研究所運用的技術(shù)為電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)，ESI-MS分析方法可獲得相關(guān)物質(zhì)的分子量、分子式及分子結(jié)構(gòu)的重要信息[12]。其優(yōu)點是分析快速、靈敏、分辨率高、樣品用量少，而且分析范圍廣，可用于氣體、液體、固體有機樣品的分析，使復雜的有機混合物的分離與鑒定能快速的一次完成。質(zhì)譜技術(shù)由于具有靈敏度高、分析速度快以及對雜質(zhì)承受能力強等特點，已被廣泛應(yīng)用于分析復雜混合物[13]。筆者采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)[14]，通過直接進樣的方法對云南境內(nèi)3種產(chǎn)地不同的月季花(彌勒、建水、安寧)新鮮花蕾樣品進行分析[15]。由于產(chǎn)地不同，其化學成分也有一些差異[16]，因此建立一個微量和快速的定性及半定量分析方法，對不同產(chǎn)地的藥材進行區(qū)分和辨別，對于正確合理使用該藥材具有重要的意義。

1 儀器與材料

ThermoQuestFinnigan LCQDECA電噴霧離子源質(zhì)譜檢測器(ThermoQuest LC/MS Division, San Jose, CA, USA)。甲醇為分析純試劑(廣東光華化學廠有限公司)月季花分別采自彌勒、建水、安寧。

2 方法

2.1 溶液的制備 月季花各50 mg，浸泡于20 mL甲醇中，超聲波提取30 min，離心后取上清液待測。

2.2 測試條件 負離子模式檢測進行一級質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢測器參數(shù)：霧化殼氣為氮氣(80uit)；霧化輔助氣也為氮氣(20uit)；毛細管溫度：350℃；噴射電壓：負離子模式下為4.5 kV；碰撞氣為氮氣；碰撞能量范圍：30%～40%；所有數(shù)據(jù)采集和處理采用FinniganXcaliburTMCore Data System Rev.1.2。

3 結(jié)果與討論

由于其他成分的負離子ESI-MS質(zhì)譜響應(yīng)不如黃酮類化合物，故在3個產(chǎn)地月季花提取物的負離子ESI-MS質(zhì)譜圖中(見圖1-3)，主要見到的是一些黃酮及黃酮苷類化合物的準分子離子峰[M-H]-，而且這些準分子離子峰的豐度較高，碎片峰較少，干擾不大。在月季花的ESI-MS質(zhì)譜圖中主要的峰有m/z 447、301、169、609、615、285、463、599、433等。結(jié)合ESI-MSn推測這些準分子離子峰所對應(yīng)的黃酮等化合物(見表1)。不同產(chǎn)地的月季花主要成分都很相近，比如在3種不同產(chǎn)地的月季花提取物的負離子質(zhì)譜圖中均可以檢測到槲皮素、槲皮素-3-O-2″-沒食子酰基-β-D-葡萄糖苷、山萘酚-3-O-2″-沒食子?；?β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷，可見不同產(chǎn)地的月季花其主要黃酮成分大致相同。但是在一些微量成分上有一些差別，比如在彌勒和安寧產(chǎn)的月季花中均檢測到槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，但是在建水產(chǎn)的月季花中沒有檢測到；在建水和安寧產(chǎn)的月季花中均檢測到槲皮素-3-O-6”-反式-香豆?；?β-D-葡萄糖苷，但是在彌勒產(chǎn)的月季花中沒有檢測到；在建水產(chǎn)的月季花中有萹蓄苷，但是在彌勒和安寧產(chǎn)的月季花中均未檢測到。從3個產(chǎn)地月季花提取物的質(zhì)譜來看，除沒食子酸外，槲皮素的峰都最強(基峰)。

分別對表1所列幾個化合物的準分子離子峰作串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MSn)實驗，進一步證明了黃酮苷類化合物的結(jié)構(gòu)(見表2)，從而發(fā)現(xiàn)黃酮苷的裂解雖簡單，但仍有規(guī)律可循。以月季花中含量最大的槲皮素為例具體分析，在ESI-MSn中得到m/z283、273、255、229和211等碎片離子，碎片m/z255可由碎片m/z283和273產(chǎn)生，槲皮素的裂解途徑示于圖4。另一個母核結(jié)構(gòu)山奈酚在ESI-MSn中得到m/z267、257、229、211、169、151等碎片離子，其裂解途徑示于圖5。

表1 不同產(chǎn)地月季花ESI—MSn分析結(jié)果

峰號[M—H]-化合物ABC1 447槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷++2 301槲皮素+++3 169沒食子酸++4 609槲皮素-3-O-6″-反式-香豆?；?β-D-葡萄糖苷++5615槲皮素-3-O-2″-沒食子酰基-β-D-葡萄糖苷+++6285山萘酚++7463槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷+++8599山萘酚-3-O-2″-沒食子酰基-β-D-葡萄糖苷+++9433萹蓄苷+

*A：彌勒產(chǎn)月季花；B：建水產(chǎn)月季花；C：安寧產(chǎn)月季花；+ 表示出峰明顯

表2 月季花中黃酮苷的ESI-MSn主要碎片信息

化合物化合物結(jié)構(gòu)ESI-MS[M H]-ESI-MSn主要離子裂解方式(A、B、C、D、E途徑見圖4-5)槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷477301, -鼠李糖基283, B273, A229 A槲皮素301283, B273, A257, A255, A and B229, A211 A槲皮素-3-O-6-反式-香豆?；?β-D-葡萄糖苷609463, -香豆?；?01, -葡萄糖基283, B257, A229 A槲皮素-3-O-2”-沒食子?；?β-D-葡萄糖苷615463, -沒食子酰基301 -葡萄糖基283, B273, A255, A and B229, A 山萘酚285267, D257, C229, C211, C169, E151, E

槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷463301, -半乳糖基283, B273, A255, A and B229 A萹蓄苷433301, -阿拉伯糖基283, B273, A255, A and B229 A

綜上，通過月季花的甲醇總提取物直接進樣法的ESI-MSn快速分析，建立了一種快速分析方法。對總提物進行定性和半定量分析，能夠快速簡便地判斷不同產(chǎn)地月季花藥材的品質(zhì)，預判藥材的化學成分。