三紅蜜柚體細胞胚胎的誘導(dǎo)

林亮亮

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福清 350119)

琯溪三紅蜜柚系蕓香科柑橘屬柚類優(yōu)良品種之一，是福建省平和縣地方傳統(tǒng)名果琯溪蜜柚的芽變株中最新選育的優(yōu)良品種，2012年獲得福建省品種審定委員會認證推廣。三紅蜜柚果肉紅艷，晶瑩透亮，果皮海綿層呈粉色，外果皮黃里透紅，深受消費者喜愛，其柚果果型倒卵圓形，汁胞紅色，富含番茄紅素和β-胡蘿卜素，果汁豐實，甜酸適口，品質(zhì)極佳，比普通品種琯溪蜜柚、紅肉蜜柚早熟10～15 d，且皮薄少籽，柚果可食率高達70%，有良好的發(fā)展前景與市場競爭力[1]。目前，三紅蜜柚主要采用嫁接和實生苗等繁殖方法，生產(chǎn)季節(jié)性強，對操作技術(shù)要求較高，限制了優(yōu)良新品種的迅速推廣。

近年來，關(guān)于果樹體細胞胚胎再生體系的研究越來越多，并已在蘋果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝等樹種上成功獲得體細胞胚胎[2]。植物體細胞胚胎的發(fā)生、發(fā)育與合子胚相似，是離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的有效途徑之一[3]。胚狀體的培養(yǎng)材料可采用植物的各種器官、組織做為外植體進行培養(yǎng)，甚至在懸浮細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中都有可能形成體細胞胚胎，在取材方面比較方便多樣；同時，胚狀體的培養(yǎng)能將植物的無性繁殖從田間移至室內(nèi)，縮短植物繁殖時間，使育苗工廠化，從而避免傳統(tǒng)繁殖方式受生產(chǎn)季節(jié)及技術(shù)等瓶頸的影響。因此，運用細胞工程中的體細胞胚胎培養(yǎng)技術(shù)進行植物組培快繁，可在較短時間內(nèi)獲得基因型統(tǒng)一、表現(xiàn)型優(yōu)良的一致性群體，能夠周年生產(chǎn)不受季節(jié)與地理位置的限制，在快速繁殖苗木、制作人工種子及基因工程研究等方面具有較大應(yīng)用潛力。

本研究采用三紅蜜柚無菌苗中的莖段為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成，進一步分化形成體細胞胚胎，探討不同培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑對誘導(dǎo)三紅蜜柚胚性愈傷組織以及體細胞胚胎形成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，逐步建立起三紅蜜柚體細胞胚胎發(fā)生途徑的組培快繁技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自福清市惠煌農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司三紅蜜柚綠色生產(chǎn)基地，并由福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培中心利用三紅蜜柚種胚培育出的無菌苗，經(jīng)增殖形成的叢生苗中選取。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

試驗采用株高4～5 cm，帶4～6片真葉的三紅蜜柚無菌苗為材料，因為材料本身無菌，無需再進行消毒處理，直接在超凈工作臺上將其莖段截成長0.5～1 cm的小段，每段帶1～2個莖節(jié)，作為誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生的外植體。

1.2.2 培養(yǎng)條件

試驗采用MS、B5和改良WPM為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同培養(yǎng)階段添加不同濃度與配比的植物生長調(diào)節(jié)劑(2，4-D、6-BA和NAA)，所有培養(yǎng)基添加瓊脂7 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值5.6，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻凝固后使用，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，胚性愈傷組織誘導(dǎo)的光照強度為500～1 000 lx，胚狀體萌發(fā)的光照強度為1 000～1 500 lx，壯苗與生根培養(yǎng)的光照強度為1 500～2 000 lx，光照時間12 h·d-1。

1.2.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

試驗采用正交設(shè)計L9(34)，研究基本培養(yǎng)基(MS、B5、改良WPM)與植物生長調(diào)節(jié)劑2，4-D(0.5、1、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1) 對三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。將莖段接種到不同培養(yǎng)基上，每處理接種30瓶，每瓶接1個莖段，重復(fù)3次。

1.2.4 胚狀體的誘導(dǎo)

試驗采用正交設(shè)計L9(34)，研究基本培養(yǎng)基(MS、B5、改良WPM)與植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.1、0.5 mg·L-1)對三紅蜜柚胚狀體發(fā)生率的影響。從誘導(dǎo)培養(yǎng)的三紅蜜柚胚性愈傷組織中選取出淡黃色、顆粒狀較明顯的愈傷組織塊，接種到不同的體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每處理接種10瓶，每瓶接3塊，重復(fù)3次。

1.2.5 芽增殖

當三紅蜜柚胚狀體上萌發(fā)出的小苗長度達到2～3 cm時，將其從基部切下，接種于MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中進行莖芽增殖，培養(yǎng)30 d左右，選取生長健壯的小苗進行生根培養(yǎng)。

1.2.6 生根及移栽

選取生長健壯的無根小苗移到1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，將生長健壯、具有7片以上真葉的生根苗逐步過渡到自然環(huán)境條件下進行栽培。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)；

胚狀體誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)[4]。

正交試驗結(jié)果采用DPS軟件的正交試驗方差分析，方差分析的差異顯著性用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行平均數(shù)的多重比較[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三紅蜜柚體細胞胚胎誘導(dǎo)、分化與植株再生

試驗從已建立的三紅蜜柚組培快繁體系中獲得的無菌苗莖段為外植體，豎直接種在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基上，30 d后莖段上端的切口處以及與培養(yǎng)基接觸的莖段基部逐步出現(xiàn)淡黃色、顆粒感較強的愈傷組織團塊，將其轉(zhuǎn)移到體細胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25 d后這種淡黃色的愈傷組織能進一步形成胚狀體并萌發(fā)產(chǎn)生不定芽，通過繼代培養(yǎng)生成三紅蜜柚小苗。

2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑配比對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

三紅蜜柚無菌苗中獲得莖段作為外植體，經(jīng)過胚性愈傷組織培養(yǎng)基的誘導(dǎo)，莖段細胞分裂形成胚性愈傷組織，并不斷增殖，30 d后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。由表1可知，通過對各處理因子不同水平的SSR檢驗，基本培養(yǎng)基對三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達到極顯著水平，MS、B5、改良WPM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率均值分別為48.2%、19.3%、4.8%，誘導(dǎo)效果以MS培養(yǎng)基為最好；植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D、6-BA不同水平對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，2,4-D濃度1.0和1.5 mg·L-1的誘導(dǎo)率均值分別為31.9%和11.9%，期間極差達20.0百分點；6-BA濃度0.5和1.0 mg·L-1的誘導(dǎo)率均值分別為29.6%和15.2%，其間極差達14.4百分點，均達到極顯著水平。因此，三紅蜜柚莖段胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組合為MS+2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1。

2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑配比對胚狀體發(fā)生的影響

將誘導(dǎo)出的三紅蜜柚胚性愈傷組織細胞團接種到體細胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以檢測愈傷組織的體胚發(fā)生能力[6]。

不同基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA)配比對胚狀體分化的影響見表2。通過對各處理因子不同水平的SSR檢驗，基本培養(yǎng)基對胚狀體分化率的影響達到極顯著水平，以MS為最好，分化率均值達43.3%。在胚狀體分化期間，不同培養(yǎng)基添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比表現(xiàn)不同，NAA不同水平對胚狀體發(fā)生均表現(xiàn)有抑制作用，并隨著NAA濃度增強，達到極顯著水平；6-BA對胚狀體的發(fā)生產(chǎn)生一定影響，6-BA為0.1，1.0 mg·L-1的發(fā)生率均值分別為37.0%和14.5%，其間極差達22.4百分點，達到極顯著水平。試驗結(jié)果還表明，添加0.1～0.5 mg·L-1的6-BA對胚狀體發(fā)生有促進作用。因此，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg·L-1。

表1 不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果

表2 不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對胚狀體的誘導(dǎo)效果及SSR檢驗

3 小結(jié)與討論

試驗針對三紅蜜柚體細胞胚胎誘導(dǎo)中的突出問題，以篩選適宜誘導(dǎo)三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的培養(yǎng)基為目的，把優(yōu)化激素種類配比和濃度做為研究重點。試驗采用前期培養(yǎng)的三紅蜜柚無菌苗莖段為外植體，運用正交試驗設(shè)計的研究手段，充分發(fā)揮其篩選最佳試驗處理組合的捷徑功能，達到優(yōu)化培養(yǎng)基配方的目的。

已有研究表明，不同果樹種類對基本培養(yǎng)基的選擇也有物種特異性，必須對不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果進行對比，篩選出適合誘導(dǎo)三紅蜜柚的體細胞胚胎生長的培養(yǎng)基，并進一步獲得最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成。選用3種具有一定代表性的MS、B5和改良WPM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)表明，MS的誘導(dǎo)效果最佳，B5次之，改良WPM最差，對這3種培養(yǎng)基的成分進行分析，三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的誘導(dǎo)及生長狀況與培養(yǎng)基中銨態(tài)氮及充足的鐵離子供給有關(guān)。

甜橙馴化愈傷組織生長素對胚胎發(fā)生了重要作用[7]。Rao等[8]研究結(jié)果也表明2，4-D對體細胞胚胎的發(fā)生起促進作用。本試驗結(jié)果表明，添加2，4-D 1.0 mg·L-1及6-BA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性愈傷組織的效率最高，該類愈傷組織呈淡黃色，結(jié)構(gòu)緊實顆粒感強，而2，4-D濃度過高則會起到抑制作用，且易造成培養(yǎng)物褐變。在三紅蜜柚胚狀體誘導(dǎo)過程中，隨著NAA濃度升高胚狀體的發(fā)生率逐步降低，采用不添加NAA而單獨添加6-BA 0.1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生率最高。

試驗運用細胞工程中體細胞胚胎培養(yǎng)技術(shù)進行三紅蜜柚體細胞胚胎誘導(dǎo)，建立三紅蜜柚優(yōu)良單株的體細胞胚胎再生體系，為三紅蜜柚優(yōu)良新群體的擴繁與今后的基因工程研究奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)中還可進一步對體細胞胚胎發(fā)生的分子機理及生理生化機制進行研究，把促進體細胞胚胎發(fā)生的研究成果在實際生產(chǎn)中進行應(yīng)用。

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