響應面法優(yōu)化桂皮膠的提取工藝

寇瑩瑩,仝其根,2,*

(1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院,北京 102206;2.食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京 102206)

桂皮(Cinnamon)為樟樹科(Lauraceae)樟屬植物肉桂、天竺桂或川桂等樹皮經(jīng)烘干等一系列前處理而成,具有特殊香氣,在食品加工和醫(yī)藥方面都有很高的利用價值[1-3]。作為最常用的香辛料之一,桂皮主要用于烹調(diào)肉類制品,也用于腌漬、發(fā)酵及烘焙。隨著人們對桂皮利用價值的認識,關于桂皮提取成分的研究及應用越來越廣泛[4]。近年來國內(nèi)外關于桂皮油的研究主要集中在對其成分以及其抗菌抗炎作用機理的研究[5-7]。國外有研究顯示從桂樹胚乳中提取出桂皮膠,并在80年代對其膠毒理學進行了相關研究[8-9]。而從桂皮中提取桂皮膠的提取工藝研究在國內(nèi)及國外都尚未有報道,仝其根[10]提出了一種桂皮提取物的提取方法,通過有機溶劑浸提、加水進行高溫高壓處理等方法將桂皮中所有有用物質(zhì)進行分離,分離后的最終產(chǎn)物有桂皮油、桂皮鞣質(zhì)、桂皮色素、桂皮膠四大產(chǎn)品,提高了桂皮的利用率。用此方法提取的桂皮膠在水中溶解度良好,可以形成粘稠的液體,加熱則形成膠狀液體,這些特點與化學添加劑聚丙烯酸鈉性質(zhì)相似[11],且較化學添加劑來說更加安全無害,使得其在食品加工領域有著很大的發(fā)展前景,可用于替代其它增稠劑在生濕面制品、肉類等食品加工中的作用[12-14],或與其它食用膠混合制成復合膠,增強其粘度和在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性。

本實驗采用上述方法,以經(jīng)過去脂脫色的桂皮粉為原料,以水為提取介質(zhì)對高溫高壓提取桂皮膠的工藝條件進行優(yōu)化。通過響應面分析法分析影響桂皮膠提取量的四個主要因素(pH、料液比、提取溫度,提取時間)及其交互作用,確定最優(yōu)工藝參數(shù),實現(xiàn)優(yōu)化桂皮膠提取量的目的。從生產(chǎn)角度出發(fā),可以有效利用原材料,增加桂皮的綜合加工產(chǎn)品種類,也為下一步膠的純化及應用功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂皮 從產(chǎn)地廣西直接采購;無水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、鹽酸、硫酸、苯酚試劑 分析純,北京化工廠;HF131198透析袋CE膜 美國光譜醫(yī)學。

FW135中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;QM-WX04臥式行星球磨機 南京大學儀器廠;DL-101電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;JJ100型精密電子天平 常熟雙杰測試儀器廠;SoxtecTM2045索氏提取系統(tǒng) 福斯中國有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;S2Z-3型循環(huán)水式多用真空泵 海知信實驗儀器技術有限公司;PHS-3E pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;3H20RI智能臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;LGJ-18冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;KQ-B玻璃儀器氣流烘干器 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;T6紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桂皮前處理 將桂皮清洗、在通風干燥處自然陰干后切片,用中藥粉碎機粉碎后過40目篩。稱取適量桂皮粉末置于索氏抽提系統(tǒng)的浸提紙筒中,按1∶20 (g/mL)料液比在提取杯中加入石油醚,70 ℃下浸提2 h。收集溶劑,將桂皮粉末置于40 ℃鼓風干燥箱烘干至重量恒定[15]。將去脂桂皮粉末和85%乙醇溶液按1∶15 (g/mL)料液比置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的燒瓶中,在40 ℃條件下水浴浸提1 h,抽濾,收集濾液,重復此步驟三次,濾渣放置在40 ℃干燥箱烘干后,得到去除油脂、鞣質(zhì)及色素的桂皮粉末[16]。

1.2.2 高溫高壓處理提取桂皮膠 將經(jīng)過1.2.1處理的桂皮粉末放入臥式行星球磨機中再次研磨,將其分別過60～140目篩的桂皮粉末,準確稱取適量桂皮粉末置于錐形瓶中,按一定料液比加入去離子水攪拌均勻,調(diào)節(jié)不同的pH,放入壓力蒸汽滅菌器,通過控制壓力蒸汽滅菌器的工作溫度和時間來實現(xiàn)桂皮膠的提取。待混合溶液溫度降至室溫,在5000 r/min的條件下離心15 min,收集上清液放入經(jīng)過預處理的透析袋(3.5～5 kDa)中,處理24 h。將所得桂皮膠混合液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到粘稠的糖漿狀流體,冷凍干燥72～96 h,得到恒重的淺紅棕色片狀桂皮膠粗品。

1.2.3 桂皮膠提取量的測定 將冷凍干燥得到的桂皮膠粗品準確稱重,提取量按下式計算:

桂皮膠提取量(mg/g)=桂皮膠粗品的質(zhì)量(mg)/原料質(zhì)量(g)

1.2.4 桂皮膠提取的單因素實驗

1.2.4.1 粉碎粒度對桂皮膠提取量的影響 準確稱取5份桂皮粉末,分別過60、80、100、120、140目篩,固定料液比1∶40 (g/mL)加入去離子水,調(diào)混合液pH至5.0,120 ℃條件下高溫高壓提取30 min,計算提取量,考察不同粉碎粒度對桂皮膠提取量的影響。

1.2.4.2 液料比對桂皮膠提取量的影響 準確稱取5份粒度為100目的桂皮粉末,分別按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)加入去離子水,調(diào)節(jié)pH至5.0,120 ℃條件下高溫高壓提取30 min,然后按照1.2.2方法處理得到桂皮膠粗品,計算提取量,考察不同液料比對桂皮膠提取量的影響。

1.2.4.3 pH對桂皮膠提取量的影響 準確稱取5份粒度為100目的桂皮粉末,調(diào)節(jié)去離子水的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,固定料液比1∶40 (g/mL),120 ℃條件下高溫高壓提取30 min,然后按照1.2.2方法處理得到桂皮膠粗品,計算提取量,考察不同pH對桂皮膠提取量的影響。

1.2.4.4 提取溫度對桂皮膠提取量的影響 準確稱取5份粒度為100目的桂皮粉末,固定料液比1∶40 (g/mL),調(diào)節(jié)pH至5.0,設置壓力蒸汽滅菌器溫度分別為90、100、110、120、130 ℃下,高溫高壓提取30 min,然后按照1.2.2方法處理得到桂皮膠粗品,計算提取量,考察不同提取溫度對桂皮膠提取量的影響。

1.2.4.5 提取時間對桂皮膠提取量的影響 準確稱取5份粒度為100目的桂皮粉末,固定料液比1∶40 (g/mL),調(diào)節(jié)pH至5.0,設置溫度為120 ℃,分別提取10、20、30、40、50 h,然后按照1.2.2方法處理得到桂皮膠粗品,計算提取量,考察不同提取時間對桂皮膠提取量的影響。

1.2.5 響應面優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理建立四因素三水平的模型,利用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進行擬合、優(yōu)化桂皮膠提取量的工藝條件。根據(jù)單因素實驗結果,綜合考慮各因素對高溫高壓浸提法得到桂皮膠提取量的影響,選取以pH(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)為自變量,自變量的實驗水平以-1、0、1作為編碼值,設計29組實驗點,其中24組為析因點,5組為區(qū)域的中心零點,用于估計實驗誤差,實驗設計方案見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平Table 1 Factor and levels used in response surface experiment

1.2.6 桂皮膠提取物中總糖含量測定

1.2.6.1 葡萄糖標準溶液的配制 取葡萄糖標準品于105 ℃恒溫烘干至恒重,精確稱取0.100 g葡萄糖于100 mL燒杯中,加水溶解,定容至1000 mL,置于4 ℃冰箱中貯存,得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.2.6.2 苯酚溶液的配制 稱取80 g經(jīng)過重蒸餾的苯酚于100 mL燒杯中,加水溶解,轉(zhuǎn)至100 mL棕色容量瓶中定容,置于4 ℃冰箱中避光保存,得到80%苯酚溶液。吸取5 mL 80%苯酚溶液溶于75 mL水中混勻,得到5%的苯酚溶液,5%苯酚溶液使用前現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.6.3 標準曲線的繪制 分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL的葡萄糖標準溶液置于20 mL具塞試管中,用蒸餾水補至1.0 mL,向試液中加入1.0 mL 5%的苯酚溶液,然后快速加入5.0 mL硫酸,靜置10 min,使用旋渦振蕩器使反應液充分混合,然后將試管放置于30 ℃水浴中反應20 min,于490 nm處測吸光度,以葡萄糖濃度(C,mg/mL)為橫坐標,以吸收度(A)為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.6.4 桂皮膠總糖含量測定 準確稱量凍干后得到的桂皮膠樣品0.010 g定容于100 mL容量瓶,取1 mL置于20 mL具塞試管,試液中加入1.0 mL 5%的苯酚溶液,然后快速加入5.0 mL硫酸,靜置10 min,使用旋渦振蕩器使反應液充分混合,然后將試管放置于30 ℃水浴中反應20 min,于490 nm處測吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗所得數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次重復實驗求得的平均值,單因素實驗結果利用Microsoft Excel和Spass Statiatics 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,采用兩兩比較的單因素方差分析法得出顯著性影響,用p值表示,p<0.05表示具有顯著性差異,p<0.01表示具有極顯著性差異,用Origin7.5軟件繪制趨勢曲線圖,響應面實驗采用Design-Expert8.0.6軟件進行擬合分析,并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 粉碎粒度對桂皮膠提取量的影響 如圖1所示,不同粒度的桂皮粉末對桂皮膠的提取量有顯著性影響(p<0.05),在其他提取條件一定時,桂皮膠提取量隨桂皮粉過篩目數(shù)的增大而增大,樣品粉碎后有助于提高提取量。當粒度在60～100目范圍內(nèi),隨著目數(shù)的增加,桂皮膠提取量呈明顯上升趨勢,說明在一定范圍內(nèi),顆粒越小,原料的比表面積越大,增加了桂皮粉與水的接觸面積,有利于膠更多的溶解到水中[17-18],其中100目時桂皮膠提取量最高,此時桂皮膠提取量為173.2 mg/g,當粒度大于100目時,提取效果不再發(fā)生明顯變化,并且考慮到若將原材料粉碎得過細,需要耗時較長,因此在后續(xù)利用響應面對實驗進行設計時不考慮顆粒粒度作為桂皮膠提取工藝的主要因素,一律采用粉碎粒度為100目的桂皮粉。

圖1 粉碎粒度對桂皮膠提取量的影響Fig.1 Effect of particle size on the extraction quantity of Cinnamon gum注：不同字母表示顯著性差異(p<0.05);圖2～圖5。

2.1.2 料液比對桂皮膠提取量的影響 如圖2所示,不同料液比對桂皮膠的提取量有顯著性影響(p<0.05),料液比在1∶10～1∶40 (g/mL)范圍內(nèi),隨著浸提溶劑和溶質(zhì)的比值增大,桂皮膠提取量呈明顯的上升趨勢,說明在一定范圍內(nèi)增加提取劑的使用量,可以提高固液兩相體系的質(zhì)量濃度梯度,有利于加快有效成分的擴散速率,提高桂皮膠提取量。當料液比超過1∶40 (g/mL)后,可能由于溶質(zhì)的濃度梯度減小到趨于零,提取量無明顯變化,雖然提取液中依然具有濃度差,但傳質(zhì)動力不再增加[22-23],桂皮膠溶出減緩,過多的提取劑不利于后期上清液的濃縮,不僅增加濃縮時間,也容易在長期濃縮過程中造成桂皮膠質(zhì)量的損失。在預實驗中發(fā)現(xiàn),桂皮膠的吸水性極強,料液比低于1∶30 (g/mL)時,桂皮粉末不能充分與提取劑混合,影響提取效果,結合圖2可知在1∶40 (g/mL)料液比條件下,桂皮膠提取量最高,達到174.8 mg/g,與料液比1∶30 (g/mL)(155.1 mg/g)的條件下提取的桂皮膠提取量具有顯著性差異(p<0.05),表明在料液比1∶40 (g/mL)的條件下桂皮膠提取效果好。

圖2 料液比對桂皮膠提取量的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the extraction quantity of Cinnamon gum

2.1.3 pH對桂皮膠提取量的影響 如圖3所示,不同pH對桂皮膠的提取量有顯著性影響(p<0.05),在pH范圍在2.0～3.0時,桂皮膠的提取量較低,原因可能是pH過低時,桂皮膠在高溫酸性環(huán)境下不穩(wěn)定發(fā)生水解成分子量在3.0KD以下的單糖、多聚糖以及低分子質(zhì)量多糖等[19-21],后經(jīng)透析袋處理去除這些小分子物質(zhì),導致桂皮膠提取量較低,在pH為5.0的條件下,桂皮膠的提取量最大,達到180.0 mg/g,當pH高于5.0至接近中性時,提取量趨于穩(wěn)定,結合數(shù)據(jù)進行分析,選擇pH5.0為最佳提取條件。

圖3 pH對桂皮膠提取量的影響Fig.3 Effect of pH on the extraction quantity of Cinnamon gum

2.1.4 提取溫度對桂皮膠提取量的影響 如圖4所示,不同提取溫度對桂皮膠的提取量有顯著性影響(p<0.05),水提溫度在90～120 ℃范圍內(nèi),桂皮膠提取量隨著溫度的升高呈快速上升趨勢,當溫度超過120 ℃,桂皮膠提取量逐漸下降。預實驗中在100 ℃以內(nèi)水浴條件下對桂皮粉進行浸泡、攪拌無法達到理想的提取效果,桂皮膠不能同木質(zhì)素分離。經(jīng)高壓提取,桂皮膠能夠以膠體形式溶出,高溫條件降低了桂皮膠遇水溶脹后的粘稠狀態(tài)(利用旋轉(zhuǎn)粘度計測量,高溫提取后的桂皮膠提取液冷卻后的最大粘度值為115 mPa·s),也增加了桂皮膠在水中的溶解度,并且在將提取液濃縮冷卻至室溫后可以基本恢復桂皮膠的黏度,達到提取效果[24-25]。當溫度高于120 ℃時,持續(xù)高溫處理可能會使桂皮膠發(fā)生水解,從而導致提取量下降,因此選擇120 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對桂皮膠提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction quantity of Cinnamon gum

2.1.5 提取時間對桂皮膠提取量的影響 如圖5所示,不同提取時間對桂皮膠的提取量有顯著性影響(p<0.05)。本實驗中加壓升溫過程均控制在15 min內(nèi)完成,提取結束時待溫度降到100 ℃以下,放氣減壓,其中提取時間在10～30 min范圍內(nèi),桂皮膠提取量呈迅速上升趨勢,這是因為在一定料液比和溫度壓強的條件下,桂皮膠從木質(zhì)素中遷移到溶劑中需要一定時間才能達到溶出平衡,達到平衡后提取率的變化很小,其中高溫高壓處理時間為30 min時,桂皮膠提取量最高,此時桂皮膠提取量為175.9 mg/g,當提取時間大于30 min,桂皮膠提取量趨于平緩,因此,若提取時間太短,桂皮膠溶出會不充分,而提取時間過長會增大提取成本[25-26],綜合考慮,選擇30 min為最佳提取時間。

圖5 提取時間對桂皮膠提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction quantity of Cinnamon gum

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面實驗結果 根據(jù)單因素實驗結果,利用Design-Expert8.0.6軟件,設計的四因素三水平Box-Behnken中心組合實驗,實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計方案及實驗結果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 擬合模型顯著性檢驗結果Table 3 Analysis of variance for the regression equation

注:**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 擬合模型的建立和模型的顯著性分析 利用Design-Expert8.0.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合,建立桂皮膠提取量的多元二次回歸模型,分析自變量對于響應值的影響,得到桂皮膠提取量(Y)的多元二次回歸模型:

Y=185.48+3.63A+1.75B+5.04C+1.91D+0.18AB+0.90AC+0.13AD+4.62BC-2.90BD+0.30CD-6.26A2-4.96B2-6.95C2-4.60D2

2.2.3 響應面分析 通過Design Expert軟件對四個因素的交互作用進行分析,繪制6組響應面圖和等高線圖,響應面圖形是由響應值Y和影響因子A、B、C、D之間的關系構成的三維立體結構圖,根據(jù)二次線性回歸模型繪制出的圖像,直觀表示四個因素對桂皮中提取桂皮膠含量的交互作用。其中響應面坡度越陡峭,表示該因素對于其他因素的改變越敏感,對桂皮膠提取量的影響越大。等高線可以非常直觀地反映兩因素交互作用的顯著程度,其中橢圓形表示兩因素之間作用顯著,而接近圓形則表示不顯著。利用軟件做出的響應面圖如圖6～圖11所示,顯示四個變量中任取兩個變量為零水平時,其余兩個變量同時變化對桂皮膠提取量的影響。

圖6 pH和料液比對桂皮膠提取量的影響Fig.6 Effect of pH and solid to liquid ratio on the extraction quantity of Cinnamon gum

圖7 pH和提取溫度對桂皮膠提取量的影響Fig.7 Effect of pH and extraction temperature on the extraction quantity of Cinnamon gum

圖8 pH和提取時間對桂皮膠提取量的影響Fig.8 Effect of pH and extraction time on the extraction quantity of Cinnamon gum

圖9 料液比和提取溫度對桂皮膠提取量的影響Fig.9 Effect of solid to liquid ratio and extraction temperature on the extraction quantity of Cinnamon gum

圖10 料液比和提取時間對桂皮膠提取量的影響Fig.10 Effect of solid to liquid ratio and extraction time on the extraction quantity of Cinnamon gum

圖11 提取溫度和提取時間對桂皮膠提取量的影響Fig.11 Effect of extraction temperature and extraction time on the extraction quantity of Cinnamon gum

由圖9可以看出響應面的坡度較陡峭,等高線呈橢圓形,表明在pH=5.0,提取時間為30 min的條件下,料液比和提取溫度的交互作用顯著,隨著兩個自變量的增加,桂皮膠提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;圖10顯示的響應面的坡度較為陡峭,等高線呈橢圓形,表明在pH=5.0,提取溫度120 ℃的條件下,料液比和提取時間的交互作用顯著,在提取時間較短時,桂皮膠提取量隨料液比的升高而升高,隨著提取時間的延長,提取量趨于平緩甚至下降;觀察圖像得知,圖6～圖8、圖11四組的等高線圖均接近圓形,結合數(shù)據(jù)進行分析,pH與料液比、pH與提取溫度、pH與提取時間、提取溫度與提取時間四組因素之間的交互作用均不顯著。

2.2.4 模型的優(yōu)化及驗證實驗 使用Design-Expert8.0.6軟件,對多元二次回歸模型及響應面圖進行分析,得到的最佳提取條件是:pH為5.33,料液比為1∶43.94 (g/mL),提取溫度為125.19 ℃,提取時間為31.07 min,在此條件下,桂皮膠提取量的預測值為187.8 mg/g,考慮實際操作的可行性,將提取工藝條件修正為pH5.0,料液比為1∶44 (g/mL),提取溫度為125 ℃,提取時間為31 min,在此條件下進行三次平行驗證實驗,將修正后的條件帶入方程,得到桂皮膠的理論提取量為187.1219 mg/g,驗證實驗中測得的平均提取量為186.5 mg/g,與模型預測值接近,說明此模型可以很好地預測桂皮膠的提取條件和提取量之間的關系,也說明了提取條件參數(shù)的可行性。

2.3 桂皮膠提取物中總糖含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 按1.2.6.3中標準曲線制作方法繪制標準曲線見圖12,經(jīng)回歸處理得線性回歸方程:Y=4.25429X+0.00395,R2=0.9982。

圖12 葡萄糖標準曲線Fig.12 Standard curve of glucose

2.3.2 桂皮膠中總糖含量測定 按1.2.6.4中總糖測定方法處理桂皮膠樣品,于490 nm處測吸光度,同時進行五次重復,結果見表4。總糖平均含量為96.06%，RSD為1.59%。

表4 桂皮膠總糖含量測定結果Table 4 Determination of total sugar content of Cinnamon gum

表5 穩(wěn)定性實驗結果Table 5 Results of stability assay

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取0.1 mg/mL的桂皮膠溶液1.0 mL,按1.2.6.4中總糖測定方法每隔一段時間測一次吸光度,觀測其穩(wěn)定性,結果表明在顯色120 min時間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性良好,結果見表5。

2.3.4 精密度實驗 按1.2.6.4中總糖測定方法,吸取標準溶液(0.1 mg/mL)進行精密度實驗,連續(xù)進行6次測量吸光度,得RSD=1.82%,小于5%,表明本實驗精密度良好,具有可行性,結果見表6。

表6 精密度實驗結果Table 6 Results of precision assay

3 結論

本研究采用在高溫高壓條件下以水作為提取劑的新工藝提取桂皮中的桂皮膠,通過高壓條件改變膠體與木質(zhì)素的結合形式,使桂皮膠釋放出來,得到的桂皮膠粗品能夠溶解于水,并迅速膨脹形成粘稠、滑膩的狀態(tài),未來可作為一種很好的天然食品增稠劑替代化學添加劑用在生濕面制品、肉類等食品的加工[27]。實驗通過對桂皮膠的提取工藝進行研究,在單因素的實驗基礎上選擇提取條件中的主要影響因素,采用Box-Behnken響應面設計四因素三水平中心組合實驗,對桂皮膠提取工藝進行優(yōu)化,建立了多元二次回歸模型,能較好地預測桂皮膠的提取量,通過實驗與模型驗證,很好地證明了模型的可行性,并得到了桂皮膠的最佳提取工藝條件為pH5.0,料液比1∶44 (g/mL),提取溫度125 ℃,提取時間31 min,在此條件下桂皮膠的提取量達到186.5 mg/g。純化后的桂皮膠以苯酚-硫酸比色法測定總糖含量達到96.06%,測定結果穩(wěn)定。優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)具有可行性,為桂皮膠主要成分的進一步研究提供一定的理論依據(jù)。

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