啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定及田間防效

張 亞 劉 青 劉雙清 廖曉蘭，3*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128；3湖南省生物農(nóng)藥與農(nóng)藥制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

草莓灰霉病是危害草莓生產(chǎn)的重要病害，每年由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)10%～30%，有的甚至高達(dá)89%（Ugolini et al.，2014）。該病的寄主范圍廣泛，不僅可以侵染草莓，而且還可侵染番茄、黃瓜、辣椒、葡萄等多種植物（Williamson et al.，2007；Zhang et al.，2014）。生產(chǎn)上防控草莓灰霉病的方法主要包括農(nóng)業(yè)防治（清除病殘?bào)w、調(diào)控溫濕度、通風(fēng)透光、紫外照射）、生物防治（以菌制菌）、化學(xué)防治（利用合成農(nóng)藥）等，其中化學(xué)防治具有見(jiàn)效快、節(jié)約成本等優(yōu)勢(shì)，一直是控制草莓灰霉病的重要方法（Rosslenbroich & Stuebler，2000；Huang et al.，2012；吉沐祥 等，2013；Shao et al.，2015；Aqueveque et al.，2016；Janisiewicz et al.，2016）。目前防治草莓灰霉病的化學(xué)藥劑主要有多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺等，但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑不僅污染土壤，破壞生態(tài)平衡，造成農(nóng)藥殘留，而且容易使病菌產(chǎn)生抗藥性（Hunter et al.，1987；Yourman & Jeffers，1999；Dianez et al.，2002）。研究表明，草莓灰霉病菌對(duì)多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威、嘧霉胺等藥劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，因此迫切需要通過(guò)復(fù)配技術(shù)降低草莓灰霉病菌的抗藥性，延緩藥劑的使用壽命（周明國(guó)等，1990；韓巨才 等，2004；陳莉 等，2007；禮茜 等，2007；陳仁 等，2015）。

啶酰菌胺是一種線粒體呼吸抑制劑，通過(guò)抑制線粒體電子傳遞鏈上琥珀酸輔酶Q還原酶活性達(dá)到控制病菌菌絲生長(zhǎng)的作用，其作用機(jī)理與其他酰胺類和苯甲酰胺類殺菌劑類似（顏范勇 等，2008；馮小龍，2016）?？┚嫱ㄟ^(guò)抑制葡萄糖磷?；嘘P(guān)的轉(zhuǎn)移酶，最終導(dǎo)致病菌死亡，其作用機(jī)理獨(dú)特，與現(xiàn)有殺菌劑無(wú)交互抗性（楊玉柱和焦必寧，2007）。這兩種藥劑都是生產(chǎn)上常用于防治草莓灰霉病的化學(xué)藥劑，本試驗(yàn)擬通過(guò)復(fù)配技術(shù)篩選出對(duì)草莓灰霉病菌具有增效作用的復(fù)合物，并進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，旨在為今后防控草莓灰霉病提供用藥依據(jù)。

1 材料與方法

室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效評(píng)價(jià)于2016～2017年分別在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物農(nóng)藥工程中心和衡陽(yáng)市衡東縣新塘鎮(zhèn)草莓種植示范基地進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與藥劑

供試菌株為草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物農(nóng)藥課題組從發(fā)病的草莓病果上分離獲得純種菌株（劉雙清 等，2016）。

供試藥劑為98.51%啶酰菌胺原藥，購(gòu)自上海秦巴化工股份有限責(zé)任公司；98%咯菌腈原藥，購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；50%啶酰菌胺可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.60 mg·mL-1），購(gòu)自巴斯夫（中國(guó)）有限公司；50%咯菌腈可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.05 mg·mL-1），購(gòu)自先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司；50%腐霉利可濕性粉劑（推薦用藥濃度為0.80 mg·mL-1），購(gòu)自海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；乙醇、丙酮、吐溫-80、葡萄糖、瓊脂、NaOH、HCl等化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

參考方中達(dá)（1998）的方法配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。

1.2 試驗(yàn)儀器

ME204E分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司），Eppendorf移液槍（艾本德中國(guó)有限公司），LDZX-30E滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），YJ-VS-2型超凈工作臺(tái)（無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司），MPJ-250型培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），電爐（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）以及量筒、玻璃棒、燒杯、三角瓶、直尺、鉛筆、標(biāo)簽紙、封口膜、挑針、容量瓶、接種針、打孔器、培養(yǎng)皿、菜刀、紗布等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 室內(nèi)毒力測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定藥劑對(duì)草莓灰霉病菌的抑制作用（凌金峰 等，2016）。取適量丙酮將啶酰菌胺和咯菌腈原藥溶解，制備成濃度為100 μg·mL-1的母液。將啶酰菌胺和咯菌腈分別按照 1∶1、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2：1、3∶2的質(zhì)量比配成混合液，無(wú)菌水稀釋，并加入適量吐溫-80使藥劑均勻分布于水相中，將藥液與培養(yǎng)基按1∶9的體積比配制成最終含藥量為 0.001、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1的含藥平板，同時(shí)設(shè)無(wú)藥平板為對(duì)照。用打孔器在預(yù)培養(yǎng)48 h的菌落邊緣打取菌餅，正面朝下接種到含藥平板上，每處理3次重復(fù)，置于20 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑。計(jì)算各處理濃度的抑制率，并采用DPS6.55軟件的專業(yè)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行生物測(cè)定分析，明確啶酰菌胺、咯菌腈及其復(fù)配物的毒力回歸方程，EC50值和相關(guān)系數(shù)。試驗(yàn)共進(jìn)行2次。采用Wadley法進(jìn)行增效作用評(píng)價(jià)（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，2006）。當(dāng)增效系數(shù)SR＞1.5為增效作用；0.5≤SR≤1.5為相加作用；SR＜0.5為拮抗作用。

式中：A、B分別代表兩種藥劑，a、b分別代表兩種藥劑在混劑中所占比例，ob為實(shí)際觀察值，th為理論值。

1.3.2 田間藥效試驗(yàn) 田間試驗(yàn)在湖南省衡陽(yáng)市衡東縣新塘鎮(zhèn)草莓基地進(jìn)行，選擇草莓灰霉病歷年發(fā)生均勻且發(fā)病較重的大棚，草莓品種為紅顏，株距30～38 cm，土壤肥力中等，草莓長(zhǎng)勢(shì)均勻一致。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，50%啶酰菌胺可濕性粉劑（T1）、50%咯菌腈可濕性粉劑（T2）、50%啶酰菌胺可濕性粉劑和50%咯菌腈可濕性粉劑復(fù)配物（質(zhì)量比為3∶1，該比例對(duì)草莓灰霉病菌的增效作用最明顯）（T3），以50%腐霉利可濕性粉劑為藥劑對(duì)照（CK1），清水作為空白對(duì)照（CK0）。每處理3次重復(fù)，共15小區(qū)，采用完全隨機(jī)排列，小區(qū)面積10 m2。采用輝騰3WBS-20A型背負(fù)式手動(dòng)噴霧器均勻噴施藥劑，每小區(qū)施藥液750 mL左右。草莓普遍開(kāi)花結(jié)果初期，病害發(fā)生前施藥3次，每次間隔7 d，并于第3次施藥后7～10 d，根據(jù)草莓灰霉病田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查復(fù)配物對(duì)草莓的藥害情況、病果率，計(jì)算防治效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件進(jìn)行初步處理，采用DPS6.55軟件的專業(yè)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)室內(nèi)毒力數(shù)據(jù)進(jìn)行生物測(cè)定分析，獲得藥劑的EC50、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)；采用DPS6.55軟件的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)田間防效數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素完全隨機(jī)方差分析，明確不同藥劑處理之間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 啶酰菌胺與咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌的抑制作用

由表1可知，啶酰菌胺和咯菌腈均對(duì)草莓灰霉病菌具有抑制作用，其中咯菌腈的毒力高于啶酰菌胺，其抑制中濃度遠(yuǎn)低于啶酰菌胺。當(dāng)咯菌腈的含量≥啶酰菌胺時(shí)，其在復(fù)配物中所占的比例越高，增效系數(shù)越低：當(dāng)啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配比例為1∶1時(shí)，表現(xiàn)增效作用；當(dāng)啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配比例為1∶3、1∶4、1∶5時(shí)，均表現(xiàn)相加作用。當(dāng)啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配比例為3∶2、2：1、3∶1、5∶1時(shí)均表現(xiàn)增效作用，但比例為4∶1時(shí)則表現(xiàn)相加作用，這可能跟菌株在培養(yǎng)箱中放置的位置有關(guān)。3∶1復(fù)配的增效系數(shù)為4.47，增效作用最明顯。

2.2 啶酰菌胺與咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的田間防治效果

由表2可知，啶酰菌胺和咯菌腈按照質(zhì)量比3∶1復(fù)配（T3）可以顯著降低草莓灰霉病的發(fā)病率，對(duì)草莓灰霉病具有較好的控制效果，兩年防效均達(dá)70%以上，顯著高于腐霉利的藥劑對(duì)照。經(jīng)過(guò)田間觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是復(fù)配物還是單劑均未對(duì)草莓正常生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。

表1 啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的室內(nèi)毒力測(cè)定

表2 啶酰菌胺與咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的防治效果

3 結(jié)論與討論

草莓灰霉病菌適合度高、變異大、繁殖速度快，是高抗風(fēng)險(xiǎn)的病原物，已對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性（陳治芳 等，2010）。將作用機(jī)理不同的農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配對(duì)延緩草莓灰霉病菌抗藥性具有重要意義。本試驗(yàn)首次將啶酰菌胺和咯菌腈兩種作用機(jī)理不同的藥劑進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果表明啶酰菌胺和咯菌腈以質(zhì)量比3∶1復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌的增效作用最明顯，這個(gè)結(jié)果不僅有助于延長(zhǎng)兩種藥劑的使用壽命，而且豐富了防治草莓灰霉病的新藥劑。啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配時(shí)，咯菌腈的量與增效系數(shù)呈反比，但啶酰菌胺的量與增效系數(shù)無(wú)明顯規(guī)律，與趙建江等（2016）的研究結(jié)果一致。這一現(xiàn)象可能與Wadley計(jì)算方法有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論啶酰菌胺和咯菌腈如何復(fù)配，其對(duì)草莓灰霉病菌都具有相加作用或增效作用，說(shuō)明二者復(fù)配協(xié)同效果較好，具有開(kāi)發(fā)潛力，可進(jìn)一步研制劑型，創(chuàng)制新的農(nóng)藥品種。

本試驗(yàn)僅研究了啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配物對(duì)草莓灰霉病菌的防治效果，而這兩種藥劑對(duì)其他病原菌，如疫霉病菌、炭疽病菌、紋枯病菌、黃萎病菌等是否也具有增效作用，值得進(jìn)一步研究。目前，復(fù)配物的增效機(jī)理普遍認(rèn)為是一種藥劑干擾了病原菌對(duì)另一種藥劑的解毒和代謝作用（畢秋艷和馬志強(qiáng)，2010）。本試驗(yàn)暫未考察啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配物的增效機(jī)理，究竟是啶酰菌胺還是咯菌腈首先發(fā)揮作用，或是兩者是否同時(shí)發(fā)揮作用等，也有待今后研究。

一種農(nóng)藥能否用于生產(chǎn)，必須要進(jìn)行室內(nèi)生物活性測(cè)試和田間試驗(yàn)。本試驗(yàn)兩年的田間試驗(yàn)結(jié)果表明：啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的最佳防效可達(dá)74.40%，優(yōu)于單一施用的效果。研究表明，復(fù)配物暗羅-丁子香酚對(duì)草莓灰霉病的田間防效為73.91%（吉沐祥 等，2009）；施用腐霉利7 d對(duì)草莓灰霉病的防效為68.05%（張頌函 等，2015）；復(fù)配物氟菌-肟菌酯對(duì)草莓灰霉病的防效低于70%（武雯 等，2015）。本試驗(yàn)復(fù)配藥劑的防效高于前人的研究結(jié)果。此外，啶酰菌胺和咯菌腈兩種藥劑已有成熟的合成技術(shù)，原材料獲得方便，價(jià)格適中，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省勞力等，為今后的復(fù)配研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。綜合以上幾點(diǎn)，啶酰菌胺和咯菌腈復(fù)配具有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的潛力，未來(lái)可以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

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