Th9細(xì)胞參與MS和EAE發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展①

徐 文 胡學(xué)強(qiáng) (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)科，廣州510630)

學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為Th1/Th2和Th17/Treg軸在多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。然而，隨著免疫學(xué)研究的不斷發(fā)展，我們對(duì)于MS免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)也不斷深入。2008年，Natural immunology上先后刊載了兩篇文章，報(bào)道了一群能分泌IL-9和IL-10的新型效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞亞群，即 Th9細(xì)胞［1，2］。Th9是一種新的以分泌IL-9為主的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和 IL-4 能誘導(dǎo)Th0分化成 Th9，同時(shí)也可在 TGF-β作用下由Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。IL-9不僅由Th9細(xì)胞分泌而來(lái)，同時(shí)，還有少量的IL-9由Th2和Th17分泌［2］。作為一種新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其參與過(guò)敏性鼻炎［3］、過(guò)敏性哮喘等疾病的發(fā)病。本文重點(diǎn)討論Th9細(xì)胞對(duì)MS和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomy elitis，EAE)的可能機(jī)制。

1 Th9細(xì)胞及其細(xì)胞因子的生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 Th9細(xì)胞 Th9細(xì)胞可由IL-4聯(lián)合TGF-β刺激CD4+初始T細(xì)胞而產(chǎn)生，也可由TGF-β作用于Th2細(xì)胞，由Th2轉(zhuǎn)分化而來(lái)。這一新的細(xì)胞亞群不表達(dá)已知的Th1、Th2、Treg、Th17各自主要的轉(zhuǎn)錄因子 T-bet、GATA-3、Foxp3 以及 RORγt［2］。IL-9 與IL-2、IL-4、IL-7、IL-15 和 IL-21 屬同一細(xì)胞因子家族，并且共用一條γ鏈。故認(rèn)為在IL-4、TGF-β聯(lián)合刺激CD4+初始T細(xì)胞分泌IL-9、IL-10時(shí)，同時(shí)促進(jìn)了其他效應(yīng)性T細(xì)胞的分化和生成［1］。Dardalhon等［1］認(rèn)為 IL-4能阻斷 TNF-β誘導(dǎo) Treg細(xì)胞表達(dá)其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，令人驚訝的是，IL-4與TNF-β能誘導(dǎo)Foxp3-效應(yīng)性T細(xì)胞分化IL-9和IL-10。

有研究認(rèn)為Th9細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子是PU.1［4］，PU.1 是 ETS(E-twenty six，ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，PU.1的異常表達(dá)會(huì)使Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)物減少，而促使Th2向Th9轉(zhuǎn)化，PU.1能適當(dāng)誘導(dǎo) Th1、Treg、Th17 等產(chǎn)生 IL-9，PU.1 能抑制 Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而促進(jìn)Th9分化的表型［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PU.1缺陷的小鼠T細(xì)胞分泌低水平的IL-9，而利用逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)PU.1異位表達(dá)則產(chǎn)生大量的IL-9。這些結(jié)果說(shuō)明PU.1對(duì)Th9的分化尤為重要。定量PCR和ELISA檢測(cè)其PU.1的mRNA含量，與Th1、Th2及 Th17相比，Th9細(xì)胞 PU.1的mRNA含量高表達(dá)，有趣的是，Treg細(xì)胞的PU.1轉(zhuǎn)錄水平卻高于Th9。進(jìn)一步研究認(rèn)為，在Treg細(xì)胞，PU.1缺陷不會(huì)影響Foxp3的表達(dá)［4］。據(jù)此認(rèn)為，在人類Th9細(xì)胞，PU.1是IL-9不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子。然而，PU.1并不是促進(jìn)Th9細(xì)胞分化和發(fā)育的唯一轉(zhuǎn)錄因子。研究證明，轉(zhuǎn)錄因子IRF-4對(duì)Th9細(xì)胞的發(fā)育和功能的維持必不可少。IRF-4缺陷的小鼠T細(xì)胞不能分化成Th9，同樣，利用siRNA技術(shù)下調(diào)IRF-4會(huì)顯著抑制Th9細(xì)胞分泌IL-9［6］。

1.2 IL-9/IL-9R的構(gòu)成及結(jié)構(gòu) 人類的IL-9基因位于第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的Th2的細(xì)胞因子基因簇上(5q31-35)，而小鼠的IL-9基因位于第13號(hào)染色體上［7］。人和小鼠的IL-9有著類似的基因構(gòu)成，長(zhǎng)約14 kb，分別有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。人與小鼠的5個(gè)外顯子大小相同，在核酸水平上的同源性為69%，而在蛋白水平上為55%，成熟的IL-9由144個(gè)氨基酸和一段18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽組成［8］。

IL-9R是紅細(xì)胞生成素受體超家族中的一員，由一條 α鏈(IL-9Rα)和一條 γ鏈(γC)組成。人IL-9R基因主要集中于Xq和Yq染色體長(zhǎng)臂上的擬常染色體區(qū)域，靠近端粒處?；蜷L(zhǎng)約17 kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成［9，10］。鼠IL-9R基因則位于第11號(hào)染色體上。IL-9通過(guò)和IL-9R結(jié)合而介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是依賴JAK/STAT途徑的。Jakl和 IL-9R 相連，STAT1、STAT3、STAT5 參與其中［11］。

1.3 IL-10/IL-10R的構(gòu)成及結(jié)構(gòu) Th9細(xì)胞除了分泌IL-9外，還分泌IL-10，人類IL-10基因位于染色體1q21-32，長(zhǎng)約4.7 kb，由4個(gè)內(nèi)含子分隔開的5個(gè)外顯子組成。鼠的IL-10基因位于染色體1E4，長(zhǎng)約5.1 kb。編碼人和鼠IL-20、IL-19的基因大約位于 IL-10基因上游90 kb，而編碼 Mapkapk2和Dyrk3的基因則位于IL-10基因的下游。相鄰的IL-10基因大約200 kb的多個(gè)基因片段構(gòu)成了IL-10的基因簇［12］。

IL-10受體由IL-10R1和IL-10R2兩個(gè)亞單位組成［13］。編碼兩個(gè)亞單位的基因具有顯著的相似性，這兩個(gè)亞單位均屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族(ClassⅡ cytokine receptor family，CRF2)，CRF2 成員多為跨膜糖蛋白。IL-10R1為大約90～110 kb的糖蛋白，編碼基因位于11號(hào)染色體［14］，人類 IL-10R2編碼基因位于21號(hào)染色體［15］。IL-10R1是IL-10受體復(fù)合物的特異性成分。而IL-10R2則是其他配體受體復(fù)合物的共同成分，如IL-22、IL-26、IL-28、IL-29［16，17］。IL-10 與受體復(fù)合物的結(jié)合分為兩步，首先，IL-10和 IL-10R1結(jié)合，IL-10/IL-10R1相互作用改變了其細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)，隨后，IL-10/IL-10R1 復(fù)合物與 IL-10R2 結(jié)合［18，19］。單獨(dú)的 IL-10R2不能與 IL-10 結(jié)合［20，21］。IL-10R1 主要位于免疫細(xì)胞表面，表達(dá)量通常很低，大約每個(gè)細(xì)胞含100～800個(gè)分子［21］。有趣的是，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞卻高表達(dá) IL-10R1［22］。與之相反，IL-10R2 卻在多數(shù)細(xì)胞和組織均有表達(dá)，IFN-γ和TNF-α對(duì)組織細(xì)胞的刺激，均會(huì)增加 mRNA 高表達(dá) IL-10R2［23，24］。

2 Th9細(xì)胞在MS和EAE中的作用

2.1 IL-9與MS和EAE的關(guān)系 IL-9不僅來(lái)源于T細(xì)胞，還來(lái)源于嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。T細(xì)胞中不僅Th9細(xì)胞可分泌IL-9，同樣作為T淋巴細(xì)胞亞群的Th2、Th17也可分泌少量IL-9。IL-9既是一種T細(xì)胞因子，又可直接作用于B細(xì)胞(可能為B1亞群)，在Ig合成的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用;它可通過(guò)抑制嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)IL-5介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞前體的成熟來(lái)增加組織中的嗜酸性粒細(xì)胞［25］。

研究者對(duì)過(guò)敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)患者血清IL-9進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露在過(guò)敏原中的AR患者血清IL-9濃度明顯高于未暴露在過(guò)敏原中的AR患者［3］。IL-9可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL20，并促進(jìn)Th17向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷徙。經(jīng)抗IL-9抗體中和治療的EAE小鼠模型，其星形膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子CCL20表達(dá)下降，浸潤(rùn)性Th17的數(shù)量也下降，EAE程度可減輕［26］。

IL-9結(jié)合TGF-β可促進(jìn)Th17的分化，Th17也能產(chǎn)生IL-9［27］。與野生型小鼠相比，IL-9R缺陷的小鼠通過(guò)減少Th17的水平和巨噬細(xì)胞釋放IL-6能抵抗EAE發(fā)病。也有研究得出，IL-9的促炎作用具有抗原特異性，適應(yīng)性回輸Th9細(xì)胞可誘導(dǎo)EAE發(fā)?。?8］。IL-9可直接作用于Treg細(xì)胞(Treg細(xì)胞表達(dá)IL-9Rα)，增加其抑制作用，并間接作用于Th17細(xì)胞(Th17細(xì)胞不表達(dá)IL-9Rα)，促進(jìn)其擴(kuò)增和聚集［26］。

2.2 IL-10與MS和EAE的關(guān)系 IL-10最初發(fā)現(xiàn)是一種由Th2細(xì)胞分泌并具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子［29］。能抑制 Th1、Th2、Th17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。IL-10具有抗炎和免疫抑制作用，通過(guò)抑制粒細(xì)胞、Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的促炎作用，進(jìn)而達(dá)到抗炎的目的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明IL-10對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病具有抑制炎癥的作用，且Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)均有效［30-32］。IL-10同時(shí)對(duì)某些類型的細(xì)胞具有免疫刺激作用。如其對(duì)小鼠肥大細(xì)胞和胸腺細(xì)胞具有生長(zhǎng)因子刺激作用。并能增強(qiáng) CD64和CD163的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞等的分化，增強(qiáng)機(jī)體清除感染及細(xì)胞吞噬作用［33］。IL-10對(duì)人B細(xì)胞的存活，增殖以及分化具有重要的作用。對(duì)B細(xì)胞存活的影響主要取決于細(xì)胞所處于的階段和狀態(tài)，同時(shí)也與抗凋亡蛋白bcl-2作用有關(guān)。IL-10對(duì)B細(xì)胞增殖的加強(qiáng)作用也受到IL-2和IL-4的影響;并且IL-10可以誘導(dǎo)Bl細(xì)胞的分化。IL-10對(duì)T細(xì)胞的作用主要取決于其對(duì)抗原提呈細(xì)胞的影響而間接抑制T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。

IL-10與其受體的結(jié)合會(huì)激活JAK家族的兩個(gè)成員:Jak1和 Tyk2，其中 Jak1與 IL-10R1相連，而Tyk2 與 IL-10R2 相連［12，34］。IL-10 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)Jak-STAT通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在IL-10與IL-10R相互作用時(shí)，Jak1與Tyk2通過(guò)酪氨酸殘基交叉磷酸化而被激活，從而引起轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT3、STAT5的活化并形成同二聚體和異二聚體，進(jìn)而易位到細(xì)胞核啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。被IL-10活化的基因包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)1 和 3［35，36］。SOCS3 的活化對(duì)于介導(dǎo)IL-10的抗炎反應(yīng)有重要的作用［36］。雖然Jak-STAT通路在介導(dǎo)lL-10的免疫條件作用時(shí)發(fā)揮重要的作用，但也存在其他的信號(hào)通路參與了IL-10介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

IL-10作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子被認(rèn)為與EAE和MS有關(guān)［37］。在EAE和MS癥狀緩解期發(fā)現(xiàn)IL-10的擴(kuò)增［38］，在EAE和MS復(fù)發(fā)之前，可以發(fā)現(xiàn)IL-10水平下調(diào)［39］。提示內(nèi)源性IL-10調(diào)節(jié)疾病的復(fù)發(fā)與緩解。有數(shù)據(jù)表明，外源性IL-10治療能減少繼發(fā)進(jìn)展型(Secondary progressive MS，SPMS)的發(fā)病幾率［40］。此外，IFN-β治療成功的 MS患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-10水平的升高，這也揭示了IL-10對(duì)MS具有保護(hù)作用［41］。研究認(rèn)為，IL-10在治療慢性CNS炎癥中具有潛在的治療效果［42］。對(duì)于直接給EAE模型IL-10治療結(jié)果不盡相同，Cannella等［43］認(rèn)為直接靜脈注射IL-10會(huì)導(dǎo)致EAE癥狀加重，而非減輕。相反，有些實(shí)驗(yàn)給予IL-10治療則能明顯減輕CNS炎癥，如每日小鼠顱內(nèi)注射IL-10明顯抑制EAE發(fā)病，但這種保護(hù)作用在停止顱內(nèi)注射時(shí)很快消失，這提示抑制疾病必須要持續(xù)IL-10治療［44］。對(duì)炎癥性的脊髓進(jìn)行 IL-10處理后，RT-PCR顯示，IL-3、IL-5、TNF等多種促炎因子的條帶消失，證實(shí)IL-10可能參與了抑制炎癥反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)［45］。盡管IL-10能促進(jìn)人和小鼠T細(xì)胞產(chǎn)生IL-9，但是阻斷IL-10受體卻不能阻斷這些細(xì)胞分泌IL-9［28］。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將IL-9+IL-10+T細(xì)胞輸入RAG-1缺乏的小鼠體內(nèi)，可誘導(dǎo)腸炎的發(fā)生;若將這群細(xì)胞和CD4+CD45RBhi的效應(yīng)T細(xì)胞一起轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，不僅不能阻止疾病的發(fā)展，反而會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生外周神經(jīng)炎，這就說(shuō)明了IL-9+IL-10+T細(xì)胞不但不能抑制炎癥發(fā)生，反而能夠促進(jìn)炎癥的發(fā)展，至于是IL-9或IL-10，還是兩者均參與誘導(dǎo)組織炎癥尚不清楚［1］。

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